技术领域
[0001] 本
发明属于天然药物领域，具体涉及一种抗氧化地菍提取物的制备方法。
背景技术
[0002] 地菍为野牡丹科野牡丹属
植物地菍Melastoma dodecandrum Lour.的干燥全草，具有清热化湿、祛瘀止痛、收敛
止血之功效；临床主要用于高热、咽喉肿痛、牙痛、黄疸、
水肿痛经、产后腹痛、崩漏带下、痢疾便血、痈肿疔疮、毒蛇咬伤等病症；民间还用于
治疗流行性脑脊髓膜炎、肾炎、肾盂炎、肠炎、盆腔炎、急性扁桃体炎、外伤出血、腰腿痛和
风湿骨痛等。现代药理学研究还显示，地菍具有降血糖、
镇痛抗炎、调血脂、抗氧化、保肝作用等(王金凤,张评浒,王雨彤,王玲华,李强,李谦,张建军.民族药地菍研究进展[J].中草药,2018,49(05):1211-1219.)。
[0003] 目前，有研究表明地菍的乙酸乙酯部位的总黄
酮和总多糖具有一定抗氧化活性(李丽,罗泽萍,周焕第,等.地菍乙酸乙酯提取部位对糖尿病小鼠血糖、血脂及抗氧化作用的影响[J].中国老年学杂志,2015,35(12):3250-3252；张超,张婷,姚慧珍.地菍总黄酮体外抗小鼠肝线粒体脂质过氧化作用的研究[J].中医药学刊,2005,23(9):1680-1682；张超,姚惠珍,徐兰琴,等.地菍多糖MD1清除
活性氧自由基及对人红细胞膜脂质过氧化作用影响的研究[J].广州医学院学报,2002,30(4):18-21.)，但是，目前对地菍抗氧化的物质
基础研究并不充分。本发明的
发明人在研究中发现，地菍中的总黄酮、总多糖提取并非是地菍抗氧化作用的关键有效组分。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于解决
现有技术问题的不足，提供一种抗氧化作用显著性高于地菍乙酸乙酯部位、总黄酮和总多糖的地菍提取物的制备方法。本发明以清除DPPH自由基为抗氧化活性评价依据，通过对提取工艺、纯化工艺的优化，建立了抗氧化地菍提取物的制备工艺；并且通过谱效关系分析，建立了地菍提取物的检测方法。
[0005] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0006] 一种抗氧化地菍提取物的制备方法，所述抗氧化地菍提取物为以
没食子酸和
鞣花酸为母核的混合物，具有抗氧化活性，所述抗氧化地菍提取物的制备方法，包括如下步骤：
[0007] (1)将地菍的根、茎、叶、果实或上述任意多种植物部位的组合，置25-55℃的烘箱内烘干，取出，
粉碎，过10-100目筛，得到地菍粉末A。
[0008] (2)取步骤(1)所得的粉末A，使液料比为0.01-5mL/mg，提取
溶剂为0-100％甲醇水溶液；上述混合物在0-100℃的水浴超声提取15-75min，取出，冷却至室温，以3500rpm离心15min，得上清液B。
[0009] (3)取步骤(2)所得的上清液B，采用
旋转蒸发仪，在25-55℃水浴浓缩至干，然后加入水溶解，使水溶液的抗氧化活性当量为5-40umol/mL，即得地菍提取物的水溶液C。
[0010] (4)取步骤(3)所得的水溶液C，通过AB-8、ADS-17、D101、HPD100、HPD500、HPD600、HPD950、LSA-10、LSA-21、LX-11、LX-8、NKA-2、X-5、XDA-8或上述任何组合的大孔
树脂柱，控制流速为2-40BV/h，上样体积为5-100BV，上样结束后，依次采用1-16BV 0-40％
乙醇水溶液和1-20BV 10-100％乙醇水溶液洗脱，将10-100％乙醇洗脱部位在25-55℃水浴浓缩至干，即得地菍提取物。
[0011] 优选的，所述步骤(1)中烘干
温度为40℃，粉碎后过50目筛。
[0012] 优选的，所述步骤(2)中液料比为0.3-0.5mL/mg，提取溶剂为50-100％甲醇水溶液，水浴超声温度为25℃，水浴超声时间为15-45min；更优选的，液料比为0.46mL/mg，提取溶剂为61％甲醇水溶液，水浴温度为25℃，水浴超声提取时间为45min。
[0013] 优选的，所述步骤(3)中水浴浓缩温度为40℃，水溶液的抗氧化活性当量为15-30umol/mL；更优选的，水溶液的抗氧化活性当量为20umol/mL。
[0014] 优选的，所述步骤(4)中，步骤(3)所得的水溶液C，通过HPD500、HPD600、ADS-17、LSA-10或上述任何组合的大孔树脂柱，控制流速为5-20BV/h，上样体积为10-70BV，上样结束后，依次采用2-8BV 0-20％乙醇水溶液和1-10BV 25-75％乙醇水溶液洗脱，将25-75％乙醇洗脱部位在40℃水浴浓缩至干；更优选的，所述步骤(4)中，步骤(3)所得的水溶液C，通过HPD500的大孔树脂柱，控制流速为10BV/h，上样体积为30BV，上样结束后，依次采用4BV 0-10％乙醇水溶液和7BV 50％乙醇水溶液洗脱，将50％乙醇洗脱部位在40℃水浴浓缩至干。
[0015] 本发明与现有技术相比，其有益效果主要体现在：
[0016] (1)与地菍的乙酸乙酯部位、总黄酮和总多糖部位相比较，本发明所提供的提取物的抗氧化活性显著性提高；(2)本发明所指的地菍提取物的抗氧化活性主要是由以没食子酸和鞣花酸为母核的混合物引起的，有利于地菍资源的综合性利用。
附图说明
[0017] 图1为甲醇浓度(a)、提取温度(b)、提取时间(c)和液料比(d)对地菍抗氧化活性成分提取率的影响；
[0018] 图2为本发明所指的地菍抗氧化提取物
水解之后的HPLC-UV色谱图。
具体实施方式
[0019] 下面结合附图，并通过具体
实施例对本发明的技术方案作进一步的具体说明。值得注意的是，实施例只是用以解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出
权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
[0020] 以下实施例中所用的植物原料均于2017年9月，采集于浙江丽水。地菍原料全株在40℃烘箱烘干之后，采用锤式粉碎机粉碎，过50目筛，备用。
[0021] 地菍提取物制备工艺优化过程中的影响因素评价指标为提取物清除DPPH自由基的能
力。DPPH·(1,1-二苯基-2-苦基苯肼)是一种稳定的以氮为中心的自由基，其清除率高低反映了提取液抗氧化活性的强弱。本发明以
水溶性维生素E(Trolox,TE)为标准品，首先建立了Trolox浓度与其对DPPH自由基清除率之间的关系曲线，然后依据地菍提取物对DPPH自由基的清除率，将地菍提取物的抗氧化活性折算成μmol Trolox/g植物原料(在地菍抗氧化活性成分的提取工艺中应用此单位)、μmol Trolox/mL提取物溶液(在地菍抗氧化提取物的大孔
吸附树脂纯化工艺中应用此单位)或μmol Trolox/G提取物(在地菍不同提取物之间的抗氧化活性比较时，应用此单位)。标准品Trolox或地菍提取液对DPPH自由基清除率测定方法如下：将3.5mL 0.07mM的DPPH溶液与0.4mL提取物溶液混合，在室温避光放置30分钟，然后用UV1800分光光度计测定其在517nm处的吸光度。
[0022] 清除率X的计算公式如下：
[0023]
[0024] 上式中，X为清除率，Ai为3.5mL DPPH溶液+0.4mL提取液的吸光度值，Aj为无水乙醇+0.4mL提取液的吸光度值；A0为3.5mL DPPH溶液+0.4mL无水乙醇溶液。
[0025] 地菍提取物抗氧化活性受到提取溶剂的浓度、提取温度、提取时间和液料比等多种因素的影响。本发明通过单因素实验和响应面实验对地菍提取物的提取工艺进行了优化：
[0026] 1.1提取流程
[0027] 取地菍粉末约0.1g，加入不同体积的不同浓度的甲醇溶液，在不同温度的水浴中提取一定时间，在3500rpm下离心15min，取上清液检测其抗氧化活性。
[0028] 1.2单因素考察结果
[0029] 单因素的考察结果见图1，由图1可知，当甲醇浓度由0％增加到75％时，地菍提取物的抗氧化活性随着甲醇浓度升高而逐渐升高，而当甲醇浓度为100％时，地菍提取物的抗氧化活性显著性下降；而随着提取温度的升高，地菍提取物的抗氧化活性逐渐下降，说明温度对地菍抗氧化活性物质的提取是不利的，若操作方便，可在低于25℃下的室温进行提取；随着提取时间由15min增加到30min，地菍抗氧化物质的得率逐渐增加，然后逐渐下降；随着液料比的增加，地菍抗氧化物质的得率逐渐增加，然后基本保持不变。
[0030] 1.3响应面考察结果
[0031] 本发明采用响应面法对甲醇浓度、提取时间和液料比进一步进行了优化，提取温度保持在25℃，结果见表1和表2。
[0032] 表1Box-Behnken响应面法实验分析结果
[0033]
[0034]
[0035] 表2回归分析与方差分析
[0036]
[0037]
[0038] 应用响应面
软件分析发现，地菍抗氧化物质的得率(Y)与甲醇浓度(X1)、提取时间(X2)和液料比(X3)之间的关系曲线为：Y＝2570.47-560.49X1+65.52X2-4.68X3-120.35[0039] X1X2-30.65X1X3+154.50X2X3-607.92X12-86.23X22-141.46X32，并计算出最佳工艺为：甲醇浓度为60.75％,提取时间为45min,液料比为0.459mL/mg和提取温度为25℃。为了操作方便，将提取参数
修改为甲醇浓度为61％,提取时间为45min,液料比为0.46mL/mg和提取温度为25℃，在此条件下，通过实验验证，发现地菍抗氧化物质的得率为2742.27±93.86μmol TE/g，与响应面分析软件预测的2789.81μmol TE/g实验结果基本一致，证明回归模型良好的预测了地菍抗氧化物质的提取效果，优化后的工艺条件参数合理，适用于地菍的提取。
[0040] 大孔吸附树脂对分离纯化天然产物具有理化性质稳定、分离性能优良、使用方便、溶剂用量少、可重复使用，成本低等优点，因此，本发明采用大孔吸附树脂法制备地菍抗氧化提取物，其制备工艺的优化过程如下：
[0042] 从表3可知，大孔树脂HPD500、HPD600、ADS-17、LSA-10对地菍活性成分均有良好吸附能力同时还具备良好的解吸附能力，本发明进一步采用HPD500大孔树脂进行了地菍抗氧化物质的纯化工艺研究。
[0043] 1.5大孔吸附树脂色谱柱的纯化工艺考察
[0044] 本发明主要对大孔吸附树脂色谱柱分离纯化工艺中的关键参数进行了考察，分别为上样浓度、上样量、上样速度、洗脱溶剂及洗脱体积进行考察，结果见表4。
[0045] 1.6本发明制备的地菍抗氧化提取物与地菍黄酮、地菍多糖的抗氧化活性的对比分析
[0046] 由于地菍中的牡荆素和异牡荆素是地菍中的主要黄酮类化合物，本发明采用两者1：1混合物作为地菍黄酮的样品；地菍多糖的制备方法如下：取地菍粉末适量，加入10倍水溶液，回流提取3次，滤液合并浓缩，加入适量无水乙醇调节溶液中的乙醇浓度至80％，溶液静置过夜，离心，沉淀采用Seveage法脱除蛋白之后，即得地菍多糖，三者抗氧化活性的对比见表5。
[0047] 表5三种地菍提取物的抗氧化活性对比结果
[0048] 提取物名称 抗氧化活性的当量(mmol TE/g)本发明中的地菍提取物 11.70±0.35
地菍黄酮(牡荆素：异牡荆素＝1：1) 0.15±0.02
地菍多糖 5.21±0.03
[0049] 1.7本发明的地菍抗氧化提取物的关键母核分析
[0050] 取本发明的抗氧化提取物适量，加入10％
盐酸水溶液，在80℃水浴水解3h，再加入部分DMSO溶解沉淀，进入HPLC分析，分别检测没食子酸、对香豆酸、牡荆素、异牡荆素、鞣花酸、槲皮素、柚皮苷、木犀草素、山奈酚和芹菜素，结果见图2。从图2可知，本发明的地菍提取物主要是以鞣花酸和没食子酸为母核的活性化合物，黄酮类化合物如牡荆素、异牡荆素和槲皮素的含量较低。该实验进一步说明本发明所指的地菍提取物与已有报道的地菍抗氧化提取物如地菍多糖和地菍黄酮是不同的。
[0051]
[0052]
