一种猪流行性腹泻病毒IgA抗体ELISA试剂盒的制备及应用
阅读：407发布：2020-05-11
专利汇可以提供一种猪流行性腹泻病毒IgA抗体ELISA试剂盒的制备及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种猪流行性腹泻病毒IgA 抗体 ELISA检测 试剂 盒 ，其中，该试剂盒包括包被了猪流行性腹泻病毒抗体- 抗原 复合物的支持介质，该猪流行性腹泻病毒抗体-抗原复合物为猪流行性腹泻病毒IgG单克隆抗体-灭活抗原复合物，酶标记的抗猪IgA二抗，以及用于对猪IgA和该猪流行性腹泻病毒抗体-抗原复合物抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阳性对照、阴性对照。本发明的试剂盒灵敏度高，能对乳汁、血清、唾液、肛拭子、 粪便 样品多中靶标样品就进行准确检测。，下面是一种猪流行性腹泻病毒IgA抗体ELISA试剂盒的制备及应用专利的具体信息内容。
1.一种猪流行性腹泻病毒IgA抗体ELISA检测试剂盒，其中，所述试剂盒包括包被了猪流行性腹泻病毒抗体-抗原复合物的支持介质，所述猪流行性腹泻病毒抗体-抗原复合物为猪流行性腹泻病毒IgG单克隆抗体-灭活抗原复合物，酶标记的抗猪IgA二抗，以及用于对猪IgA和所述猪流行性腹泻病毒抗体-抗原复合物抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阳性对照、阴性对照；优选地，所述猪流行性腹泻病毒IgG单克隆抗体为8A3A10、PEDV-McAB1或PEDV-McAB2。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述灭活抗原为CV777株、HN1301株、HN1302株、HN1303株，Iowa18984株、AJ1102株、ZJ08株、LW/L株、SD10株或其培养物的灭活抗原；
所述灭活抗原通过先离心后灭活制备；优选地，所述离心条件为5000～15000转/分钟离心5～30分钟，所述灭活步骤为甲醛灭活、或β-丙内酯灭活，甲醛浓度范围0.05％～0.5％(v/v)，25～37℃静置或摇床50～200转/分钟，灭活时间24～48小时；β-丙内酯(β-PL)BPL灭活，BPL浓度范围0.01％～0.05％，灭活时间8～16小时。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其中，所述猪流行性腹泻病毒IgG单克隆抗体8A3A10包被量为30～1000ng/孔；优选地，所述猪流行性腹泻病毒IgG单克隆抗体8A3A10包被量为
50～500ng/孔；更优选地，所述猪流行性腹泻病毒IgG单克隆抗体8A3A10包被量为50～
300ng/孔；
所述HN1301株灭活抗原添加量为10～160μg/孔；优选地，所述HN1301株灭活抗原添加量为20～120μg/孔；更优选地，所述HN1301株灭活抗原添加量为20～80μg/孔。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述酶标记的抗猪IgA二抗为辣根过氧化物酶标记的抗猪IgA二抗；优选地，所述酶标记的抗猪IgA二抗为酶标记的羊猪IgA二抗，所述对猪IgA和所述猪流行性腹泻病毒抗体-抗原复合物抗原抗体反应进行检测的检测试剂为显色剂A液和显色剂B液，所述显色剂A液为1L水中含有磷酸氢二钠14.7g、柠檬酸9.3g、过氧化脲0.3g，所述显色剂B液为1L水中含有四甲基联苯二胺(TMB)0.2g，无水乙醇100ml；
所述试剂盒还包括终止液，所述终止液为2M H2SO4溶液。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述试剂盒的反应体系为含有BSA、或OVA、或脱脂奶、或驴血清、或羊血清、或胎牛血清的磷酸盐缓冲液；优选地，所述反应体系中为含15％～25％胎牛血清的PBS溶液。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括样品稀释液、洗涤液，所述样品稀释液为含BSA、或OVA、或脱脂奶、或驴血清、或羊血清、或胎牛血清的磷酸盐缓冲液；所述洗涤液为磷酸盐缓冲液。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述阳性对照为经IPMA方法鉴定IgA抗体为阳性的血清、乳汁、唾液、肛拭子、粪便；所述阴性对照为经IPMA方法鉴定IgA抗体为阴性的血清、乳汁、唾液、肛拭子、粪便。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述支持介质为微量滴定板。
9.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述试剂盒检测样本选自乳汁、血清、唾液、肛拭子、粪便样品。
一种猪流行性腹泻病毒IgA抗体ELISA试剂盒的制备及应用
技术领域
背景技术
[0002] 猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹 泻病毒(PED Virus，PEDV)引起猪的一种高度接触性、病毒性肠道传 染病，以水样腹泻、呕吐、脱水、食欲下降及哺乳仔猪的高死亡率为特 征。该病对各种年龄阶段的猪均易感，哺乳仔猪、架子猪、育肥猪的发 病率达100％，尤以哺乳仔猪最为严重，病死率达100％。
[0003] 实践中，血清学检测仍是临床诊断及免疫评价的常用方法。目前 PEDV抗体检测技术主要集中在血液中PEDV IgG抗体水平的检测，而 临床检测发现，尽管疫苗免疫后血清中存在较高水平的PEDV IgG抗体， 猪群仍时常发生PED。因此，传统检测血清中的PEDV IgG抗体水平不 能真实反映PEDV疫苗的免疫保护状况。PEDV引起的免疫应答主要以 肠道黏膜免疫为主，粘膜免疫系统主要是通过产生分泌型IgA(sIgA) 和IgM发挥作用，对于肠道病毒来说，IgA是病原体感染后肠道粘膜产 生最多的抗体类型，也是阻止病原体入侵肠道的重要防线，在机体抗感 染免疫中发挥重要作用。因此，猪体内PEDV IgA抗体水平更能反应机 体被PEDV感染情况或疫苗免疫保护效力。
[0004] 目前，对于IgA的检测仍存在一定难度，国内外尚缺乏标准的PEDV IgA检测技术和产品。目前国内商品化产品仅有韩国安捷生产的PEDV IgA抗体ELISA检测试剂盒，但该试剂盒只能检测母猪的乳汁，特别的 问题是，母猪在哺乳期间采集到乳汁困难，乳汁质量还需检验。由于不 能使用其检验血液等样品，因此仅能间接、模糊评价仔猪群的免疫效果， 不能直接评价各仔猪的免疫效果；也不能评价临床PEDV的感染情况， 无法进行流行病学监测。
发明内容
[0005] 为解决现有技术的不足，本发明提供了一种可检测多种靶标的猪 流行性腹泻病毒IgA抗体ELISA检测试剂盒，特别地，试剂盒灵敏 度较高、特异性良好。
[0006] 本发明涉及一种猪流行性腹泻病毒IgA抗体ELISA检测试剂盒， 其中，所述试剂盒包括包被了猪流行性腹泻病毒抗体-抗原复合物的 支持介质，所述猪流行性腹泻病毒抗体-抗原复合物为猪流行性腹泻 病毒IgG单克隆抗体-灭活抗原复合物，酶标记的抗猪IgA二抗，以 及用于对猪IgA和所述猪流行性腹泻病毒抗体-抗原复合物抗原抗体 反应进行检测的检测试剂、阳性对照、阴性对照。
[0007] 作为本发明的一种实施方式，所述猪流行性腹泻病毒IgG单克 隆抗体为8A3A10、PEDV-McAB1或PEDV-McAB2。
[0008] 所述猪流行性腹泻病毒单克隆抗体8A3A10，由小鼠骨髓杂交瘤 细胞8A3A10分泌表达，其中杂交瘤细胞8A3A10株保藏号为CCTCC No:C2014197，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中 国武汉市武汉大学，保藏日期为2014年11月3日，参见中国专利 CN104694480A。
[0009] 所述猪流行性腹泻病毒单克隆抗体PEDV-McAB1， PEDV-McAB2，公开于中国专利CN105461805A。
[0010] 作为本发明的一种实施方式，所述灭活抗原为CV777株、 HN1301株、HN1302株、HN1303株，Iowa18984株、AJ1102株、ZJ08 株、LW/L株、SD10株或其培养物的灭活抗原；所述灭活抗原通过先 离心后灭活制备。
[0011] 所述CV777株商业上可以获得。
[0012] 作为本发明的一种优选实施方式，所述离心条件为5000～15000 转/分钟离心5～30分钟，所述灭活步骤为甲醛灭活、或β-丙内酯灭活， 甲醛浓度范围0.05％～0.5％(v/v)，
25～37℃静置或摇床50～200转/分 钟，灭活时间24～48小时；β-丙内酯(β-PL)BPL灭活，BPL浓度范 围0.01％～0.05％，灭活时间8～16小时。
25～37℃静置或摇床50～200转/分 钟，灭活时间24～48小时；β-丙内酯(β-PL)BPL灭活，BPL浓度范 围0.01％～0.05％，灭活时间8～16小时。
[0013] 作为本发明的一种实施方式，其中，所述猪流行性腹泻病毒IgG 单克隆抗体8A3A10包被量为30～1000ng/孔；优选地，所述猪流行性 腹泻病毒IgG单克隆抗体8A3A10包被量为50～500ng/孔；更优选地， 所述猪流行性腹泻病毒IgG单克隆抗体8A3A10包被量为
50～300ng/ 孔；所述HN1301株灭活抗原添加量为10～160μg/孔；优选地，所述 HN1301株灭活抗原添加量为20～120μg/孔；更优选地，所述HN1301 株灭活抗原添加量为20～80μg/孔。
50～300ng/ 孔；所述HN1301株灭活抗原添加量为10～160μg/孔；优选地，所述 HN1301株灭活抗原添加量为20～120μg/孔；更优选地，所述HN1301 株灭活抗原添加量为20～80μg/孔。
[0015] 作为本发明的一种优选实施方式，所述酶标记的抗猪IgA二抗为 酶标记的羊猪IgA二抗，所述对猪IgA和所述猪流行性腹泻病毒抗 体-抗原复合物抗原抗体反应进行检测的检测试剂为显色剂A液和显 色剂B液，所述显色剂A液为1L水中含有磷酸氢二钠14.7g、柠檬酸 9.3g、过氧化脲0.3g，所述显色剂B液为1L水中含有四甲基联苯二胺 (TMB)0.2g，无水乙醇100ml。
[0016] 作为本发明的一种实施方式，所述试剂盒还包括终止液，所述终 止液为2M H2SO4溶液。
[0018] 作为本发明的一种优选实施方式，所述反应体系为含15％～25％ 胎牛血清的PBS溶液。
[0019] 作为本发明的一种实施方式，所述试剂盒还包括样品稀释液、洗涤 液，所述样品稀释液为含BSA、或OVA、或脱脂奶、或驴血清、或羊 血清、或胎牛血清的磷酸盐缓冲液；所述洗涤液为磷酸盐缓冲液。
[0020] 作为本发明的一种实施方式，所述阳性对照为经IPMA方法鉴定 IgA抗体为阳性的血清、乳汁、唾液、肛拭子、粪便；所述阴性对照为 经IPMA方法鉴定IgA抗体为阴性的血清、乳汁、唾液、肛拭子、粪便。
[0021] 作为本发明的一种实施方式，所述支持介质为微量滴定板。
[0022] 作为本发明的一种实施方式，所述试剂盒检测样本选自乳汁、血 清、唾液、肛拭子、粪便样品。
[0023] 本发明涉及所述试剂盒的制备方法，所述制备方法包括：
[0024] 步骤(1)用包被液包被猪流行性腹泻病毒抗体，2～8℃包被16～ 24小时或37℃包被1～3小时；经洗涤液洗涤，加入封闭液放于2～ 8℃封闭16～24小时或37℃封闭1～3小时；经洗涤液洗涤，加入猪 流行性腹泻病毒抗原，37℃捕获0.5～2小时；经洗涤液洗涤，干燥 后即为包被有猪流行性腹泻病毒抗体-抗原复合物的支持介质；
[0025] 步骤(2)配制对猪流行性腹泻病毒抗原抗体反应进行检测的检测 试剂；
[0026] 步骤(3)将步骤(1)～(2)制备的包被有猪流行性腹泻病毒 抗体-抗原复合物的支持介质、对猪流行性腹泻病毒抗原抗体反应进行 检测的检测试剂，连同酶标记羊抗猪IgA抗体、阳性对照、阴性对照 组装成试剂盒。
[0027] 作为本发明的一种实施方式，所述步骤(1)中所述包被液为 0.05mol/L～0.1mol/L、pH9.0～pH9.6的碳酸盐缓冲液；所述封闭液为含 1％～3％BSA的磷酸盐缓冲液、含1％～3％OVA的磷酸盐缓冲液、或含 3％～5％脱脂奶的磷酸盐缓冲液、或含有10％～30％驴血清、或含有 10％～30％羊血清、或含有10％～30％胎牛血清的磷酸盐缓冲液；所述 洗涤液为磷酸盐缓冲液。
[0028] 作为本发明的一种实施方式，所述步骤(1)中所述抗体为猪流行 性腹泻病毒单克隆抗体8A3A10、PEDV-McAB1或PEDV-McAB2。
[0029] 作为本发明的一种实施方式，所述步骤(1)中所述抗体的包被量 为30～1000ng/孔，优选为50～500ng/孔，更优选为50～300ng/孔。
[0030] 作为本发明的一种实施方式，所述步骤(1)中所述抗原的捕获 量为10～160μg/孔，优选为20～120μg/孔，更优选为20～80μg/孔。
[0031] 作为本发明的一种实施方式，所述步骤(2)中所述酶标记羊抗猪 IgA抗体标记所用酶为辣根过氧化物酶、或碱性磷酸酶、或β-D-半乳糖 苷酶。
[0032] 本发明还涉及所述试剂盒检测样品中猪流行性腹泻病毒IgA抗体 的方法，所述方法：
[0033] 步骤1)将检测样品用样品稀释液稀释，连同阳性对照、阴性对照 同时加入包被有猪流行性腹泻病毒抗体-抗原复合物的检测孔；
[0034] 步骤2)将酶标记羊抗猪IgA抗体加入检测孔，与检测样品中的猪 流行性腹泻病毒IgA抗体进行结合反应。
[0035] 作为本发明的一种优选实施方式，所述步骤1)中抗体-抗原复合物 附着在支持介质上，所述支持介质优选为微量滴定板；所述步骤2)所 述酶标记羊抗猪IgA抗体标记时所用酶为辣根过氧化物酶、或碱性磷酸 酶、或β-D-半乳糖苷酶。
[0036] 作为本发明的一种实施方式，所述步骤1)中所述样品包括乳汁、 血清、唾液、肛拭子、粪便。
[0037] 作为本发明的一种实施方式，所述步骤1)中所述乳汁、血清用样 品稀释液作10倍稀释，所述肛拭子1支溶于1ml样品稀释液，所述粪 便0.1g溶于1ml样品稀释液。
[0038] 本发明涉及所述试剂盒的应用，所述应用包括仔猪的免疫效果评 价、野毒感染后的评价、离体样品的流行病学调查等。
[0039] 本发明试剂盒可用于非诊断目的的猪流行性腹泻病毒IgA抗体检 测中的应用，不仅可应用于母猪乳汁评价，还可用于血清、唾液、肛拭 子、粪便等多个靶标的准确检测，实现了各个猪只的免疫效果评价、母 猪野毒感染后的临床评价、离体样品的流行病学调查等，弥补了现有 产品仅能检测母猪乳汁，检测血清等其它样本灵敏度低的缺陷。
具体实施方式
[0040] 术语“猪流行性腹泻病毒变异株”又称高致病性猪流行性腹泻病毒 或猪流行性腹泻病毒流行株，自2010年开始流行，发病后的临床表现 为毒株的毒力明显增强，可感染任何年龄的猪如母猪、哺乳仔猪、架子 猪、育肥猪，尤以哺乳仔猪最为严重，病死率达100﹪；以水样腹泻、 呕吐、脱水、食欲下降及哺乳仔猪的高死亡率为主要特征，但不限于此。 免疫现有疫苗后仍然发病。变异株包括但不限于其S蛋白具有与PEDV SC1402株(序列登录号KP162057.1)S蛋白基因序列基本相同的核苷 酸序列的PEDV；优选地，猪流行性腹泻病毒变异株其S蛋白基因序列 基本相同的核苷酸序列的PEDV。基本相同是指PEDV的核苷酸序列优 选包含与PEDV SC1402株S蛋白基因序列有85％～100％相同的序列。 包括但不限于HN1301株、HN1302株、HN1303株、Iowa18984株、 AJ1102株、ZJ08株、LW/L株、SD10株及其培养物。其中，HN1301 株(保藏号为CCTCC NO.V201341)、HN1302株(保藏号为CCTCC NO.V201342)，均保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址均为 中国武汉市武汉大学，保藏日期均为2013年9月16日，公开于中国 专利CN104513827A；HN1303株，保藏号为CCTCC NO.V201514， 保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉市武汉大 学，保藏日期为2015年3月4日，公开于中国专利CN106148287A。 Iowa18984株公开于Hoang,H.,Killian,M.L.,Madson,D.M.,Arruda,et al.Full-Length Genome Sequence of a Plaque-Cloned Virulent Porcine Epidemic Diarrhea Virus Isolate(USA/Iowa/18984/2013)from a Midwestern U.S.Swine Herd.Genome Announc 1.2013.AJ1102株公开 于Bi,J.,Zeng,S.,Xiao,S.,et al.Complete genome sequence of porcine epidemic diarrhea virus strain AJ1102isolated from a suckling piglet with acute diarrhea in China.J Virol 2012,86:10910-10911.ZJ08株公开于中 国专利CN104784686A。LW/L株公开于中国专利CN103041385A。 SD10株公开于中国专利CN103820399A。
[0041] 术语“培养物”是指猪流行性腹泻病毒变异株的传代培养物。
[0042] 术语“猪流行性腹泻病毒S蛋白”是猪流行性腹泻病毒中的四个结构 蛋白之一，为纤突蛋白(spike蛋白)，位于病毒粒子表面的纤突糖蛋 白，在病毒粒子与细胞表面受体结合后通过膜融合侵入宿主细胞和在感 染宿主体内介导中和抗体产生的过程中发挥重要生物学作用。
[0043] 术语“酶”包括为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶。 其中，辣根过氧化物酶所使用的底物为邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯 胺(TMB)，优选为四甲基联苯胺(TMB)。
[0044] 术语“磷酸盐缓冲液”是指含有磷酸或其盐并被调至理想pH值的溶 液，是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液。一般地，磷酸盐缓 冲液是从磷酸或磷酸盐(包括但不限于钠和钾盐)制备的。本领域已经 知道一些磷酸盐，例如磷酸二氢钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和磷酸氢 二钾、磷酸钠和磷酸钾。已经知道磷酸盐是以盐的水合物形式存在的。 由于缓冲液的二级解离作用，缓冲的pH值范围很宽，例如约4～10的 范围，优选约5～9的范围，更优选约6～8的范围，最优选约7.4。进一 步优选地，所述磷酸盐缓冲液为含氯化钠和氯化钾的磷酸盐缓冲液。
[0045] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将 会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范 围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精 神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这 些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0046] 本发明实例中所用的洗涤液为磷酸盐缓冲液，如PBS缓冲液 (pH7.4，0.01mol/L)，其1L体积PBS缓冲液配方示例为：NaCl 8.0g、 KCl 0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、KH2PO4 0.24g，但不限于此配方；若 无特殊说明，均用PBS缓冲液稀释。
[0047] 本发明中所用的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。
[0048] 本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生 物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0049] 实施例1猪流行性腹泻病毒抗原的制备及鉴定
[0050] 1.1抗原用毒株的选择
[0051] 选择猪流行性腹泻病毒经典株、变异株2个类型毒株中的代表性毒 株进行培养增殖，如：经典株为CV777株，变异株为HN1301株、HN1302 株、HN1303株及其培养物。
[0052] 1.2抗原制备方法
[0053] 将实施例1.1制备的培养物先离心(5000～15000转/分钟离心5～ 30分钟)再灭活，灭活方法包括：甲醛法(简称M1)，甲醛浓度范围 0.05％～0.5％(v/v)，25～37℃静置或摇床50～200转/分钟，灭活时间 24～48小时；二乙烯亚胺BEI灭活(简称M2)，BEA先2小时环化 处理，病毒灭活优选3mM～20mM浓度范围，25～37℃摇床50～200 转/分钟，灭活时间12～24小时，灭活后需要硫代硫酸钠处理1～3小 时；β-丙内酯(β-PL)BPL灭活(简称M3)，BPL浓度范围0.01％～ 0.05％，灭活时间8～16小时；盐酸聚六亚甲基胍(PHMG)灭活(简 称M4)，PHMG浓度范围1％～5％，灭活时间12～24小时。用上述抗 原稀释至20μg/孔，按照实施例3.1方法制备的试剂盒进行检测1份临 床阳性乳汁样品P1(IPMA效价1∶256)的ELISA效价，结果见表1。
[0054] 表1 PEDV经典株和变异株制备包被用抗原的评价
[0055]
[0056]
[0057] 上述结果表明：使用多个毒株检测，发现无论是经典株(CV777 株)，还是变异株(HN1301株、HN1302株、HN1303株)均以M1、 M3方法制备的灭活抗原检测结果为最优，因此，选择这两种方法制备 灭活抗原用于后续试验。
[0058] 猪流行性腹泻病毒经典株CV777株作为包被抗原检测目前临床的 阳性血清效价较低，不适合现有临床的检测，弃掉；多个变异株或其培 养物经离心、灭活方法处理后蛋白含量差异不明显，作为包被抗原检测 目前临床的阳性血清效价也相当。
[0059] 实施例2猪流行性腹泻病毒IgA抗体ELISA试剂盒包被抗体的选 择
[0060] 将单克隆抗体8A3A10、PEDV-McAB1、PEDV-McAB2分别作为 包被用抗体，抗体以100ng/孔的量按实施例3.1方法制备试剂盒，按检 测方法检测40份阳性乳汁(其中含初乳
20份)、20份阳性血清、40份阴 性乳汁(其中含初乳20份)、20份阴性血清(均经IPMA鉴定确认是否 IgA抗体为阳性)，并计算样品同IPMA方法的符合率，同时检测1份 临床阳性乳汁样品P1(IPMA效价1∶256)，结果见表2。
20份)、20份阳性血清、40份阴 性乳汁(其中含初乳20份)、20份阴性血清(均经IPMA鉴定确认是否 IgA抗体为阳性)，并计算样品同IPMA方法的符合率，同时检测1份 临床阳性乳汁样品P1(IPMA效价1∶256)，结果见表2。
[0061] 表2试剂盒包被用猪流行性腹泻病毒抗体的评价结果
[0062]
[0063] 表明：3株单克隆抗体均可用于PEDV IgA抗体ELISA试剂盒的制 备。试剂盒1检测结果具有良好的检测灵敏度和样品符合率，为便于后 续更准确的检测，选用试剂盒1进行后续试验。
[0064] 其中，IPMA检测方法：Vero细胞铺至96孔细胞板中，接种PEDV 病毒液，病变达30％～50％，用80％冷丙酮固定抗原板，冻存于-20℃备 用。将稀释好的待检样品加入抗原板中，同时设阳性对照、阴性对照， 37℃孵育1小时后洗涤。将稀释好的羊抗猪IgA酶标二抗加入抗原板中， 37℃孵育1小时后洗涤。将稀释好的AEC显色液加入孔中，室温避光 显色后洗涤。将稀释好的苏木素溶液加入孔中，室温条件下染色。于显 微镜下观察，并进行结果判定，判定标准为：对照成立，细胞核为蓝色， 若细胞质中显棕红色则为阳性样品，若细胞质不显色则为阴性样品。
[0065] 实施例3猪流行性腹泻病毒IgA抗体ELISA试剂盒的制备及检测 方法[0066] 3.1试剂盒制备
[0067] 包被板：用包被液将猪流行性腹泻病毒抗体稀释后按100μl/孔加 入、包被，2～8℃包被16～24小时或37℃包被1～3小时；经洗涤液 洗涤，加入封闭液，2～8℃封闭16～24小时或37℃封闭1～3小时； 经洗涤液洗涤，加入猪流行性腹泻病毒抗原，37℃捕获0.5～2小时； 洗涤、干燥、封板。
[0068] 样品稀释液：含15％～25％胎牛血清的PBS溶液。
[0069] 酶标记羊抗猪IgA抗体：将酶标记羊抗猪IgA抗体用样品稀释液稀 释1∶8000～1∶30000，分装。
[0070] 洗涤液：含0.5％～1％吐温20的PBS溶液。
[0071] 显色液：取磷酸氢二钠14.7g、柠檬酸9.3g、过氧化脲0.3g，溶于 纯化水，定容至1L，0.22μm过滤，无菌分装，为显色剂A液。取四甲 基联苯二胺(TMB)0.2g，无水乙醇100ml，溶于纯化水定容至1L，0.22μm 过滤，无菌分装，为显色剂B液。
[0072] 终止液：2M H2SO4溶液。
[0073] 将以上组分组装成试剂盒。
[0074] 3.2检测方法建立
[0075] 操作步骤如下：
[0076] (1)乳汁、血清、唾液样品用样品稀释液作10倍稀释，肛拭子1 支溶于1ml样品稀释液，粪便0.1g溶于1ml样品稀释液；各取100μl 样品加入反应孔中，同时设阳性对照、阴性对照，37℃温育45～90分 钟。
[0077] (2)用洗涤液洗涤，每孔加入酶标记羊抗猪IgA抗体100μl，37℃ 温育30～45分钟。
[0078] (3)用洗涤液洗涤，每孔加入显色剂A液、B液各50μl，混匀， 37℃或室温避光显色15分钟。
[0079] (4)用洗涤液洗涤，每孔加终止液50μl，10分钟内用酶标仪测定 各孔450nm处的吸光值OD450nm，根据以下结果判定标准进行判定。
[0080] 结果判定标准：判界值A＝0.2×(阳性对照均值-阴性对照均值)， 当样品OD450nm≥A为阳性，OD450nm＜A为阴性。
[0081] 3.3包被用猪流行性腹泻病毒抗体用量的确定
[0082] 根据实施例2.1中结果将单克隆抗体8A3A10作为包被用抗体，抗 体以表3中所示包被量的量按实施例3.1的方法制备试剂盒，按检测方 法检测40份阳性乳汁(其中含初乳20份)、20份阳性血清、40份阴性乳 汁(其中含初乳20份)、20份阴性血清(均经IPMA鉴定确认是否IgA 抗体为阳性)，并计算样品同IPMA方法的符合率，同时检测1份临床 阳性乳汁样品P1(IPMA效价1∶256)，结果见表3。
[0083] 表3试剂盒包被用猪流行性腹泻病毒抗体包被量的筛选结果
[0084]
[0085]
[0086] 表明：单克隆抗体包被量为30～1000ng/孔时均能满足检测要求， 乳汁、血清样品的符合率达60％～100％；进一步，当包被量为50～500ng/ 孔时样品P1的ELISA效价为最高，且乳汁、血清样品的符合率达85％～ 100％；特别地，当包被量为50～300ng/孔时，检测的灵敏度和样品符 合率为最高。
[0087] 3.4包被用猪流行性腹泻病毒抗原用量的确定
[0088] 根据实施例1.2中以流行性腹泻HN1301株M3方法灭活后培养物 作为制备试剂盒抗原，抗原以表4中抗原捕获量按照实施例3.1制备试 剂盒，按检测方法检测40份阳性乳汁(其中含初乳20份)、20份阳性血 清、40份阴性乳汁(其中含初乳20份)、20份阴性血清(均经IPMA鉴 定确认是否IgA抗体为阳性)，并计算样品同IPMA方法的符合率，同 时检测1份临床阳性乳汁样品P1(IPMA效价1∶256)，结果见表4。
[0089] 表4试剂盒捕获用猪流行性腹泻病毒捕获量的筛选结果
[0090]
[0091] 上述结果表明：抗原捕获量在10～160μg/孔制备的试剂盒检测P1 的ELISA效价为1∶256～1∶2048，检测乳汁、血清样品的阳性、阴性 符合率为75％～100％。进一步，当抗原捕获量为20～120μg/孔时，检 测乳汁、血清样品的阳性、阴性符合率更高，达85％～100％。
特别地， 当抗原捕获量为20～80μg/孔时，检测P1的ELISA效价较高(为 1∶1024～1∶2048)，检测乳汁、血清样品的阳性、阴性符合率最高(达 90％～100％)。
特别地， 当抗原捕获量为20～80μg/孔时，检测P1的ELISA效价较高(为 1∶1024～1∶2048)，检测乳汁、血清样品的阳性、阴性符合率最高(达 90％～100％)。
[0092] 实施例4猪流行性腹泻病毒IgA抗体ELISA试剂盒的应用
[0093] 4.1灵敏度
[0094] 用制备的试剂盒检测乳汁样品和血清样品的ELISA效价，并同 IPMA效价对比结果见表5。结果阴性样品ELISA测定结果为阴性，阳 性样品ELISA效价均大于IPMA效价，表明该试剂盒具有良好的检测 灵敏度。
[0095] 表5试剂盒灵敏度检测结果
[0096]
[0097] 4.2特异性
[0098] 将制备的试剂盒检测猪传染性胃肠炎病毒TGEV阳性血清、猪德尔 塔冠状病毒PDcoV阳性血清、猪轮状病毒PoRV阳性血清、猪伪狂犬 病病毒PRV阳性血清、猪细小病毒PPV阳性血清、猪圆环病毒2型PCV2 阳性血清、猪圆环病毒3型PCV3阳性血清、猪繁殖与呼吸综合征病毒 PRRSV阳性血清、猪瘟病毒CSFV阳性血清、猪乙型脑炎JEV病毒阳 性血清，结果：均为阴性，表明该试剂盒与其它病毒IgA阳性血清均无 交叉反应。
[0099] 4.3重复性
[0100] 制备3批试剂盒分别重复检测阳性乳汁样品P2、阳性血清样品P3 各10次，结果：均为阳性，且试剂盒批次内和批次间OD450nm值的变异 系数均小于15％，具有良好的检测重复性。
[0101] 4.4保存期
[0102] 制备3批试剂盒均保存于2～8℃，分别于3、6、9、12、15个月取 样。参照实施例4.1、4.2、4.3进行灵敏度、特异性、重复性检测。检 测结果：在不同保存时间，阴性样品ELISA测定结果为阴性，阳性样 品ELISA效价均大于IPMA效价，实施例4.2中一系列猪病其它病毒阳 性血清的ELISA测定结果均为阴性，试剂盒批次内和批次间OD450nm值 的变异系数均小于
15％，以上结果说明试剂盒在2～8℃保存15个月仍 具有良好的敏度、特异性、重复性。这比商品化试剂盒12个月的保存 期长。
15％，以上结果说明试剂盒在2～8℃保存15个月仍 具有良好的敏度、特异性、重复性。这比商品化试剂盒12个月的保存 期长。
[0103] 4.5临床应用
[0104] 用制备的试剂盒检测多种靶标的临床样品，包括100份乳汁(其中 40份初乳)、100份血清、50份唾液、50份肛拭子、50份粪便样品(均 经IPMA鉴定)，并用韩国安捷PEDV IgA抗体ELISA试剂盒(简称： 安捷试剂盒，其说明书显示仅能检测乳汁样品)进行检测以作比较，计 算样品同IPMA的符合率。结果见表6。结果显示：临床样品ELISA测 定结果同IPMA测定结果具有良好的符合率，优于安捷试剂盒的检测结 果，特别地还可高灵敏度地、准确地检测多种靶标，而安捷试剂盒不能 用于检测唾液样品、肛拭子样品、粪便样品。
[0105] 表6试剂盒临床样品检测结果
[0106]
[0107] 4.5不同毒株免疫后临床检测
[0108] 利用CV777株、HN1301株、HN1302株、ZJ08株(使用的瑞普生 物的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗(HB08株、ZJ08株) 免疫检测代替ZJ08株)制备的疫苗免疫PEDV抗原及特异性抗体为阴 性的母猪和仔猪。采集母猪乳汁20份，仔猪血清20份、唾液20份、 肛拭子20份、粪便样品20份进行IPMA、ELISA检测。结果见表7。
[0109] 表7不同毒株疫苗免疫后临床样品检测结果
[0110]
[0111]
[0112] 上述结果表明：本发明所制备的ELISA试剂盒能够检测经典毒株 和流行性毒株免疫后不同靶标样品中PEDV特异性IgA抗体，且具有良 好的灵敏度，远远优于安捷试剂盒的检测效果，其样品来源具有很大的 广谱性。而韩国安捷试剂盒说明书检测样品要求使用初乳，才能保证检 测结果的准确性。
[0113] 根据丁振江等人的研究(母猪乳汁猪流行性腹泻IgA抗体检测方法 的建立及临床评估，国家农业行业科技田隶生猪产业技术体系：第十五 届全国规模化猪场主要疫病监控与净化专题研讨会论文集，105-107 页)，显示初乳(0d)中的IgA抗体水平最高，其后母猪乳汁中IgA抗体 水平迅速降低(参见该文第107页)。因此本发明的ELISA试剂盒对 IgA含量低的多种检测靶标样品均能准确检测，显示了很高的灵敏度， 临床应用的适应性更高，也更灵活和便捷。本发明的ELISA试剂盒不 仅能准确检测经典株(CV777株)免疫后产生的IgA效价，还能准确检 测变异株(HN1301株、HN1302株、ZJ08株)免疫后产生的IgA效价， 临床应用更广泛。
[0114] 综上所述，本发明试剂盒可用于非诊断目的的猪流行性腹泻病毒 IgA抗体检测中的应用，不仅可应用于母猪乳汁评价，还可用于血清、 肛拭子、粪便、唾液等多个靶标的准确检测，实现了各个猪只的免疫效 果评价、母猪野毒感染后的临床评价、离体样品的流行病学调查等，弥 补了现有产品仅能检测母猪乳汁，检测血清等其它样本灵敏度低的缺 陷。
[0115] 以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式 上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本 发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内， 当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效 实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质 对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明 技术方案的范围内。
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