技术领域
[0001] 本
发明属于显色剂技术领域，具体涉及一种血渍显色剂及其制备与使用方法。
背景技术
[0002] 血渍显色剂是一种用于显现血渍的
试剂，常用于公安系统刑侦过程中快速检测凶案现场的潜在血渍和血指纹，为快速还原案发现场提供依据。由于使用场景的特殊性，这种显示实际有以下基本要求，首先要求试剂在使用过程中操作简单可靠，其次要求试剂不会破坏血渍中残留的DNA。
[0003]
现有技术中的血渍显色剂，主要依赖于鲁米诺发光法、联苯胺显色法和酚酞显色法。鲁米诺发光法主要依靠发光原理，需在黑暗的场景下，将显色剂反复喷在血渍上，通过发出亮光来检测血渍，时间一长，
荧光便会退去。联苯胺显色法，依赖于联苯胺遇到些血渍会发出翠蓝色反应，但这种变色反应也可能由于其他物质导致，并非血渍所特有，如
接触到
铁锈、氯化铁一定会出现
假阳性。酚酞显色法与联苯胺显色法一样，也会存在假阳性的问题。
[0004] 有鉴于此，有必要开发一种能够快速显色、长时间不易褪色、且不易出现假阳性，不会破坏血渍中残留的DNA的血渍显色剂。
发明内容
[0005] 本发明为解决现有技术中血渍显色剂易褪色、易出现假阳性的技术问题，提供一种血渍显色剂及其制备与使用方法。
[0006] 本发明解决上述技术问题采取的技术方案如下。
[0007] 本发明提供一种血渍显色剂，由试剂A和试剂B组成；
[0008] 所述试剂A含有有机固体、保护剂和
水，有机固体经对羟基苯甲
醛与N-乙基-N-苄基苯胺按物质的量比1∶2缩聚反应后，磺化，盐析制备，有机固体的浓度为1-4wt％，保护剂的浓度为0.2-2wt％；
[0009] 所述试剂B含有双
氧水和水，双氧水的浓度为3-5wt％。
[0010] 优选的是，所述保护剂为
柠檬酸钠、
抗坏血酸、次
亚磷酸钠中的一种或几种的混合，每种保护剂的浓度为0.2-1wt％。
[0011] 本发明还提供上述血渍显色剂的制备方法：将试剂A和试剂B分装，得到血渍显色剂。
[0012] 优选的是，所述试剂A的制备方法为：
[0013] 步骤一、将对羟基
苯甲醛与N-乙基-N-苄基苯胺按照物质的量比1∶2溶于
溶剂中，在惰性气氛和/或还原性气体保护下，进行缩合反应，反应结束后，低温下
蒸发出溶剂，得到反应中间体；
[0014] 步骤二、在惰性气氛和/或还原性气体保护下，将步骤一得到的反应中间体与磺化物按化学计量比1∶(1.5～2)混合，进行磺化处理，得到磺化混合物；
[0016] 步骤三、调节步骤二得到的磺化混合物的pH至中性，惰性气氛保护下，盐析，得到有机固体；
[0017] 步骤四、将步骤三得到的有机固体溶于水中，加入保护剂，混合均匀，得到试剂A。
[0018] 更优选的是，所述步骤一中，溶剂为
乙醇。
[0019] 更优选的是，所述步骤一中，缩合反应的
温度为50-100℃，时间为2-20h。
[0020] 更优选的是，所述步骤一中，低温下蒸发采用的设备为
旋转蒸发仪。
[0021] 更优选的是，所述步骤一、步骤二和步骤三中，惰性气氛分别独立的为氮气、氩气、氦气中的一种或者几种的混合，还原性气体为氢气。
[0022] 更优选的是，所述步骤二中，磺化处理的温度为40-120℃，时间2-10h。
[0023] 更优选的是，所述步骤三中，采用氢氧化钠溶液或者氢氧化
钾溶液在5min内调节pH至中性。
[0024] 更优选的是，所述步骤三中，盐析采用的物质为硫酸钠、
硫酸钾、
氯化钠、
氯化钾中的一种或几种的混合物。
[0025] 本发明还提供上述血渍显色剂的使用方法：按体积比为(70-95)∶(30-5)将试剂A和试剂B混合，喷在血渍表面，等待1-20s，潜在的血渍会显示出
颜色。
[0026] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0027] 1、本发明提供的血渍显色剂，使用方便，遇到血渍会显示出特殊的蓝色，不易出现假阳性问题，且随着时间推移，蓝色会越来越深，不会褪色，整个过程中不会破坏血渍中的DNA。
[0028] 2、本发明提供的血渍显色剂，有机固体能够
吸附蛋白质，遇到血渍后，使血渍中的蛋白质固定，避免在鉴定血渍过程中，血渍发生扩散，因此可以对潜在的血指纹进行显示。
[0029] 3、本发明提供的血渍显色剂适用范围广，尤其适用于在任何场景下检测案发现场的潜在血渍。
附图说明
[0030] 为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对
实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
[0031] 图1为本发明实施例1的血渍显色剂在白布上显色血渍后一年后的效果图；
[0032] 图2为本发明实施例1的血渍显色剂在A4纸上显色血渍后一年后的效果图；
[0033] 图3为本发明实施例1的血渍显色剂在尼龙编织袋表面显色血渍后一年后的效果图；
[0034] 图4为本发明实施例1的血渍显色剂在轮胎表面显色血渍后一年后的效果图；
[0035] 图5为本发明实施例1的血渍显色剂在黑色
铜版纸表面显色血渍后一年的效果图；
[0036] 图6为本发明实施例1的血渍显色剂显色血指纹的效果图；
[0037] 图7为喷洒实施例1的血渍显色剂前白布上的血渍的DNA分型结果；
[0038] 图8为喷洒实施例1的血渍显色剂后白布上的血渍的DNA分型结果；
[0039] 图9中，a、b分别为实施例1的血渍显色剂喷在铁粉、氯化铁表面后的效果图；
[0040] 图10为本发明实施例2的血渍显色剂在白墙表面显色血渍后一年后的效果图。
具体实施方式
[0041] 为了进一步理解本发明，下面结合具体实施方式对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明
权利要求的限制。
[0042] 本发明的血渍显色剂，由试剂A和试剂B组成；
[0043] 其中，试剂A含有有机固体、保护剂和水，有机固体经对羟基苯甲醛与N-乙基-N-苄基苯胺按照物质的量比1∶2缩聚反应后，磺化，盐析制备；
[0044] 试剂B含有双氧水和水；
[0045] 试剂B作为还原性物质保护试剂A，避免其进一步氧化，延长了显色剂的保存时间。
[0046] 上述技术方案，试剂A中，有机固体的浓度为1-4wt％，优选为2-3wt％。
[0047] 上述技术方案中，保护剂优选为柠檬酸钠、抗坏血酸、次亚磷酸钠中的一种或几种的混合，试剂A中，保护剂的总浓度为0.2-2wt％，每种保护剂的浓度优选为0.2-1wt％。
[0048] 上述技术方案，试剂B中，双氧水的浓度为3-5wt％，优选为3-4wt％。
[0049] 本发明还提供上述血渍显色剂的制备方法：即将试剂A和试剂B分装，得到血渍显色剂。
[0050] 上述技术方案中，试剂A的制备方法为：
[0051] 步骤一、将对羟基苯甲醛与N-乙基-N-苄基苯胺按照物质的量比1∶2溶于溶剂中，在惰性气氛和/或还原性气体保护下，进行缩合反应，反应结束后，低温下蒸发出溶剂，得到反应中间体；
[0052] 步骤二、在惰性气氛和/或还原性气体保护下，将步骤一得到的反应中间体和磺化物按照化学计量比1∶(1.5～2)混合，进行磺化处理，得到磺化混合物；
[0053] 步骤三、调节步骤二得到的磺化混合物的pH至中性，惰性气氛保护下，盐析，得到有机固体；
[0054] 步骤四、将步骤三得到的有机固体溶于水中，加入保护剂，混合均匀，得到淡茶色液体，即为试剂A。
[0055] 上述技术方案，步骤一中，溶剂没有特殊限制，只要能够起到溶解作用，并能够通过低温蒸发除去的溶剂皆可，优选溶剂为乙醇。
[0056] 上述技术方案，步骤一中，缩合反应的温度优选为50-100℃，时间优选为2-20h，温度更优选为80-90℃，时间更优选为10-15h。
[0057] 上述技术方案，步骤一中，低温下蒸发采用的设备通常为旋转蒸发仪。
[0058] 上述技术方案，步骤一、步骤二和步骤三中，惰性气氛分别独立的为氮气、氩气、氦气中的一种或者几种的混合，还原性气体为氢气。使用惰性或者还原性气体保护，能够避免产物被氧化。
[0059] 上述技术方案，步骤二中，磺化物为发烟硫酸或者浓硫酸。
[0060] 上述技术方案，步骤二中，磺化处理的温度优选为40-120℃，时间优选为2-10h，温度更优选为80-100℃，时间更优选为4-5h。
[0061] 上述技术方案，步骤三中，优选采用氢氧化钠溶液或者氢氧化钾溶液调节pH至中性，调节过程一般在5min内完成。
[0062] 上述技术方案，步骤三中，盐析采用的物质优选为硫酸钠、硫酸钾、氯化钠、氯化钾中的一种或几种的混合物。
[0063] 本发明的血渍显色剂的使用方法：按将试剂A和试剂B混合，喷在血渍表面，等待1-20s，潜在的血渍会显示出蓝色，其中，试剂A和试剂B的体积比为(70-95)∶(30-5)，优选为(80-90)∶(20-10)。
[0064] 下面将结合附图和实施例对本发明进一步说明。以下实施例中所用试剂均为市售。
[0065] 实施例1
[0066] 将试剂A和试剂B分装，得到血渍显色剂；
[0067] 试剂A的制备方法为：
[0068] 步骤一、将对羟基苯甲醛与N-乙基-N-苄基苯胺按照物质的量比1∶2溶于乙醇中，在氮气保护下，80℃反应15h，反应结束后，用旋转蒸发仪低温下蒸发出乙醇，得到反应中间体；
[0069] 步骤二、在氮气保护下，将步骤一得到的反应中间体和发烟硫酸按照化学计量比1∶1.5混合，80℃反应5h，得到磺化混合物；
[0070] 步骤三、使用氢氧化钠溶液5min内调节步骤二得到的磺化混合物的pH至中性，氮气保护下，加入硫酸钠，盐析，得到有机固体；
[0071] 步骤四、将步骤三得到的有机固体溶于水中，配成浓度为2％的水溶液，加入1％柠檬酸钠、0.3％抗坏血酸和0.3％次亚磷酸钠，混合均匀，得到试剂A；
[0072] 试剂B为浓度为3％的双氧水溶液。
[0073] 对实施例1的血渍显色剂的显色效果进行检测：取90mL试剂A与10mL试剂B混合，分别喷在有潜在血渍的白布、A4纸、尼龙编织袋、轮胎和黑色铜版纸的表面，结果显示，在5s内可以将潜在的血渍显示出蓝色(即便在极低血液浓度下仍能显现，基本不受血渍与空气接触时间的影响)，且放置一年后，蓝色仍不退去，如图1～图5所示(图1中，C为对照组，表示没有血渍，比例1∶1、1∶2、1∶5、1∶10、1∶20、1∶100、1∶200、1∶1000分别表示血液稀释1、2、5、10、20、100、200、1000倍；图2中，C为对照组，表示没有血渍，第1行表示与空气接触30天的血渍，第2行表示与空气接触24h的血渍，第3行表示新鲜的血渍，比例1∶100、1∶200、1∶500、1∶
1000、1∶2000、1∶10000分别表示血液稀释100、200、500、1000、2000、10000倍)。取90mL试剂A与10mL试剂B混合，喷在有潜在血指纹(一半遮挡，一半喷洒血渍显色剂)的纸张的表面，结果显示，在5s内可以将潜在的血指纹显示出蓝色，且血指纹不发生扩散，纹理清晰，如图6所示。
[0074] 利用chelex-100方法，对上述实验中，喷洒实施例1的血渍显色剂前的白布上的血斑和喷洒实施例1的血渍显色剂后的白布上的血斑进行提取，用fusion
试剂盒检测分型，结果如图7和图8所示，从图7和图8可以看出，喷洒显色剂后的血斑的分型与未喷洒显色剂的血斑的分型没有显著差异，依然可以提取出完整的DNA。说明本发明的显色剂使用中不破坏DNA。
[0075] 对实施例1的血渍显色剂的显色效果进行检测：取90mL试剂A与10mL试剂B混合，分别喷在铁粉、氯化铁的表面，结果分别如图9中a、b所示，从图9可以看出，实施例1的血渍显色剂遇到铁粉、氯化铁均不会发生颜色变化，说明本发明的血渍显色剂不存在假阳性的问题。
[0076] 实施例2
[0077] 将试剂A和试剂B分装，得到血渍显色剂；
[0078] 试剂A的制备方法为：
[0079] 步骤一、将对羟基苯甲醛与N-乙基-N-苄基苯胺按照物质的量比1∶2溶于乙醇中，在氮气保护下，90℃反应10h，反应结束后，用旋转蒸发仪低温下蒸发出乙醇，得到反应中间体；
[0080] 步骤二、在氮气保护下，将步骤一得到的反应中间体和发烟硫酸按照化学计量比1∶1.5混合，100℃反应4h，得到磺化混合物；
[0081] 步骤三、使用氢氧化钠溶液在5min内调节步骤二得到的磺化混合物的pH至中性，氮气保护下，加入硫酸钠，盐析，得到有机固体；
[0082] 步骤四、将步骤三得到的有机固体溶于水中，配成浓度为3％的水溶液，加入1.2％柠檬酸钠、0.2％抗坏血酸和0.2％次亚磷酸钠，混合均匀，得到试剂A；
[0083] 试剂B为浓度为4％的双氧水溶液。
[0084] 对实施例2的血渍显色剂的显色效果进行检测：取80mL试剂A与20mL试剂B混合，分别喷在有潜在血渍的白布、A4纸、尼龙编织袋、轮胎和黑色铜版纸的表面，结果显示，在5s内可以将潜在的血渍显示出蓝色，且放置一年后，蓝色仍不退去；取80mL试剂A与20mL试剂B混合，对白色石灰墙上的一枚潜在血指纹进行试剂喷洒，结果显示，在5s内指纹显示出蓝色，纹线清晰，搁置一年后，纹线依旧清晰，显色持久，背景不着色，如图10所示。
[0085] 利用chelex-100方法，对上述实验中，喷洒实施例2的血渍显色剂前的白布上的血斑和喷洒实施例2的血渍显色剂后的白布上的血斑进行提取，用fusion试剂盒检测分型，结果显示，喷洒显色剂后的血斑的分型与未喷洒显色剂的血斑的分型没有显著差异，依然可以提取出完整的DNA。说明本发明的显色剂使用中不破坏DNA。
[0086] 对实施例2的血渍显色剂的显色效果进行检测：取80mL试剂A与20mL试剂B混合，分别喷在铁粉、氯化铁的表面，结果显示，实施例2的血渍显色剂遇到铁粉、氯化铁均不会发生颜色变化，说明本发明的血渍显色剂不存在假阳性的问题。
[0087] 对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种
修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
