用于抗微生物或抗菌应用的法地榄仁提取物和含法地榄仁提取物的产品
阅读：1027发布：2020-05-14
专利汇可以提供用于抗微生物或抗菌应用的法地榄仁提取物和含法地榄仁提取物的产品专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种组合物或药物，其包括法地榄仁(Terminalia ferdinadiana/T.ferdinandiana)的提取物作为抗 微 生物 剂或 抗菌剂 ，用于 治疗 人或动物的微生物/细菌感染，优选炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)或产气荚膜梭菌(C.perfringens)或贾第鞭毛虫(Giardia)感染。所述提取物可以是或包括法地榄仁叶提取物。所述提取物可以包括至少一种抗 氧 化剂，诸如 鞣花酸 或三甲基鞣花酸，并且可以包括至少一种 单宁 和/或至少一种黄 酮 和/或诃子次酸(chebulic acid)、柯里拉京(corilagen)、诃子酸(chebulinic acid)或诃子鞣酸(chebulagic acid)和/或至少一种黄酮或类黄酮。，下面是用于抗微生物或抗菌应用的法地榄仁提取物和含法地榄仁提取物的产品专利的具体信息内容。
1.一种用于治疗人或动物的细菌感染的组合物，所述组合物包括药物，所述药物含有来源于法地榄仁(Terminalia ferdinandiana/T.ferdinandiana)的提取物作为抗微生物剂或抗菌剂。
2.根据权利要求1所述的组合物，其包括法地榄仁叶提取物。
3.根据权利要求2所述的组合物，除了所述法地榄仁叶提取物以外，进一步包括法地榄仁果实提取物。
4.根据权利要求2或权利要求3所述的组合物，其中所述法地榄仁叶提取物包括甲醇或乙醇提取物、水性提取物、乙酸乙酯提取物、氯仿提取物或己烷提取物中的一种或多种。
5.根据权利要求2所述的组合物，其中所述法地榄仁叶提取物包括一定比例的至少一种抗氧化剂。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述至少一种抗氧化剂包括鞣花酸或三甲基鞣花酸中的一种或多种。
7.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物、所述药物或所述提取物以丸剂形式、胶囊剂形式或作为液体提供。
8.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其包括至少一种单宁和/或至少一种黄酮。
9.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其包括以下中的一种或以下中的两种或更多种的组合：诃子次酸(chebulic acid)、柯里拉京(corilagen)、诃子酸(chebulinic acid)和诃子鞣酸(chebulagic acid)。
10.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其包括至少一种黄酮或类黄酮。
11.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，用于治疗人或动物的炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)或产气荚膜梭菌(C.perfringens)或贾第鞭毛虫(Giardia)感染。
12.一种药物，其包括法地榄仁的提取物作为抗微生物剂或抗菌剂，用于治疗人或动物的细菌感染。
13.根据权利要求12所述的药物，其被提供用于治疗人或动物的炭疽芽孢杆菌或产气荚膜梭菌或贾第鞭毛虫感染。
14.一种法地榄仁的提取物，其在用于治疗人或动物的微生物或细菌感染的药物中使用。
15.根据权利要求14所述的提取物，其用于治疗人或动物的炭疽芽孢杆菌或产气荚膜梭菌或贾第鞭毛虫感染。
16.一种法地榄仁的提取物的用途，其用于制备用于治疗人或动物的细菌感染的药物或组合物。
17.根据权利要求16所述的用途，其中所述提取物包括法地榄仁叶提取物。
用于抗微生物或抗菌应用的法地榄仁提取物和含法地榄仁提
取物的产品
技术领域
[0001] 本发明涉及法地榄仁(Terminalia ferdinandiana/T.ferdinandiana)的天然提取物和/或衍生物。
[0002] 本发明具体地但非唯一地利用了法地榄仁叶的提取物和/或衍生物。
[0003] 本发明发现了在抗菌或抗微生物产品或用途中的应用，诸如用于治疗人和动物的感染。
背景技术
[0004] 在下文中，为了便于参考，法地榄仁(Terminalia ferdinandiana)可以被称为(T.ferdinandiana)。
[0005] 法地榄仁是一种小的落叶乔木，在澳大利亚北部大片的亚热带林地(通常在北领地和西澳大利亚州)广泛野生生长。
[0008] 欧洲专利文献EP 1581513中已经提出了用于法地榄仁果实提取物的化妆品媒介物的实例。另一专利文献US 7175862公开了一种从法地榄仁植物的果实生产含有抗坏血酸(维生素C)、抗氧化剂和植物化学物质的粉末的方法。US 7175862提到了粉状法地榄仁果实用于减少人体中自由基的用途。
[0009] 还已知法地榄仁果实具有抗微生物特性。作为澳大利亚北部的一种本地水果，这种水果被澳大利亚土著人用作食品和药剂的历史悠久。在长时间的狩猎旅行中，澳大利亚土著人食用了这种水果此作为高营养食物的来源。法地榄仁的药用特性尚未得到很好的理解或充分评估。
[0010] 由I.E.Cock和S.Mohanty撰写的一项研究报道了对法地榄仁果肉抗微生物特性的评估，该研究发表在2011年《药理学杂志(Pharmacgnosy Journal)》上[第3卷|第20期]。该研究集中于法地榄仁果肉的细菌生长抑制潜能，并认识到需要进一步的研究以检验法地榄仁果实的其他医学上重要的生物活性。
[0011] 尽管报道了果实的生长抑制活性，但仍需要评估许多病原体，评估果实抑制病原体生长的能力。
[0012] 具体地，法地榄仁的叶提取物的抗菌特性仍未实现。
[0013] 许多细菌可以使人和动物感染。一些细菌，诸如产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens/C.perfringens)，具有厌氧活性。其他细菌，诸如炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis/B.anthracis)，具有需氧或厌氧活性。
[0014] 产气荚膜梭菌引起肌坏死，这是一种肌肉组织特有的坏死性损伤的病况。这常见于产气荚膜梭菌或无数种土壤传播的厌氧细菌中任一种的感染。细菌通过特定的外毒素引起肌坏死。这些微生物是机会性的，通常会通过严重的皮肤破损进入人体。一直到20世纪，由于非无菌野外手术和严重炮弹伤口护理的基本性质，土壤传播细菌的坏疽感染在士兵的战斗伤害中很常见。
[0016] 产气荚膜梭菌细菌严格厌氧生长(尽管它是耐空气的)，并且作为天然微生物菌群的一部分在环境中普遍存在。这种细菌通常也存在于人类和其他脊椎动物的消化道中。
[0017] 在压力下，诸如恶劣的环境或当缺少必需的营养素时，产气荚膜梭菌可以产生使其处于代谢性休眠状态的内生孢子作为防御机制，直到条件再次有利于细胞增殖。
[0018] 产气荚膜梭菌细菌的环境稳健性具有重大的临床意义，并且在缺氧条件下导致多种疾病，其中一些是高度致命的。
[0019] 梭菌性肌坏死(或气性坏疽)是由几种产生外毒素的梭状芽胞杆菌引起的骨骼肌快速进行性、高致死性感染。尽管它是由梭状芽胞杆菌属中的许多物种(包括败血梭菌(C.septicum)、溶组织梭菌(C.histolyticum)或诺维氏梭菌(C.novyi))引起的，但气性坏疽的主要原因是产气荚膜梭菌，据估计是记录在案的病例中最大比例的致病因(据说占此类病例的80％至90％)。
[0020] 产气荚膜梭菌细菌依赖于厌氧条件，因此感染主要发生在深部组织中，这是创伤或手术后的结果。随后产生相关的外毒素，这些外毒素使周围组织坏死，导致肌肉退化。除非给予及时治疗，否则以后的症状可能包括急性肾衰竭、休克、昏迷甚至最终死亡。
[0021] 治疗产气荚膜梭菌引起的气体坏疽的当前策略涉及抗生素治疗和积极的外科清创术的组合。
[0022] 如果不及时治疗，则气性坏疽是高度致命的，并且因此通常需要去除坏死的组织以减少宿主死亡的机会。近来，人们一直在强调生产有效的疫苗，然而，这被更多地视为一种预防措施，而不是一种治愈性疗法，因此一旦感染就没有用。此外，病原体的偶发性、机会性性质导致难以预测谁应该接种疫苗。
[0023] 因此，目前治疗气性坏疽的主要方法涉及在检测到感染后立即给予青霉素(penicillin)和克林霉素(clindamycin)的组合。尽管细菌仍然对抗生素相对敏感，但是已经出现了抗生素抗性产气荚膜梭菌的报道，因此，越来越需要发现和开发用于治疗气性坏疽的替代化学疗法选择。
[0024] 人畜共患感染是指可以在人与动物之间间接或直接传播的疾病，并且从健康和经济角度来看都是沉重的负担。此类疾病可从家养和野生动物中传播到人类，并可通过直接接触、动物分泌物污染饮用水或食用受污染的肉类产品传播。这些疾病在控制和治疗感染方面引起一系列特殊问题，因为畜群免疫和隔离感染个体的传统上有效的策略不可行。
[0025] 此外，与人可以用词语表达其他难以辨别的症状不同，受感染的动物可能没有引起注意，并进一步促进了疾病的传播。从1940年到2004年，人们认为所有新出现的传染病中约60％具有人畜共患性质，其中大部分起源于野生动植物。因此，开发跨物种治疗在有效控制和根除人畜共患疾病方面起着关键作用。
[0026] 举例来说，炭疽芽孢杆菌，是炭疽的病原，是一种主要在土壤中发现的芽孢革兰氏阳性细菌。类似于芽孢杆菌属中的其他生物，炭疽芽孢杆菌能够产生可以保持休眠数年的内生孢子，直到条件再次有利于生长。这些孢子在代谢上是无活性的，并且能够在可能杀死植物细胞的环境条件下生存，包括温度、干燥和酶破坏。
[0027] 根据人炭疽病进入人体的门槛，识别出四种形式的人炭疽病：1.皮肤，最常见的形式(95％)，引起局部、炎性、黑色、坏死性病变(焦痂)；2.吸入，罕见但高度致命的形式，特征是流感样症状、胸部不适、发汗和身体疼痛；3.消化道，罕见但也是致命的(致死率达25％)类型，由于摄入炭疽孢子引起。症状包括：发烧和发冷、颈部肿胀、吞咽疼痛、声音嘶哑、恶心和呕吐(尤其是流血的呕吐)、腹泻、潮红和红眼以及腹部肿胀；4.注射，症状类似于皮肤炭疽的症状，但是注射炭疽比皮肤炭疽可以更快地传播到全身，并且更难以识别和治疗。
[0028] 尽管无性炭疽芽孢杆菌细胞产生与疾病相关的毒素，但是当通过吸入、摄入或经由直接接触开放性伤口将孢子引入宿主时通常开始感染。一旦内在化，孢子就会回复成活细胞、增殖并开始产生致命的炭疽毒素。
[0029] 在国际上，通过认真监测和强有力的根除措施已对该病进行了不同程度的控制。然而，炭疽是世界范围内的地方病，并且如果发生感染，通常是致命的。
[0030] 当前炭疽的治疗策略通常包括抗感染的抗生素治疗以及控制相关症状的支持性护理的组合。
[0031] 静脉内或口服抗生素的施用通常对炭疽的治疗有效，然而，细菌始可能会形成耐药性，这是始终存在的固有风险。因此，通过设计和合成新化合物，或通过调查现有自然资产中的抗菌素，发现新药具有重要意义。
[0032] 贾第鞭毛虫病是全世界人类和牲畜感染性腹泻的主要原因。贾第鞭毛虫病是由贾第鞭毛虫属的原生动物寄生虫的胃肠道感染引起的。可用于该疾病的化学疗法治疗的药物种类有限，并且它们仅在临床诊断后使用，不能用于预防。
[0033] 这些药物中的大部分对贾第鞭毛虫原生动物的某些生命阶段无效、是有毒的、具有不好的副作用，并且在发展中国家的可用性有限。治疗失败和寄生虫抵抗力凸显了开发新的贾第鞭毛虫病的化学疗法治疗的重要性，该疗法具有更高的疗效和更少的严重副作用。
[0034] 使用天然植物衍生的化合物治疗贾第鞭毛虫病具有诱人的前景，因为植物的药用质量可能非常有效。
[0035] 药用植物的抗微生物作用早已为许多文化所认可，并且通过植物化学分析来鉴定活性化合物为开发新型抗微生物剂(诸如用于治疗贾第鞭毛虫病)和抗炭疽试剂提供了希望。
[0036] 因此，自然资产的开发为发现有效治疗引起疾病的微生物(诸如引起炭疽、贾第鞭毛虫病的细菌或梭菌)的化合物提供了巨大的潜力。
[0037] 考虑到上述细菌和细菌感染，才开发出本发明。
发明内容
[0038] 根据本发明的一种或多种形式和评估法地榄仁果实和叶提取物的方法/试验，已经认识到，含有法地榄仁叶提取物的产品在抑制微生物(诸如细菌，例如革兰氏阳性厌氧菌产气荚膜梭菌或炭疽芽孢杆菌或贾第鞭毛虫属诸如十二指肠贾第鞭毛虫(Giardia duodenalis/G.duodenalis))的生长方面是有效的。
[0039] 本发明的一个方面提供了用于药物的法地榄仁提取物，该药物用于治疗人或动物的微生物或细菌感染。
[0040] 本发明的另一方面提供了包括法地榄仁提取物的药物。
[0041] 优选地，提取物包括法地榄仁叶的提取物。
[0042] 一种用于药物的组合物，该药物用于治疗人或动物的微生物或细菌感染，该药物含有来源于法地榄仁叶的提取物作为抗菌剂。
[0043] 可以提供药物或组合物以用作一种或多种丸剂、片剂、胶囊剂或呈液体形式。
[0044] 除法地榄仁叶的提取物之外，药物可以包括法地榄仁果实的提取物。
[0045] 优选地，法地榄仁叶提取物包括甲醇/乙醇提取物、水性提取物、乙酸乙酯提取物、氯仿提取物或己烷提取物中的一种或多种。
[0046] 法地榄仁叶提取物可以包括一定比例的至少一种抗氧化剂。
[0047] 至少一种抗氧化剂可以包括鞣花酸或三甲基鞣花酸中的一种或多种。
[0048] 提取物、组合物或药物作为用于治疗人或动物的细菌感染的抗微生物剂提供。
[0049] 优选地，提取物、药物或组合物以丸剂形式、胶囊剂形式或作为液体提供，包括法地榄仁叶的提取物。
[0051] 提取物、药物或组合物可包括以下中的一种或以下中的两种或更多种的组合：诃子次酸(chebulic acid)、柯里拉京(corilagen)、诃子酸(chebulinic acid)和诃子鞣酸(chebulagic acid)。
[0052] 提取物、药物或组合物可包括至少一种黄酮或类黄酮。
[0053] 提取物、药物或组合物可包括一种或多种抗氧化剂。至少一种抗氧化剂可以包括鞣花酸。鞣花酸可包括鞣花酸脱水合物和/或三甲基鞣花酸。
[0054] 本发明的另一方面提供了一种抗微生物组合物，其含有来源于法地榄仁叶的提取物。
[0055] 优选地，提取物或药物以用于治疗人或动物的炭疽芽孢杆菌或产气荚膜梭菌或贾第鞭毛虫感染的药物形式提供。
[0057] 在下文中将参考附图和表格描述本发明的一个或多个实施例，其中：
[0060] 图3a示出注射2μl法地榄仁叶甲醇提取液的正离子RP-HPLC总化合物色谱图(TCC)，图3b示出注射2μl法地榄仁叶甲醇提取物的负离子RP-HPLC总化合物色谱图(TCC)。
[0061] 图4a示出注射2μl法地榄仁叶乙酸乙酯提取物的正离子RP-HPLC总化合物色谱图(TCC))，图4b示出注射2μl法地榄仁叶乙酸乙酯提取物的负离子RP-HPLC总化合物色谱图(TCC)。
[0062] 图5示出在甲醇和/或乙酸乙酯提取物中检测到的法地榄仁叶单宁化合物的化学结构：(a)诃子次酸；(b)原儿茶酸；(c)鞣花酸二水合物；(d)安石榴苷(punicalagin)；(e)鞣花酸；(f)诃子鞣酸；(g)栗木鞣花素(castalagin)；(h)柯里拉京(corilagin)；(i)石榴皮鞣素(punicalin)；(j)诃子酸；(k)石榴皮鞣素；(l-m)三甲基鞣花酸异构体。
[0063] 图6示出以抑制区(mm)测量的法地榄仁植物提取物对炭疽芽孢杆菌环境分离物的生长抑制活性的图表。FW＝水性法地榄仁果实提取物；FM＝甲醇法地榄仁果实提取物；FC＝氯仿法地榄仁果实提取物；FH＝己烷法地榄仁果实提取物；FE＝乙酸乙酯法地榄仁果实提取物；LW＝水性法地榄仁叶提取物；LM＝甲醇法地榄仁叶提取物；LC＝氯仿法地榄仁叶提取物；LH＝己烷法地榄仁叶提取物；LE＝乙酸乙酯法地榄仁叶提取物；PC＝青霉素(2μg)；AMP＝氨苄西林(ampicillin)(10μg)。结果表示为平均抑制区±SEM。
[0064] 图7示出在24小时暴露后法地榄仁果实和叶植物提取物(2000μg/mL)和重铬酸钾对照物(1000μg/mL)对旧金山卤虫无节幼体的致死率图表。FW＝水性法地榄仁果实提取物；FM＝甲醇法地榄仁果实提取物；FC＝氯仿法地榄仁果实提取物；FH＝己烷法地榄仁果实提取物；FE＝乙酸乙酯法地榄仁果实提取物；LW＝水性法地榄仁叶提取物；LM＝甲醇法地榄仁叶提取物；LC＝氯仿法地榄仁叶提取物；LH＝己烷法地榄仁叶提取物；LE＝乙酸乙酯法地榄仁叶提取物；PC＝重铬酸钾对照物；SW＝海水对照物。结果表示为平均死亡率％±SEM。
[0065] 图8示出代表了注射0.5μL法地榄仁乙酸乙酯果实提取物的顶空气相色谱图的图表。将提取物干燥并重悬于甲醇中用于分析。
[0066] 图9示出代表了注射0.5μL的甲醇法地榄仁叶提取物的顶空气相色谱的图表。将提取物干燥并重悬于甲醇中用于分析。
[0067] 图10a至图10n示出存在于叶和果实提取物中的化合物的实例，诸如一种或多种呋喃和/或单宁。
[0068] 图11a至图11k示出根据本发明的至少一个实施例的具有与抗贾第活性一致的特性的存在于法地榄仁叶中的化合物的实例。
[0069] 图12示出以百分比未处理的对照物测量的法地榄仁提取物和纯化合物对十二指肠贾第鞭毛虫滋养体的三种菌株的抑制活性。
[0070] 图13a至图13c示出以不同比率测试的没食子酸和抗坏血酸的组合对(a)绵羊S2、(b)参考甲硝唑敏感(ATCC203333)和(c)参考甲硝唑抗性(ATCC PRA-251)十二指肠贾第鞭毛虫菌株的等效线图。
[0071] 图14a至图14c示出生长抑制活性与DPGA轴之间的关联的等效线图。
具体实施方式
[0072] 在下文中将描述一种或多种用于获得用于本发明的一个或多个实施例的法地榄仁的提取物和/或衍生物的方法。然而，应当理解和了解，本发明的一般性不受以下具体描述的具体范围的限制。
[0073] 溶剂提取物和水性提取物是使用法地榄仁的果实和叶子制备的。
[0074] 产气荚膜梭菌
[0075] 通过圆盘扩散测定法针对产气荚膜梭菌的临床菌株，研究了法地榄仁果实和叶溶剂以及水性提取物的生长抑制活性。
[0076] 确定其最小抑制浓度(MIC)值以量化和比较其功效。
[0077] 使用旧金山卤虫无节幼体生物测定确定毒性。通过非靶向高效液相色谱-四极杆飞行时间(HPLC-QTOF)质谱(针对3个化合物数据库进行筛选)对活性提取物进行了分析，用于鉴定和表征粗法地榄仁果实和叶提取物中的各个成分。
[0078] 甲醇和水性法地榄仁果实和叶提取物以及叶乙酸乙酯提取物在针对产气荚膜梭菌的圆盘扩散测定法中显示出生长抑制活性。
[0079] 叶提取物相比对应的果实提取物通常是更有效的生长抑制剂，但是水性果实提取物比水性叶提取物具有显著更大的功效。
[0080] 甲醇和乙酸乙酯叶提取物是特别有效的生长抑制剂，MIC值分别为206和117μg/ml。
[0081] 果实甲醇提取物也显示出良好的功效，MIC为716μg/ml。
[0082] 相比之下，果实和叶子的氯仿和己烷提取物完全没有生长抑制活性。
[0083] 在旧金山卤虫生物测定中，所有法地榄仁提取物均无毒或低毒。对甲醇和乙酸乙酯叶提取物的无偏植物化学分析揭示，存在高相对水平的多种没食子单宁和鞣花单宁。
[0084] 法地榄仁提取物的低毒性以及叶甲醇和乙酸乙酯提取物对产气荚膜梭菌的有效生长抑制生物活性表明，它们在治疗和预防梭菌性肌坏死和坏死性肠炎中作为药剂的潜力。代谢组学研究表明，这些提取物含有多种单宁。
[0085] 植物来源和提取：获得了法地榄仁的果实、叶子和果肉。在运输前将果肉冷冻，并保持在-10℃直至处理。将叶子在脱水器中充分脱水，并且将干燥的材料储存在-30℃下。使用前，将果实和叶子材料彻底干燥并磨成粗粉。在4℃下伴随轻轻搅拌，在50mL去离子水、甲醇、氯仿、己烷或乙酸乙酯中充分提取质量为1g的研磨粉，持续24小时。提取物通过滤纸(Whatman No.54)过滤，并在室温下风干。通过在浓缩器中旋转蒸发将水性提取物冻干。将所得粒料溶于10mL去离子水(含有0.5％DMSO)中。提取物通过0.22μm的过滤器(Sarstedt)，并储存在4℃下直至使用。
[0086] 定性植物化学研究：通过先前描述的测定法，针对三萜类化合物、单宁、皂角苷、植物类固醇、酚类化合物、类黄酮、强心苷、蒽醌和生物碱的存在进行提取物的植物化学分析。
[0087] 抗氧化能力：每个样品的抗氧化能力均使用改良的2,2-二苯基-1-吡啶并肼基(DPPH)自由基清除方法进行评估。使用抗坏血酸(每孔0-25μg)作为参考物，并在515nm下测量并记录吸光度。所有测试均与每个板上的对照物一起完成，并且全部一式三份地进行。确定每种提取物的基于DPPH自由基清除能力的抗氧化能力，并表示为每克提取的原始植物材料的微克抗坏血酸当量。
[0088] 抗菌药筛选：临床产气荚膜梭菌筛选：获得了产气荚膜梭菌的临床菌株。
[0089] 抗微生物活性的评估：使用改良的圆盘扩散测定法确定所有叶和果实法地榄仁植物提取物的抗微生物活性。简单来说，将100μL产气荚膜梭菌在10mL新鲜巯基乙酸酯培养基8
中生长，直至它们达到约10个细胞/mL的计数。将体积为100μL的细菌悬浮液铺在营养琼脂平板上，并使用6mm无菌滤纸圆盘测试提取物的抗菌活性。圆盘用10μL的法地榄仁提取物浸渍，使其干燥并置于接种板上。将板在4℃下静置2小时，然后在30℃下孵育24小时。测量抑制区的直径至最接近的整毫米。每个测定以至少一式三份执行。在本文中报道平均值(±SEM)。获得了青霉素(2μg)和氨苄西林(10μg)的标准圆盘，并用作比较抗菌活性的阳性对照物。浸渍有10μL蒸馏水的滤盘用作阴性对照物。
中生长，直至它们达到约10个细胞/mL的计数。将体积为100μL的细菌悬浮液铺在营养琼脂平板上，并使用6mm无菌滤纸圆盘测试提取物的抗菌活性。圆盘用10μL的法地榄仁提取物浸渍，使其干燥并置于接种板上。将板在4℃下静置2小时，然后在30℃下孵育24小时。测量抑制区的直径至最接近的整毫米。每个测定以至少一式三份执行。在本文中报道平均值(±SEM)。获得了青霉素(2μg)和氨苄西林(10μg)的标准圆盘，并用作比较抗菌活性的阳性对照物。浸渍有10μL蒸馏水的滤盘用作阴性对照物。
[0090] 最小抑制浓度(MIC)确定：如前所述确定提取物的最小抑制浓度(MIC)。简单来说，将法地榄仁果实和叶植物提取物稀释在去离子水中，并在一系列浓度下进行测试。圆盘用10μL提取物稀释液浸渍，使其干燥并置于接种板上。如上概述进行测定，并绘制抑制区对浓度的曲线图。使用线性回归来确定MIC值。
[0091] 毒性筛选：毒性筛选的参考毒素：重铬酸钾(K2Cr2O7)在蒸馏水中制备(4mg/mL)，并在人造海水中进行连续稀释，用于旧金山卤虫无节幼体生物测定。
[0092] 旧金山卤虫无节幼体毒性筛选
[0093] 使用改良的旧金山卤虫无节幼体致死率测定法来测试毒性。简单来说，将400μL含约43(平均值为43.2，n＝155，SD 14.5)旧金山卤虫无节幼体的海水添加到48孔板的孔中，并立即用于生物测定。将体积为400μL的参考毒素或稀释的植物提取物转移至孔中，并在25±1℃下在人造光(1000Lux)下孵育。每个板一式三份运行阴性对照物(400μL海水)。所有处理以至少一式三份执行。定期检查孔并计数死亡数。如果在10秒内未检测到附肢移动，则认为无节幼体死亡。在24小时后，处死所有无节幼体并计数以确定每孔的总死亡率％。使用概率分析计算每种处理的LC50(置信限为95％)。
[0094] 非靶向HPLC-MS QTOF分析：为了色谱分离，将2μL样品注入装有色谱柱(2.1×100mm，粒径1.8μm)的HPLC系统中。流动相由(A)超纯水和(B)95:5乙腈/水组成，流速为
0.7mL/分钟。两种流动相用0.1％(v/v)冰醋酸进行修饰以进行正模式质谱分析，并用5mM乙酸铵进行修饰以进行负模式质谱分析。用于研究的色谱条件由以下组成：前5分钟在5％B下等度运行，从5分钟至30分钟应用5％到100％的(B)梯度，然后在100％下等度运行3分钟。质谱分析在装有电喷雾电离源的四极杆飞行时间质谱仪(QTOF MS)上以正模式和负模式执行。
0.7mL/分钟。两种流动相用0.1％(v/v)冰醋酸进行修饰以进行正模式质谱分析，并用5mM乙酸铵进行修饰以进行负模式质谱分析。用于研究的色谱条件由以下组成：前5分钟在5％B下等度运行，从5分钟至30分钟应用5％到100％的(B)梯度，然后在100％下等度运行3分钟。质谱分析在装有电喷雾电离源的四极杆飞行时间质谱仪(QTOF MS)上以正模式和负模式执行。
[0095] 使用已知的定性分析软件分析数据。使用软件包中的“按分子特征查找”算法分析使用每种溶剂提取系统的空白，以生成丰度大于10,000个计数的分子的化合物列表。然后将这用作排除列表，以从提取物的分析中消除背景污染物化合物。然后，使用“按分子特征查找”功能使用相同的参数对每种提取物进行分析，以生成提取物中化合物的假定列表。然后对照三个准确的质量数据库筛选化合物列表；专为本次研究生成的具有治疗重要性的已知植物化合物数据库(800种化合物)；已知的代谢组学数据库(24,768种化合物)；以及已知的法医毒理学数据库(7,509种化合物)。使用软件包中的查找式功能确定未鉴定化合物的经验式。
[0096] 统计分析：数据表示为至少三个独立实验的平均值±SEM。
[0097] 液体提取量和定性植物化学筛选
[0098] 用各种溶剂提取的法地榄仁植物提取物(1g)得到在18mg至483mg(果实提取物)和58mg至471mg(叶提取物)范围内的干燥植物提取物(见表1)。
[0099] 表1：干燥的提取材料的质量、重悬于去离子水中后的浓度、法地榄仁提取物的定性植物化学筛选和抗氧化能力：
[0100] 表1
[0101]
[0102] 在上面的表1中，+++表示反应大；++表示反应中等；+表示反应较小；-表示测定中无反应。KFW＝水性法地榄仁果实提取物；KFM＝甲醇法地榄仁果实提取物；KFC＝氯仿法地榄仁果实提取物；KFH＝己烷法地榄仁果实提取物；KFE＝乙酸乙酯法地榄仁果实提取物；KLW＝水性法地榄仁叶提取物；KLM＝甲醇法地榄仁叶提取物；KLC＝氯仿法地榄仁叶提取物；KLH＝己烷法地榄仁叶提取物；KLE＝乙酸乙酯法地榄仁叶提取物。通过DPPH还原确定抗氧化能力，并表示为每克提取的植物材料的毫克抗坏血酸当量。
[0103] 相对于得到低至中等产率的氯仿、乙酸乙酯和己烷对应物，水和甲醇提取物提供显著更大产率的提取材料。将干燥的提取物重悬于10mL去离子水(含1％DMSO)中，得到的浓度呈现于表1中。
[0104] 抗氧化剂含量：植物提取物(表1)的抗氧化能力范围为每克提取的干燥植物材料(甲醇果实提取物)0.4mg(己烷叶提取物)至高达660mg抗坏血酸当量。水性提取物和甲醇提取物通常比对应的氯仿、己烷和乙酸乙酯提取物具有更高的抗氧化能力。
[0105] 抗微生物活性：为了确定果实和叶粗提物抑制产气荚膜梭菌生长的能力，使用圆盘扩散测定法筛选了每种提取物10μL。
[0106] 如图1中的图表所示，筛选的10种提取物中的5种(50％)强烈地抑制细菌生长。
[0107] 甲醇叶提取物是最有效的生长抑制剂(通过抑制区判断)，抑制区为16±0.6mm。这与青霉素(2μg)和氨苄西林对照物(10μg)有利地匹敌，其抑制区分别为12.3±0.3和13±1.0mm。
[0108] 将甲醇果实提取物以及水和乙酸乙酯叶提取物两者也显示出产气荚膜梭菌生长的良好抑制，抑制区≥9mm。
[0109] 通常，叶提取物相比对应的果实提取物对应物是更有效的产气荚膜梭菌生长抑制剂。
[0110] 图1示出以抑制区(mm)测量的法地榄仁果实和叶植物提取物对产气荚膜梭菌环境分离物的生长抑制活性的图表。KFW＝水性法地榄仁果实提取物；KFM＝甲醇法地榄仁果实提取物；KFC＝氯仿法地榄仁果实提取物；KFH＝己烷法地榄仁果实提取物；KFE＝乙酸乙酯法地榄仁果实提取物；KLW＝水性法地榄仁叶提取物；KLM＝甲醇法地榄仁叶提取物；KLC＝氯仿法地榄仁叶提取物；KLH＝己烷法地榄仁叶提取物；KLE＝乙酸乙酯法地榄仁叶提取物；PC＝青霉素(2μg)；AMP＝氨苄西林(10μg)。结果表示为平均抑制区±SEM。
[0111] 通过确定法地榄仁提取物的MIC值进一步量化抗微生物功效(表2)。
[0112] 下表2示出了在卤虫无节幼体生物测定中法地榄仁果实和叶提取物的最小抑制浓度(μg/mL)和LC50值(μg/mL)(数字表示一式三份测定的平均MIC和LC50值。-表示无抑制)：
[0113] 表2
[0114]
[0115] 水和甲醇提取物(果实和叶)以及叶乙酸乙酯提取物均能有效抑制产气荚膜梭菌生长，MIC值通常<1000μg/ml(浸渍在圆盘中<10μg)。
[0116] 甲醇和乙酸乙酯的叶提取物特别有效，MIC值分别为206μg/mL(注入圆盘中约2.1μg)和117μg/mL(注入圆盘中约1.2μg)。
[0117] 这些结果与分别以2μg和10μg测试的青霉素和氨苄西林对照物的生长抑制活性很好地匹敌。
[0118] 甲醇果实提取物也是有效的产气荚膜梭菌生长抑制剂(MIC值为716μg/ml)。
[0119] 尽管效力较低，但水性果实提取物也显示出良好的生长抑制活性(MIC值为1192μg/ml)。
[0120] 相比之下，氯仿和己烷提取物以及果实乙酸乙酯提取物均无活性，或在测定中仅具有低的功效。
[0121] 毒性的量化：所有提取物首先在测定中以2000μg/mL进行筛选(见图2)。
[0122] 作为参考毒素，重铬酸钾也在生物测定中进行了测试。重铬酸钾参考毒素的死亡发作快速，在暴露的前3小时内引起无节幼体死亡，并且在4-5小时内可见100％死亡率(结果省略)。
[0123] 所有水性和甲醇提取物以及乙酸乙酯叶提取物在24小时时均示出>90％的死亡率。
[0124] 除氯仿叶提取物外，其他提取物在24小时时示出<10％的死亡率。
[0125] 为了进一步量化毒素浓度对死亡率启动的影响，将提取物连续稀释在人造海水中，以在旧金山卤虫无节幼体生物测定中在24小时测试一系列浓度。表2中呈现了法地榄仁提取物对旧金山卤虫的LC50值。在己烷或氯仿提取物中未报道LC50值，乙酸乙酯果实提取物中也没有报道，因为在所有测试浓度中均看到<50％的死亡率。
[0126] 对卤虫无节幼体的LC50大于1000μg/ml的提取物在此测定中被定义为无毒的。由于只有乙酸乙酯果实提取物的LC50值小于1000μg/ml，因此所有其他提取物均被视为无毒。尽管乙酸乙酯叶提取物的LC50值＜1000μg/ml，但767μg/ml的值指示低至中等毒性。
[0127] 图2示出在24小时暴露后，澳大利亚植物提取物(2000μg/mL)和重铬酸钾对照物(1000μg/mL)对旧金山卤虫无节幼体的致死率图表。KFW＝水性法地榄仁果实提取物；KFM＝甲醇法地榄仁果实提取物；KFC＝氯仿法地榄仁果实提取物；KFH＝己烷法地榄仁果实提取物；KFE＝乙酸乙酯法地榄仁果实提取物；KLW＝水性法地榄仁叶提取物；KLM＝甲醇法地榄仁叶提取物；KLC＝氯仿法地榄仁叶提取物；KLH＝己烷法地榄仁叶提取物；KLE＝乙酸乙酯法地榄仁叶提取物；PC＝重铬酸钾对照；SW＝海水对照物。结果表示为平均死亡率％±SEM。
[0128] 应当了解，甲醇提取物包括乙醇提取物。
[0129] HPLC-MS QTOF分析：由于甲醇和乙酸乙酯叶提取物具有最大的抗菌功效(如通过MIC确定)，因此它们被认为是用于进一步植物化学分析的最有希望的提取物。先前用于分析法地榄仁叶提取物的优化的HPLC-MS QTOF参数也用于确定甲醇和乙酸乙酯叶提取物的化合物特征曲线。甲醇和乙酸乙酯提取物的总化合物色谱图分别呈现于图3a、图3b和图4a、图4b中。
[0130] 法地榄仁甲醇提取物正(图3a)和负离子(图3b)总化合物色谱图显示在色谱图的早期有多个重叠峰，与极性化合物的洗脱相对应。
[0131] 大多数提取物化合物在色谱图的12分钟内洗脱(对应于约32％乙腈)。
[0132] 然而，在两个色谱图中在12至16分钟之间以及24至30分钟之间(51-66％乙腈)的几个突出峰指示该提取物中化合物的极性广泛分布。
[0133] 叶乙酸乙酯正离子色谱图(图4a)具有与对应的甲醇提取物类似的洗脱特征曲线，尽管明显的峰较少。
[0134] 该色谱图中的许多峰对应于甲醇提取物中类似洗脱体积的峰，指示两种溶剂都提取了许多化合物。
[0135] 相比之下，在叶乙酸乙酯负离子色谱图中明显更少的峰(图4b)。
[0137] 图4a示出注射2μl法地榄仁叶乙酸乙酯提取物的正离子RP-HPLC总化合物色谱图(TCC)，图4b示出注射2μl法地榄仁叶乙酸乙酯提取物的负离子RP-HPLC总化合物色谱图(TCC)。
[0138] 总的来说，对于法地榄仁叶甲醇和/或乙酸乙酯提取物，记录了54个独特的质量信号(表3)。
[0139] 通过与“梅特林(Metlin)”代谢组学、法医毒理学(安捷伦(Agilent))和植物化学物质(在此实验室中开发的)数据库进行比较，推定地鉴定出了全部54个独特的分子质量信号。
[0140] 仅在甲醇和乙酸乙酯提取物中分别检测到17种和8种化合物。两种提取物中均存在其余的29种化合物。
[0141] 单宁化合物的多样性是值得注意的，其中在甲醇和乙酸乙酯叶提取物中推定地鉴定出十四种单宁化合物。
[0142] 具体地，推定地鉴定出诃子次酸(图5a)、原儿茶酸(图5b)、鞣花酸脱水合物(图5c)、安石榴苷(图5d)、鞣花酸(图5e)、诃子鞣酸(图5f)、栗木鞣花素(图5g)、柯里拉京(图
5h)、石榴皮鞣素(图5i)、诃子酸、(图5j)、石榴皮鞣素(图5k)、三甲基鞣花酸异构体(图5l和图5m)。
5h)、石榴皮鞣素(图5i)、诃子酸、(图5j)、石榴皮鞣素(图5k)、三甲基鞣花酸异构体(图5l和图5m)。
[0143] 表3示出法地榄仁叶甲醇和乙酸乙酯提取物的定性HPLC-MS/MS分析，实验式的阐明以及该化合物的推定鉴定。
[0144] 表3
[0145]
[0146]
[0147]
[0148] 在上面的表3中，+和-是指检测到化合物的相关电离模式。KLM＝法地榄仁叶甲醇提取物；KLE＝法地榄仁乙酸乙酯提取物。
[0149] 特别值得注意的是甲醇和乙酸乙酯法地榄仁叶提取物中鞣花单宁的多样性。
[0150] 除了从鞣花酸以及脱水和三甲基化的衍生物中，还推定地鉴定出了更复杂、分子量更高的化合物(j)诃子酸和石榴皮鞣素，它们可能有助于这些提取物对产气荚膜梭菌的生长抑制活性。
[0151] 鞣花单宁被认为是多种细菌生长的有效抑制剂，MIC值低至62.5μg/ml。
[0152] 法地榄仁提取物显示出对旧金山卤虫的低毒性。实际上，除了叶乙酸乙酯提取物(MIC 767μg/mL)以外，所有提取物的LC50值都远远超过1000μg/mL，因此无毒。
[0153] 炭疽芽孢杆菌
[0154] 使用盘扩散测定法研究了抑制炭疽芽孢杆菌生长的能力。
[0155] 确定果实和叶提取物的最小抑制浓度(MIC)值，以量化和比较其功效。
[0156] 毒性是通过旧金山卤虫无节幼体生物测定法确定的。
[0157] 研究人员使用已知的非靶向气相色谱/质谱法-GC-MS顶空分析(针对化合物数据库进行筛选)研究了最有效的法地榄仁果实和叶提取物，以鉴定和表征粗法地榄仁提取物中的各个组分。
[0158] 结果：在圆盘扩散测定法中，法地榄仁果实和叶的溶剂提取物显示出对炭疽芽胞杆菌的良好的生长抑制活性。
[0159] 果实乙酸乙酯和甲醇法地榄仁叶提取物是特别有效的生长抑制剂，MIC值分别为451和377μg/mL。
[0160] 果实甲醇和氯仿提取物以及水性叶提取物，也是炭疽芽孢杆菌生长的良好抑制剂(MIC值分别为1800和1414μg/mL)。
[0161] 水性果实提取物和叶氯仿提取物仅具有低抑制活性。
[0162] 所有其他提取物完全没有生长抑制活性。
[0163] 此外，所有具有生长抑制活性的提取物在旧金山卤虫生物测定法中均无毒，LC50值>1000μg/mL。对最具活性的提取物(果实乙酸乙酯和甲醇叶)的无偏GC-MS植物化学分析推定地鉴定出并突出可能有助于这些提取物抑制炭疽芽孢杆菌生长的能力的几种化合物。
[0164] 法地榄仁果实乙酸乙酯和甲醇叶提取物的低毒性，以及它们对炭疽芽孢杆菌的有效生长抑制生物活性，表明它们在治疗和预防炭疽方面作为药剂先前未意识到的适用性。
[0165] 定性植物化学研究：针对生物碱、蒽醌、强心苷、类黄酮、酚类化合物，植物类固醇、皂角苷、单宁和三萜类化合物的存在，进行提取物的植物化学分析。
[0166] 抗氧化能力：使用改良的DPPH自由基清除方法评估每个样品的抗氧化能力。
[0167] 抗坏血酸(0-25μg/孔)用作参考物，并在515nm下记录吸光度。
[0168] 所有测试均与每个板上的对照物一起完成，并且全部一式三份地进行。确定每种提取物的基于DPPH自由基清除能力的抗氧化能力，并表示为每克提取的原始植物材料的微克抗坏血酸当量。
[0169] 抗菌筛选：环境炭疽芽孢杆菌筛选：分离并鉴定出炭疽芽孢杆菌的环境菌株。所有生长研究均使用改良的蛋白胨/酵母提取物(PYE)琼脂进行：1g/L蛋白胨、1.5g/L酵母提取物、7.5g/L NaCl、1g/L过硫酸铵、2.4g/L HEPES缓冲液(pH 7.5)和16g/L细菌琼脂(如果需要)。在30℃下孵育，将培养物传代培养并保持在4℃的PYE培养基中。
[0170] 抗微生物活性的评估：使用改良的圆盘扩散测定法确定所有植物提取物的抗微生物活性。简单来说，将100μL的测试细菌在10mL新鲜的营养肉汤培养基中生长，直至达到约108个细胞/mL的计数。
[0171] 将体积为100μL的细菌悬浮液铺在营养琼脂平板上，并使用5mm无菌滤纸圆盘测试提取物的抗菌活性。圆盘用10μL的测试样品浸渍，使其干燥并置于接种板上。将板在4℃下静置2小时，然后在30℃下孵育24小时。
[0172] 测量抑制区的直径至最接近的整毫米。
[0173] 每个测定以至少一式三份执行。在该研究中报道平均值(±SEM)。获得了青霉素(2μg)和氨苄西林(10μg)的标准圆盘，并用作抗菌活性的阳性对照物。浸渍有10μL蒸馏水的滤盘用作阴性对照物。
[0174] 测量抑制区的直径至最接近的整个毫米。
[0175] 最小抑制浓度(MIC)确定：提取物的最小抑制浓度(MIC)如前所述进行确定。
[0176] 简单来说，将植物提取物稀释在去离子水中，并在一系列浓度下进行测试。圆盘用10μL提取物稀释液浸渍，使其干燥并置于接种板上。
[0177] 如上概述进行测定，并绘制抑制区对浓度的曲线图。使用线性回归来确定MIC值。
[0178] 毒性筛选：毒性筛选的参考毒素：重铬酸钾(K2Cr2O7)在蒸馏水中制备(4mg/mL)，并在人造海水中进行连续稀释，用于旧金山卤虫无节幼体生物测定。
[0179] 旧金山卤虫无节幼体毒性筛选：使用改良的旧金山卤虫无节幼体致死率测定法来测试毒性。简单来说，将400μL含约43(平均值为43.2，n＝155，SD 14.5)旧金山卤虫无节幼体的海水添加到48孔板的孔中，并立即用于生物测定。
[0180] 将体积为400μL的参考毒素或稀释的植物提取物转移至孔中，并在25±1℃下在人造光(1000Lux)下孵育。每个板一式三份运行阴性对照物(400μL海水)。所有处理以至少一式三份执行。
[0181] 定期检查孔并计数死亡数。
[0182] 如果在10秒内未检测到附肢移动，则认为无节幼体死亡。在24小时后，处死所有无节幼体并计数以确定每孔的总死亡率％。使用概率分析计算每种处理的LC50(置信限为95％)。
[0183] 非靶向GC-MS顶空分析：使用质量选择检测器系统进行分离和量化。简单来说，系统配备有自动进样器，该自动进样器装有利用二乙烯基苯/碳纤维/聚二甲基硅氧烷(DVB/CAR/PDMS)的固相微提取纤维(SPME)处理系统。使用5％苯基、95％二甲基聚硅氧烷(30m×0.25mm id×0.25um)毛细管柱完成色谱分离。氦气(99.999％)被用作载气，流速为0.79ml/分钟。注射器温度设定为230℃。
[0184] 采样利用了SPME循环，该循环由以500rpm的搅拌阶段持续5秒组成。
[0185] 将纤维暴露于样品10分钟以使其吸收，然后在250℃的注射口中解吸1分钟。初始柱温保持在30℃下持续2分钟，升高到140℃持续5分钟，然后在3分钟的时间段内升高到270℃，并在分析期间保持在该温度下。
[0186] 在不分流模式下注射后的一分钟内，GC-MS接口保持在200℃且无信号采集。质谱仪在70eV下以电子电离模式运行。然后以总离子计数(TIC)模式记录分析物。在1分钟后使用45-450m/z的质量范围获取TIC并持续45分钟的持续时间。
[0187] 统计分析：数据表示为至少三个独立实验的平均值±SEM。
[0188] 结果
[0189] 液体提取量和定性植物化学筛选：用各种溶剂提取各种干燥的法地榄仁果实和叶植物材料(1g)得到在18mg(己烷果实提取物)至483mg(水性果实提取物)范围内的干燥植物提取物(表4)。
[0190] 与得到低至中等产率的氯仿、己烷和乙酸乙酯的对应物相比，甲醇和水性提取物得到显著更高产率的干燥提取材料。将干燥的提取物重悬于10mL去离子水(含1％DMSO)中，得到表4所示的提取物浓度。
[0191] 表4：干燥的提取材料的质量、重悬于去离子水中后的浓度、法地榄仁提取物的定性植物化学筛选和抗氧化能力：
[0192] 表4
[0193]
[0194]
[0195] 在上面的表4中，+++表示反应大；++表示反应中等；+表示反应较小；-表示测定中无反应。FW＝水性法地榄仁果实提取物；FM＝甲醇法地榄仁果实提取物；FC＝氯仿法地榄仁果实提取物；FH＝己烷法地榄仁果实提取物；FE＝乙酸乙酯法地榄仁果实提取物；LW＝水性法地榄仁叶提取物；LM＝甲醇法地榄仁叶提取物；LC＝氯仿法地榄仁叶提取物；LH＝己烷法地榄仁叶提取物；LE＝乙酸乙酯法地榄仁叶提取物。通过DPPH还原确定抗氧化能力，并表示为每克提取的植物材料的毫克抗坏血酸当量。
[0196] 抗微生物活性：为了确定法地榄仁果实和叶片粗植物提取物抑制炭疽芽孢杆菌生长的能力，使用圆盘扩散测定法筛选每种提取物的等分试样(10μL)。
[0197] 筛选的10种提取物中的7种(70％)强烈地抑制了细菌生长(图6)。
[0198] 甲醇叶提取物是炭疽芽孢杆菌生长的最有效抑制剂(如通过抑制区判断)，抑制区为15.3±0.6mm。这与青霉素(2μg)和氨苄西林对照物(10μg)有利地匹敌，其抑制区分别为8.3±0.6和10.0±0.7。
[0199] 甲醇果实提取物以及乙酸乙酯和水性叶提取物也显示出炭疽芽孢杆菌生长的良好抑制，抑制区≥8mm。
[0200] 通常，叶提取物相比于其果实提取物对应物是更有效的炭疽芽孢杆菌生长抑制剂。
[0201] 通过确定法地榄仁提取物的MIC值进一步量化抗微生物功效(表5)。
[0202] 大多数提取物有效抑制炭疽芽孢杆菌的生长，几种提取物的MIC值<1000μg/ml(浸渍在圆盘中<10μg)。
[0203] 乙酸乙酯果实提取物和甲醇叶提取物特别有效，MIC值分别为451μg/mL(注入圆盘中约4.5μg)和377μg/mL(注入圆盘中约3.8μg)。
[0204] 这些结果与分别以2μg和10μg测试的青霉素和氨苄西林对照物的生长抑制活性很好地匹敌。
[0205] 甲醇果实提取物也是有效的炭疽芽孢杆菌生长抑制剂(MIC值为877μg/ml)。
[0206] 尽管效力较低，但果实氯仿和水性叶提取物也具有良好的生长抑制活性(MIC值分别为1800和1414μg/ml)。
[0207] 相比之下，水性果实和己烷提取物以及叶氯仿己烷和乙酸乙酯提取物均无活性，或在测定中仅具有低的功效。
[0208] 下表5示出在卤虫无节幼体生物测定中，法地榄仁果实和叶提取物的最小抑制浓度(μg/mL)和LC50值(μg/mL)。
[0209] 表5
[0210]
[0211]
[0212] 毒性的量化：首先在测定中以2000μg/mL对所有提取物进行筛选(见图7)。为了进行比较，还在生物测定中测试了参考毒素重铬酸钾(1000μg/mL)。
[0213] 重铬酸钾参考毒素的死亡速度很快，在暴露的前3小时内引起无节幼体死亡，并且在4-5小时后可见100％死亡率(结果未显示)。
[0214] 所有的甲醇和水性提取物在24小时时均示出>90％的死亡率，乙酸乙酯叶提取物也是如此。除氯仿叶提取物外，其余提取物在24小时时示出<10％的死亡率。
[0215] 为了进一步量化毒素浓度对死亡率启动的影响，将提取物连续稀释在人造海水中，以在旧金山卤虫无节幼体生物测定中在24小时测试一系列浓度。
[0216] 表2示出法地榄仁提取物对旧金山卤虫的LC50值。在氯仿和己烷提取物中未报道LC50值，乙酸乙酯果实提取物中也没有报道，因为对于所有测试浓度，均看到<50％的死亡率。
[0217] 对卤虫无节幼体的LC50大于1000μg/ml的提取物在此测定中被定义为无毒的。
[0218] 由于只有乙酸乙酯果实提取物的LC50<1000μg/ml，因此所有其他提取物均被视为无毒。尽管叶乙酸乙酯提取物的LC50值低于1000μg/ml，但767μg/ml的值指示低至中等毒性。
[0219] 法地榄仁果实和叶提取物的非靶向GC-MS顶空分析：由于果实乙酸乙酯和甲醇叶提取物对炭疽芽孢杆菌具有最大的生长抑制功效(如通过MIC确定；见表5)，因此它们被认为是用于进一步植物化学分析的最有希望的提取物。开发了优化的GC-MS参数，并将其用于检查这些提取物的植物化学组成。
[0220] 果实乙酸乙酯和甲醇叶提取物的所得气相色谱图分别呈现于图8和9中。在果实乙酸乙酯提取物中发现了几个主要峰，分别在约15.1(3,3-二甲基己烷，7.1％相对丰度)、19.7(2-甲基-2-苯基-环氧乙烷，14.6％相对丰度)、20.9(间二叔丁基苯，22％相对丰度)和
28.9分钟(3,5-双(1,1-二甲基乙基)-苯酚，19.4％相对丰度)。在10-25分钟的色谱图的中间阶段，也可见许多重叠的峰。总的来说，对于法地榄仁叶果实乙酸乙酯提取物，记录了42个独特的质量信号(表6)。对所有这些化合物都获得了推定的经验式和鉴定。
28.9分钟(3,5-双(1,1-二甲基乙基)-苯酚，19.4％相对丰度)。在10-25分钟的色谱图的中间阶段，也可见许多重叠的峰。总的来说，对于法地榄仁叶果实乙酸乙酯提取物，记录了42个独特的质量信号(表6)。对所有这些化合物都获得了推定的经验式和鉴定。
[0221] 下表6示出法地榄仁果乙酸乙酯提取物的定性GC-MS分析、经验式的阐明以及每种化合物的推定鉴定：
[0222]
[0223]
[0224] 该表6中表达的相对丰度是峰下面积的度量，表示为所有色谱峰下总面积的百分比
[0225] 甲醇叶提取物(图9)的气相色谱图具有明显少于果实乙酸乙酯提取物(图8)的峰。甲醇叶提取物色谱图中总共记录了19个独特的质量信号。
[0226] 在约11.3(甲氧基-苯基肟，22.7％相对丰度)、13.7(1-辛-3-醇，2.4％相对丰度)、14.4(2-(1,1-二甲基乙氧基)-乙醇，27.7％相对丰度)、19.5(2-甲基-2-苯基-环氧乙烷，
11.4％相对丰度)和21.5分钟(3,5-二甲基苯甲醛，15.6％相对丰度)处存在几个主要峰。
11.4％相对丰度)和21.5分钟(3,5-二甲基苯甲醛，15.6％相对丰度)处存在几个主要峰。
[0227] 在整个色谱图中还可见几个小峰。在十九个独特的质量信号中，对这些化合物中的十六种获得了推定经验式和鉴定。
[0228] 下表7示出甲醇法地榄仁叶提取物的定性GC-MS分析、经验式的阐明以及每种化合物的推定鉴定。
[0229] 表7
[0230]
[0231]
[0232] 表7中表示的相对丰度是峰下面积的度量，表示为所有色谱峰下总面积的百分比。
[0233] 最有效的炭疽芽孢杆菌生长抑制法地榄仁提取物(果实乙酸乙酯和甲醇叶提取物)的定性GC-MS顶空分析鉴定出许多感兴趣的化合物。
[0234] 值得注意的是呋喃化合物1-(2-呋喃基)-乙酮(图10a)和乙基2-(5-甲基-5-乙烯基四氢呋喃-2-基)碳酸酯(图10b)的存在。硝基呋喃具有特别深入研究的抗微生物机制，其经由抑制核酸合成而起作用。
[0235] 类似地，已知合成呋喃衍生物(通过添加若丹宁部分进行修饰)是一组多药抗性细菌生长的有效抑制剂，对某些种类的MIC值低至2μg/mL。
[0236] 尚不知存在于法地榄仁提取物中的两种呋喃衍生物的抗菌活性的报道，并且有关的是两种呋喃衍生物可能有助于本发明提取物的有效性。
[0237] 其他植物化学类别也可能有助于这些提取物的生长抑制特性。植物化学筛选表明，法地榄仁提取物中存在多酚类、类黄酮、皂角苷和萜。
[0238] 在这些研究中的每一项中，在法地榄仁提取物中均检测到了没食子酸(图5c)和鞣花酸(图5d)及其甲基化衍生物、诃子次酸(图5e)、没食子酰基邻苯三酚(图5f)、柯里拉京(图5g)、石榴皮鞣素(图5h)、栗木鞣花素(图5i)和诃子鞣酸(图5j)。这些单宁酸对多种细菌均具有有效的广谱抑制生长活性。
[0239] 没食子单宁具有特别深入报道的抑制特性。它们通过多种机制起作用，包括与细胞表面蛋白相互作用以及通过与细胞内酶的相互作用。
[0240] 鞣花单宁也与细胞蛋白相互作用并诱导细菌细胞壁破坏。
[0241] 假定地鉴定出白藜芦醇(图10k)和糖基化白藜芦醇衍生物云杉新苷(图10l)、单硫酸二乙基己烯雌酚(图10m)和康普瑞汀A1(图10n)。康普瑞汀A1的鉴定特别令人感兴趣，因为康普瑞汀由于其有效的阻断癌细胞进展并通过结合细胞内微管蛋白诱导细胞凋亡从而破坏微管形成的能力，因此最近引起了人们的广泛关注。
[0242] 图10(10a-n)示出(a)1-(2-呋喃基)-乙酮、(b)乙基2-(5-甲基-5-乙烯基四氢呋喃-2-基)碳酸酯、(c)没食子酸、(d)鞣花酸；(e)诃子次酸、(f)没食子酰基邻苯三酚、(g)柯里拉京、(h)石榴皮鞣素、(i)栗木鞣花素、(j)诃子鞣酸、(k)白藜芦醇、(l)云杉新苷、(m)单硫酸二乙基己烯雌酚、(n)康普瑞汀A1的相应化学结构。
[0243] 在法地榄仁提取物中还鉴定出几种重要的萜类。
[0244] 除法地榄仁乙酸乙酯叶提取物外，此处报道的发现表明法地榄仁提取物对旧金山卤虫无节幼体无毒，LC50值基本上>1000μg/mL。
[0245] 对卤虫无节幼体的LC50值大于1000μg/ml的提取物被定义为无毒的。甚至是引起明显死亡的乙酸乙酯叶提取物，由于中等的LC50值，也被认为是低到中等毒性。
[0246] 尽管毒性研究表明这些提取物可安全地用作炭疽芽孢杆菌生长抑制剂，但仍需要使用人细胞系进行研究以进一步评估这些提取物的安全性。
[0247] 法地榄仁提取物作为贾第鞭毛虫增殖的抑制剂和/或贾第鞭毛虫病的控制。
[0248] 通过特定但非限制性的实例的方式，下文中将描述法地榄仁提取物和纯化合物对十二指肠贾第鞭毛虫增殖的抑制。应当理解，本发明的一种或多种形式不限于仅十二指肠贾第鞭毛虫(又名兰伯氏贾第鞭毛虫和肠贾第鞭毛虫)的控制或抑制，而是其他贾第鞭毛虫和微生物/细菌菌株的控制或抑制。
[0249] 已经测试了法地榄仁提取物和纯化合物对诸如十二指肠贾第鞭毛虫滋养体的三种菌株的抑制活性，以百分比未处理的对照物测量，如通过图12所示的测试结果中的实例所示。
[0250] 已经研究了在法地榄仁果实提取物中鉴定出的具有有效十二指肠贾第鞭毛虫生长抑制活性的一组11种化合物的抑制十二指肠贾第鞭毛虫增殖的能力。
[0251] 11种化合物中的8种抑制所有三种十二指肠贾第鞭毛虫菌株的生长。
[0252] DPGA是最有效的抗贾第化合物，IC50值低至126μM(38mg/mL)。值得注意的是，DPGA以与甲硝唑敏感菌株所确定的类似的效力抑制甲硝唑抗性十二指肠贾第鞭毛虫菌株。
[0253] 此外，当与抗坏血酸联合测试时，DPGA的效力大大增强，对于甲硝唑敏感十二指肠贾第鞭毛虫菌株约为17μM(5mg/mL)，而对于抗性菌株约为40μM(12mg/mL)。
[0254] 还发现法地榄仁丹宁(没食子酸和诃子次酸)是十二指肠贾第鞭毛虫生长的抑制剂，当与抗坏血酸联合测试时，具有增强的活性水平。
[0255] 所有测试的化合物(及其与抗坏血酸的组合)均显示出低毒性，并且所有化合物均符合Lipinski的5规则(rules of 5)，几乎没有违反，表明它们作为用于治疗和预防贾第鞭毛虫病的药物先导物和化学疗法的潜力。
[0256] 在所有具有生长抑制活性的提取物中鉴定出嘌呤类似物(图11a)。
[0257] 有趣的是，许多研究已报道十二指肠贾第鞭毛虫不能合成自己的嘌呤或嘧啶核苷酸，并且依赖补救途径为它们提供核苷酸以进行核酸合成。
[0258] 此外，十二指肠贾第鞭毛虫不能在嘌呤核苷酸之间相互转换，因此需要正确的嘌呤核苷酸进行复制。实际上，嘌呤类似物抑制十二指肠贾第鞭毛虫的生长，并已被强调为贾第鞭毛虫病的潜在化学治疗剂。
[0259] 图11a至图11k示出了在抗增殖的甲醇和水性法地榄仁果实提取物中报道的化合物的相应化学结构：(a)嘌呤；(b)没食子酸；(c)诃子次酸；(d)核糖酸内酯；(e)抗坏血酸；(f)葡糖酸内酯；(g)葡萄糖庚酸-1,4-内酯；(h)奎尼酸、(i)eujavonic acid；(j)5-(4-羟基-2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酸(HMDP)；(k)2,3-二羟基苯基B-D-吡喃葡糖苷糖醛酸(DPGA)。
[0260] 注意到在生物活性的法地榄仁提取物中有大量的天然单宁，其中特别是高水平的没食子酸(图11b)和诃子次酸(图11c)。
[0261] 没食子单宁经由结合细胞表面脂磷壁酸和富含脯氨酸的膜蛋白，以及通过抑制葡萄糖基转移酶来抑制多种微生物种类的生长。
[0262] 法地榄仁提取物中存在的核糖酸内酯(图11d)、抗坏血酸(图11e)、葡糖酸内酯(图11f)和葡萄糖庚酸-1,4-内酯(图11g)作为内酯部分具有价值，因为当前使用的抗贾第化疗药物中成许多是含内酯的化合物，尤其是内酯取代的硝基咪唑(例如甲硝唑、塞克硝唑、替硝唑、奥硝唑和阿苯达唑)。
[0263] 含有内酯部分的化合物被理解为阻断贾第脂质脱酰反应/再酰化反应途径，从而抑制增殖。由于贾第鞭毛虫属不能通过新途径合成脂质，所以它们必须使用宿主胃肠道前体脂质通过脱酰反应/再酰化反应合成膜和细胞脂质。
[0264] 因此，可以理解，在法地榄仁提取物中含有内酯的化合物经由抑制脂质代谢途径而有助于十二指肠贾第鞭毛虫的生长抑制。
[0265] 已经注意到在法地榄仁提取物中的奎尼酸(图11h)。取代的奎尼酸化合物可以阻断十二指肠贾第鞭毛虫细胞中的亮氨酰-tRNA合酶活性。由于氨酰基-tRNA合酶对于通过将正确的氨基酸连接到每个tRNA上来翻译遗传密码至关重要，因此亮氨酰-tRNA合酶活性的阻断导致无效的Leu-tRNA产生，从而抑制蛋白质合成。因此，可以理解奎尼酸也有助于法地榄仁果实提取物的抗贾第活性。
[0266] Eujavonic acid(图11i)、5-(4-羟基-2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酸(HMDP)(图11j)和2,3-二羟基苯基B-D-吡喃葡糖醛糖醛酸(DPGA)(图11k)是另外的抗贾第化合物。
[0267] 此外，由于法地榄仁果实具有相对高的抗坏血酸含量，所以抗坏血酸可以有效地改变和/或增强各个组分的生长抑制活性。
[0268] 因此，还评估了所有化合物与抗坏血酸的组合，以量化其对这些组分活性的影响。
[0269] 法地榄仁果实提取量和定性植物化学筛选。
[0270] 用甲醇和去离子水提取1g的干燥的法地榄仁果实，得到相对高质量的干燥提取材料(甲醇提取物和水性提取物分别为370μg/mL和290μg/mL)。将干燥的提取物重悬于10mL的去离子水(含有0.5％DMSO)中，得到下表8所示的提取物浓度。
[0271] 表8
[0272]
[0273] +++表示反应大；++表示反应中等；+表示反应低；-表示没有反应。值表示三个实验的平均IC50或LC50值，每个实验进行三次重复测定。M＝甲醇提取物；W＝水性提取物。
[0274] 定性植物化学研究(表8)示出，两种提取物均含有高水平的酚类和类黄酮，以及中等至高水平的单宁。皂角苷也以低至中等水平存在。三萜和生物以低水平存在。
[0275] 当以300μg/mL进行测试时，几种纯法地榄仁果实化合物也显著地抑制十二指肠贾第鞭毛虫滋养体增殖(图12)。
[0276] 注意到DPGA是一种特别好的生长抑制剂，可阻止100％的滋养体生长。
[0277] DPGA与对敏感菌株一样对甲硝唑抗性十二指肠贾第鞭毛虫菌株有效，表明DPGA可以通过与甲硝唑不同的机制阻止贾第生长。
[0278] 几种其他化合物也显著地抑制十二指肠贾第鞭毛虫滋养体增殖，尽管功效较低。没食子酸(约50％抑制增殖)、诃子次酸(约40％抑制)、奎尼酸(约30％抑制)、eujavonic acid(约20％抑制)和5-(4-羟基-2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酸(约20％抑制)均抑制了所有三种十二指肠贾第鞭毛虫菌株，包括甲硝唑抗性菌株。
[0279] 其他法地榄仁果实化合物中的两种(抗坏血酸，约15％抑制；葡萄糖庚酸内酯，约30％抑制)也显著抑制了甲硝唑敏感十二指肠贾第鞭毛虫菌株，但却是甲硝唑抗性十二指肠贾第鞭毛虫菌株的无效抑制剂。
[0280] 嘌呤、核糖酸内酯和葡糖酸内酯并未显著影响任何十二指肠贾第鞭毛虫菌株的生长。
[0281] 甲醇和水性法地榄仁果实提取物显示出有效的抑制活性，每种抑制100％的贾第生长(与未处理的对照物相比)。
[0282] 通过确定抑制十二指肠贾第鞭毛虫生长50％(IC50)所需的浓度进一步评估提取物的功效。水提取物是十二指肠贾第鞭毛虫增殖的特别好的抑制剂，IC50为143μg/mL。甲醇提取物，虽然没那么有效，但也显示出良好的抗贾第活性(704μg/mL)。
[0283] 图12：以百分比未处理的对照物测量的法地榄仁提取物和纯化合物对三种十二指肠贾第鞭毛虫滋养体菌株的抑制活性。NC＝阴性对照物；M＝甲醇提取物；W＝水提取物；1＝嘌呤；2＝没食子酸；3＝诃子次酸；4＝核糖酸内酯；5＝抗坏血酸；6＝葡糖酸内酯；7＝葡萄糖庚酸内酯；8＝奎宁酸；9＝eujavonic acid；10＝HMDP；11＝DPGA；PC＝甲硝唑对照物(50μg/ml)。结果表示为三个独立的实验(内部一式三份测定)的平均值±SEM(n＝9)。*、#和∧分别表示与对绵羊S2、ATCC 203333和ATCC PRA-251十二指肠贾第鞭毛虫菌株的未处理对照物显著不同的结果(p<0.01)。
[0284] 纯法地榄仁化合物的IC50量化
[0285] 在一系列浓度下进一步测试了纯法地榄仁化合物的抗增殖活性，以确定针对十二指肠贾第鞭毛虫滋养体的IC50值(表9)。
[0286]
[0287] 结果表示为三个独立实验(内部一式三份测定)的平均值(n＝9)。相互作用类别为协同(∑FIC50≤0.5)、累加(∑FIC50>0.5-1.0)、独立(∑FIC50>1.0-4.0)或拮抗(∑FIC50>14.0)，NA＝未得到结果。
[0288] 大多数化合物仅产生中等至低的十二指肠贾第鞭毛虫抑制活性，IC50值>1000μg/mL。DPGA是一种比其他化合物显著更有效的十二指肠贾第鞭毛虫增殖抑制剂，不同菌株的IC50值范围为38-72μg/mL(126-238μM)。有趣的是，DPGA是水性和甲醇法地榄仁提取物的相对较少组分，占提取物总质量的大体上小于0.1％(结果未示出)，并且因此单独DPGA不能说明粗水性提取物(143μg/mL)的强活性。取而代之的是，提取物中的其他化合物可能会协同加强抗增殖法地榄仁化合物中的一种或多种的活性。
[0289] 由于法地榄仁果实具有很高的抗坏血酸含量，所以抗坏血酸可能与法地榄仁化合物中的一种或多种具有协同相互作用。因此，将与抗坏血酸组合进行进一步研究这些化合物，以鉴定可能发生的任何相互作用。
[0290] 法地榄仁化合物和抗坏血酸对十二指肠贾第鞭毛虫增殖的联合作用[0291] 在法地榄仁提取物组分和抗坏血酸之间观察到一系列的联合作用(表9)。
[0292] 特别值得注意的是，两种组合产生协同作用(没食子酸+抗坏血酸；DPGA+抗坏血酸)。与任一化合物单独的活性相比，一些组合产生的活性增加约10倍。DPGA与抗坏血酸组合对绵羊S2十二指肠贾第鞭毛虫菌株的活性增加特别值得注意，IC50值从单独的47μg/mL(156μM)降至与抗坏血酸组合的5μg/mL(17μM)。对甲硝唑敏感参考十二指肠贾第鞭毛虫菌株(ATCC203333)，也记录到类似的效力提高，IC50从单独的38μg/mL(126μM)降至与抗坏血酸组合的6μg/mL(20μM)。尽管对甲硝唑抗性十二指肠贾第鞭毛虫菌株(ATCC PRA-251)的效力略低，但DPGA+抗坏血酸组合也产生了临床上相关的IC50值，为12μg/mL(40μM)。对于没食子酸+抗坏血酸组合对所有十二指肠贾第鞭毛虫菌株，也记录到效力的大幅提高。值得注意的是，对绵羊S2菌株的IC50从单独的1150μg/mL(6795μM)降至与抗坏血酸组合的146μg/mL(858μM)。这种组合对其他十二指肠贾第鞭毛虫菌株也是协同的。有趣的是，甲硝唑敏感和抗性十二指肠贾第鞭毛虫菌株之间的IC50值类似，两者的IC50值为约250μg/mL(1469μM)。
[0293] 大部分其他组合都产生累加效应。因此，这些组合在治疗贾第鞭毛虫病方面也可能是有益的，因为它们产生的功效高于当分开使用时的任一组分。
[0294] 另一组合(葡萄糖庚酸内酯)是非相互作用的。尽管这种组合并不能提供优于单独任一化合物的任何显著治疗效果，但是这些组分也不会拮抗彼此的作用，因此，如果同时施用这两种组分，不会不利。值得注意的是，没有一种组合产生拮抗作用。
[0295] 没食子酸和抗坏血酸之间的协同相互作用
[0296] 由于没食子酸/抗坏血酸组合引起协同作用(表9)，因此使用等效线图分析法在一系列没食子酸:抗坏血酸比率下进一步检查了该组合，以确定获得协同作用的理想比率。
[0297] 对所有三种十二指肠贾第鞭毛虫菌株都可见类似的敏感性图谱。
[0298] 在所有情况下，数据与没食子酸轴比与抗坏血酸酸轴更紧密相关，表明抗增殖活性最依赖于没食子酸。
[0299] 然而，尽管含有30％-60％之间的没食子酸的比率引起协同反应，但更低(≤20％)和更高的比率(≤70％)通常产生累加作用。
[0300] 由于这些反应大于单独各个组分中的任一个，因此它们对于贾第鞭毛虫病的治疗将是有益的。
[0301] 由于使用ΣFIC50公式确定协同作用，因此将协同作用定义为比单独各个组分大至少4倍的反应。因此，与其他比率相比，引起协同反应的比率更优选作为抗贾第疗法。因此，用于治疗贾第鞭毛虫病的理想的没食子酸/抗坏血酸比率可优选包括含有30％-60％没食子酸的组合。
[0302] 如通过图13a至图13c所示，针对(a)绵羊S2、(b)参考甲硝唑敏感(ATCC203333)和(c)参考甲硝唑抗性(ATCC PRA-251)十二指肠贾第鞭毛虫菌株以各种比率测试的没食子酸和抗坏血酸组合的等效线图。GA＝没食子酸；AA＝抗坏血酸。结果代表三个独立实验的平均FIC50值，每个实验由3次重复组成(即每个比率9个数据点)。位于0.5/0.5线上或下方的比率被认为是协同的(ΣFIC50≤0.5)。0.5/0.5和1.0/1.0线之间的任何点都被视为累加的(ΣFIC50>0.5-1.0)。
[0303] 2,3-二羟基苯基-B-吡喃葡糖醛糖醛酸(DPGA)和抗坏血酸之间的协同相互作用[0304] 当与抗坏血酸组合测试时，DPGA也引起协同十二指肠贾第鞭毛虫生长抑制(表9)。
[0305] 生长抑制活性和DPGA轴之间的关联甚至比没食子酸更为明显(图14a至图14c)，表明对于该组合的抗增殖活性，这种化合物比抗坏血酸重要。这与化合物的IC50数据一致，其报道DPGA的IC50为抗坏血酸的约5％(表9)。因此，当分开测试组分时，DPGA是比抗坏血酸有效约20倍的十二指肠贾第鞭毛虫生长抑制剂。有趣的是，含有≤60％DPGA的所有组合均产生对甲硝唑敏感十二指肠贾第鞭毛虫菌株的协同的生长抑制(图14a和图14b)。因此，需要≥40％的抗坏血酸来有效地协同加强DPGA的作用。
[0306] 针对甲硝唑抗性十二指肠贾第鞭毛虫菌株的生长抑制等效线图显示出不同的趋势(图14c)。大部分组合比率产生对抗该菌株的累加相互作用。这些比率对于治疗贾第鞭毛虫病仍将是有益的，因为该组合的生长抑制活性大于任一单独组分的生长抑制活性。然而，尽管对于这些比率，治疗功效得到提高，但提高幅度相对较小。相比之下，含有30％-50％DPGA的组合具有显著提高的功效(与单独测试的化合物总和相比，效力提高≥4倍)。因此，对于甲硝唑抗性十二指肠贾第鞭毛虫菌株，治疗和预防贾第鞭毛虫病的理想协同比率确定为30％-50％DPGA与抗坏血酸组合。
[0307] 图14a至图14c示出了针对(a)绵羊S2、(b)参考甲硝唑敏感(ATCC203333)和(c)参考甲硝唑抗性(ATCC PRA-251)十二指肠贾第鞭毛虫菌株以各种比率测试的DPGA和抗坏血酸组合的等效线图。DPGA＝2,3-二羟基苯基-B-吡喃葡糖醛糖醛酸；AA＝抗坏血酸。结果代表三个独立实验的平均FIC50值，每个实验由3次重复组成(即每个比率9个数据点)。位于0.5/0.5线上或下方的比率被认为是协同的(ΣFIC50≤0.5)。0.5/0.5和1.0/1.0线之间的任何点都被视为累加的(ΣFIC50>0.5-1.0)。
[0308] 毒性的量化
[0309] 使用卤虫无节幼体致死率测定法(ALA)和人皮肤成纤维细胞测定法(HDF)，在一系列浓度下筛选所有提取物(表10)。
[0310] 为了进行比较，还测试了参考毒素重铬酸钾(1000μg/mL)。没有报道嘌呤、核糖酸内酯、葡糖酸内酯、葡萄糖庚酸内酯、奎尼酸、eujavonic acid、HMDP或DPGA的LC50值，因为在这两种测定中测试的所有浓度的这些化合物的死亡率均低于50％。
[0311] 因此，所有这些化合物都被认为是无毒的。相比之下，在24小时暴露后的两种测定中，没食子酸、诃子次酸和抗坏血酸均显示出明显的毒性。然而，值得注意的是，在我们的研究中检测到的毒性通常与酸性组分有关。酸性pH可以抑制线粒体蛋白质合成的速率，并且可能对卤虫无节幼体和HDF细胞的生长和发育致命。确实，先前的研究已经报道，高抗坏血酸的提取物可以提供错误的毒性确定。因此，该测定法可能高估了这些化合物的毒性。
[0312] 表10：通过卤虫致死率测定法(ALA)和人皮肤成纤维细胞(HDF)细胞毒性测定法确定的单独以及与抗坏血酸组合的法地榄仁化合物的毒性。
[0313]
[0314] PC＝重铬酸钾；CND＝无法确定，因为在任何测试浓度下，死亡率或抑制％均不超过50％；NT＝未测试。
[0315] 治疗指数和类药物特性
[0316] 为了确定法地榄仁化合物作为治疗剂的适用性，参照Lipinsky的5规则检查了它们的类药物特性。
[0317] 所有化合物均具有≤10个H键受体，分子量<500Da，辛醇-水系数≤5。大部分化合物还具有≤5个H键供体。
[0318] 违反此规则的唯一化合物(诃子次酸和DPGA)包括具有最大十二指肠贾第鞭毛虫抗增殖活性的化合物(DPGA)，单独和与抗坏血酸组合。DPGA和诃子次酸都具有6个H键供体，并且因此比Lipinsky的5规则多出1个H键供体。然而，考虑到它们在所有其他类别中的一致性，这些化合物被认为具有良好的类药物特性。
[0319] 还计算了纯化合物及组合的治疗指数(TI)。我们无法计算出嘌呤、核糖酸内酯、葡糖酸内酯、葡萄糖庚酸内酯、奎尼酸、eujavonic acid、HMDP和DPGA的TI，因为这些化合物在任何测试浓度下均未显示出毒性。然而，除DPGA外，这些化合物通常仅表现出低的十二指肠贾第鞭毛虫抗增殖活性，并且因此在治疗上几乎没有用处。对于DPGA，这种缺乏明显的毒性表明该化合物具有高的TI，并且因此是有希望的药物先导物。如果将测试DPGA的剂量范围扩展以测试更高的浓度来确定LC50，则TI将相对的高。
[0320] 对于没食子酸的TI，注意到一个有趣的趋势。单独这种化合物的TI由于其表观毒性而相对的低(0.3)，表明可能其治疗潜力有限。然而，当与抗坏血酸组合确定没食子酸的TI时，它已大大提高到2.3。因此，有可能的是，抗坏血酸与DPGA组合可以提供双重好处：它可以协同加强DPGA的抗增殖活性，并保护细胞免受其毒性。
[0321] 表11：单独的以及与抗坏血酸组合的法地榄仁化合物的类药物特性和治疗指数。
[0322]
[0323]
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 包括鞣花酸化合物的组合物 | 2020-05-08 | 934 |
| 坚果鞣花酸制备方法及应用 | 2020-05-11 | 211 |
| 一种同时提高鞣花酸和山柰酚-3-O-芸香糖苷含量的覆盆子药材加工方法 | 2020-05-17 | 964 |
| 凝固时间测定用试剂及其制造方法、试剂盒及凝固时间的测定方法 | 2020-05-11 | 472 |
| 利用ABTS-UPLC法同时评价桃金娘根中没食子酸和鞣花酸的抗氧化性和含量的方法 | 2020-05-12 | 983 |
| 一种没食子酸和超声辅助金枪鱼皮蛋白-糖膜的制备方法 | 2020-05-14 | 127 |
| 对角蛋白物质提供伤害保护和感官益处的组合物和处理 | 2020-05-17 | 802 |
| 覆盆子山柰酚-3-O-芸香糖苷及鞣花酸含量预测的方法 | 2020-05-17 | 137 |
| 一种含高山火绒草提取物的美白修护面膜及其制备方法 | 2020-05-11 | 843 |
| 一种碳纤维表面聚合改性的方法 | 2020-05-16 | 38 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
鞣花酸热门专利
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈