【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】α−リポ酸は、化学的には、
１，２−ジチオラン−３−ペンタン酸、５−(１，２−
ジチオラン−３−イル)−吉草酸、５−３−(１，２−ジチオアニル)−ペンタン酸と称される。 このα−リポ酸は、１個のキラルＣ−原子を有し、かつ２種の鏡像異性体形を現わし、かつ生理学的に植物中で、細菌中で並びに哺乳動物中で産出される。 これは、ミトコンドリア多酵素複合体、例えば、ピルベートデヒドロゲナーゼ、α
−ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ及び分枝鎖アミノ酸のデヒドロゲナーゼ中で補酵素の機能を有する。 物質代謝においてα−リポ酸は、酸化された形(ジスルフィド橋)から、２個の遊離のＳＨ−基を有する還元されたジヒドロ形に移行されうる。 この両方の形は、著しい抗酸化作用を有する（例えば、Kuklinski et al., 1991;
Packer, 1993）。 レドックス対であるジヒドロリポ酸／
α−リポ酸は、更に、金属キレート化特性を有する。 近年、α−リポ酸のグルコース輸送への影響も研究されている(Bashan et al., 1993)。 ドイツ連邦共和国においては、α−リポ酸は、１９６６から肝疾患の治療のために、菌中毒の際に、並びに末梢ポリニューロパシーのための薬剤として使用されている。

【０００２】

【従来の技術】臨床適用のための血液貯蔵物は、ＢＧＡ
ガイドライン（Richtlinien des BGA；ＢＧＡの公表物、Bundesgesundheitsblatt 2/92, Richtlinien zur B
lutgruppenbestimmung und Bluttransfusion 参照)、米国ガイドライン(AmerikanischenGuideline; Standards
for Blood banks and Transfusion services, 14th Edi
tion 1991, by Standards Committe, American Assosia
tion Of Blood Banks, Virginia参照）に従い製造される。

【０００３】多様な血液貯蔵物の種類は、様々な会合の合意によるガイドライン(Arzneimittelbrief, 1994参照)により、次のように記載される: １． 細胞含有血液−及び血液成分貯蔵物、例えば ：血液貯蔵物、新鮮血液貯蔵物、赤血球濃縮物、精製赤血球濃縮物、白血球微含赤血球濃縮物、白血球不含赤血球濃縮物、凍結冷却貯蔵赤血球濃縮物、血小板多含血漿、血小板濃縮物、白血球濃縮物 ２． 血漿及び血漿分画物 ：この場合、該当しない 赤血球濃縮物は、血漿が充分に除去された血液貯蔵物である。 今日、これらは、例えば、急性失血及び慢性貧血の際の赤血球代替のための標準製剤である(Welch, G.,
et al., 1992)。 精製赤血球濃縮物は、白血球微含（貯蔵物あたり、＜１．２×１０ ⁹ ）であり、かつＩｇＡ−
欠乏症候群及びＩｇＡ−抗体を有する患者の際に、補体−関与による自己免疫溶血性貧血の際に、かつ発作性夜間性血色素尿の際に（まれに）使用される。 凍結貯蔵された血液貯蔵物は、解凍及び凍結保護剤の除去の後に白血球不含とみなされ、かつ赤血球濃縮物と同様に適用される。

【０００４】最適貯蔵条件は、前記のガイドラインにより規定されており(Stangel W., 1988)、その際、必要最小限の要求がここで定義されている。 貯蔵期間は、製造方法に依存しており、製造者により期限日付で記載される。 赤血球含有血液貯蔵物の貯蔵は、 温度に依存しており、３０〜６０分間で冷却を達成すべきであり、かつ冷却の遅滞の場合には、約６時間で、２，３−ＤＰＧの損失が現われる。 糖分解の中間体として、２，３−ジホスホグリセレートが赤血球中に存在し、酸素輸送の調節の際に重要な作用を有する。 デスオキシヘモグロビン（酸素不含）は２，３−ＤＰＧと結合し、これにより酸素親和性は著しく低下する。 肺中のアルカリ性環境下では、
２，３−ＤＰＧはヘモグロビンから解離し、これによりＯ ₂での負荷に関する親和性が上昇する。 ２，３−ＤＰ
Ｇ−含分は、古い血液貯蔵物中では低下し、これと相応してデスオキシヘモグロビンは減少し、かつ酸素がかなり、堅固に結合する。 既に１９５４年に、 酸素−解離曲
線は既に１週間後に、組織中のこれらの赤血球が新鮮なものと同量の酸素を遊離しない程、左にずれることが初めて確認された。 輸血の後に、この左へのずれは、２４
〜４８時間で正常化する。 この左へのずれは、還元されたグルタチオンの減少に表れるグリシド−物質代謝の拒絶の結果として表れた。 還元されたグルタチオンは、グルタチオン還元酵素とＮＡＤＰＨとの共同作用下で生ずる。 その結果、前記の貯蔵の間の左へのずれは、２，３
−ＤＰＧの損失で明らかである。 ＣＰＤ−血液は、ＡＣ
Ｄ−血液に比べ、解離曲線のより僅かな左へのずれを示し；このことは、より高い２−ＤＰＧ−濃度で明らかになる。 赤血球のＡＴＰ−濃度は、貯蔵に伴い減少し、かつこれに並行して細胞膜の脂質損失、球状赤血球症及び細胞の弾性率の上昇が現れる。 受血生物への輸血後の赤血球の正常な生存能力は、血液貯蔵の結果を測定しうる重要なパラメーターである。 赤血球貯蔵の値の尺度として、今日、受血生物循環中で２４時間より長く生残る赤血球のパーセントが記載される。 貯蔵溶液及び貯蔵条件に関する、現在有効な規定は、輸注された細胞の少なくとも７０％が、２４時間後に受血生物循環中で検出可能であるべきであると要求している。 貯蔵時間に依存して低下する赤血球の凝集即応性 (Aggregationsbereitschaf
t；ルーロー−形成;Rouleau-Bildung)も、試験管中で検出すべきである。 貯蔵期間は、ＡＢＯ式及びＲｈ式血液
型には影響を及ぼさないが、貯蔵物の進行性老化に伴うルイス式及びＰ式血液型の反応性損失が記載されている。 血液貯蔵のための重要な前提は、 血液凝固の阻止である(Stangel W., 1988)。 これは、今日では、クエン酸ナトリウム及びクエン酸の混合物により達成されている。 実験は、 ４℃の温度で、かつ６．８〜７．２のｐＨ
で、ＡＴＰ−濃度が安定に保持されることを示した。 それゆえ、クエン酸で酸性にされたグルコース−クエン酸塩溶液の導入により、血液貯蔵物の有効期限を２１日まで延長することができた。 ｐＨ−値の安定のために、Ａ
ＣＤ−貯蔵物の場合には７．０〜７．１のｐＨ、及びＣ
ＰＤ−及びＣＰＤＡ−１−貯蔵物の場合には７．１〜
７．２のｐＨを有する貯蔵溶液（安定剤）を使用する。
臨床分野では、目下、本特許出願人の実験でも使用されているＣＰＤＡ ₁及びＳＡＧ−Ｍが、安定剤溶液として使用されている。

【０００５】前記のものとは、同じ内容物の異なる濃度により、又は僅かに異なる組成により異なるその他の安定剤溶液も公知である(Meryman et al.,（１９９０）の表１参照）：

【０００６】

【表１】

【０００７】この表は、この文献中に記載の溶液の組成をまとめている。 重量オスモル濃度は、ミリオスモル(m
illiosmole)で示されており、かつ非−浸透成分のみに関し、グルコースは、赤血球中に浸透するものとみなされている［１２］。

【０００８】本発明との関連で、溶液ＣＰＤＡ−１と並んで安定剤溶液ＳＡＧ−Ｍを使用する：ｍｇ／蒸留水１
００ｍｌ、安定剤ＣＰＤＡ−１及びＳＡＧ−Ｍ使用下での使用赤血球濃縮物の製法図１も参照のこと： 血液貯蔵物のための出発ｐＨ値７．４２ ＮａＣｌ ８７７ グルコース無水物 ８１９ アデニン １６．９ マンニトール ５２５ このように処理された赤血球濃縮物は、可能貯蔵時間３
５日と記載されている。 American Association of Bloo
d Banksによれば、赤血球濃縮物に、この貯蔵期間で８
０％未満のヘマトクリットが要求されている(Stangel
W., 1988)。

【０００９】凍結法では、赤血球−濃縮物を前記と同様に製造し、次いで凍結保護物質（臨床適用のためにはグリセリン）を添加し、−１９６℃で低温凍結し、次いで−８０℃で貯蔵する(Sputtek and Koerber in: Fuller
BJ and Grout BWW,1991;)。 目下試験中である新規開発では、ヒドロキシエチルでん粉を、凍結保護剤として使用している（窒素−気相中、−１２０〜−１４０℃
で貯蔵；Langer et al., 1993及びSputtek et al.,199
2)。

【００１０】標準法により得られたヒトの給血血液を自動的な方法で、”赤血球−濃縮物（４℃）”及び”新鮮
-凍結血漿”の２種の成分に分離する。このために使用されるオプティプレスシステム(Optipress-System)は、
血小板と白血球とを分離する。

【００１１】手術処置もしくは緊急時の充分な供給を保証するための血液貯蔵物の備蓄は古いが、非常に今日的で、かつ長く満足しうるようには解決されていない問題を有している。 貯蔵された赤血球の長期間安定性もしくは機能性と並んで、輸血後に、低酸素性及び虚血性受血者組織が問題となる。 赤血球の貯蔵の際に、機能障害から血球溶解にまで至る膜脂質及び構造−もしくは機能タンパク質の過酸化も起こる。

【００１２】血液の貯蔵は、その機能低下（例えば、赤血球の酸素放出、生存期間及び流動性）となって表れる赤血球の障害も伴う。 このことは、輸血が必要な患者にとっては非常に重要であり、かつ給血、血液確保、及び貯蔵費用のための多くの費用を意味している。

【００１３】多様な精製工程により、かつ凍結融解法により、イオン−及び水分代謝のかなりの障害並びにＡＴ
Ｐ−及び２，３−ＤＰＧ−含分の減少が生ずる。 これにより溶血率の割合の上昇が生じ(Sputtek et al., 1992;
Langer et al., 1994)、かつ血液の粘弾性の悪化に至る(Langer et al., 1993)。 赤血球の機能減少及び構造障害は、特に、例えば、マロンジアルデヒドにより測定することができる膜脂質の過酸化に起因する(Pfafferot
et al., 1982)。

【００１４】

【発明が解決しようとする課題】従って、課題は、同種及び自己(autolog)の赤血球濃縮物の貯蔵を臨床での需要のために改良することである。

【００１５】この課題は、本発明により、α−リポ酸及び／又はその鏡像異性体及び／又はその誘導体を、赤血球−液状貯蔵の際の同種かつ自己の赤血球濃縮物用の添加剤として、又は赤血球−凍結貯蔵の際の同種かつ自己の赤血球濃縮物用の添加剤として使用することにより解決した。 その際、α−リポ酸及び／又はその鏡像異性体及び／又はその誘導体を、４℃で赤血球−液状貯蔵する際に同種及び自己の赤血球濃縮物に添加すること、及び赤血球−凍結貯蔵する際に添加剤として、 ａ）−７０℃〜−９０℃（グリセリン−法）で、かつ ｂ）−１９６℃／−１４０℃の液体窒素下（気相−Ｈａ
ｅｓ法）で、同種及び自己の赤血球濃縮物に使用することも本発明の目的である。

【００１６】赤血球−凍結貯蔵する際に、Ｄ，Ｌ−α−
リポ酸及び／又はその鏡像異性体及び／又はその誘導体を、ヒドロキシエチルでん粉（ＨＡＥＳ）で処理されており、かつ引き続き、融解の後に、細胞−（血液）−セーバーにより後処理される同種及び自己の赤血球濃縮物用の添加剤として使用することは、本発明の有利な態様がもう１つの目的である。

【００１７】この付加的な方法により、細胞組織敗残物（及び遊離ヘモグロビン）が除去され、かつ費用のかからない赤血球濃縮物が保証される。 この有利な変法の使用は、グリセリン法でもＨａｅｓ−法でも行うことができる（上記参照）。

【００１８】本発明によれば、血液バッグ中の有利な濃度は、Ｄ，Ｌ−α−リポ酸及び／又はその鏡像異性体及び／又はその誘導体１０ミューモル〜１ミリモルであり、特に有利に、１００ミューモルである。

【００１９】本発明の意味での誘導体としては、ジヒドロリポ酸、代謝物質、例えば、６，８−ビスノル−テトラリポ酸；テトラノルリポ酸及びＤ，Ｌ−α−リポ酸の塩並びにエステル及びアミドを挙げることができる。

【００２０】安定剤ＣＰＤＡ−１及びＳＡＧ−Ｍの適用下での使用赤血球濃縮物の本発明による製法を、図１に模式的に示す。

【００２１】 本発明の方法は、次の主要な特徴もしくは
利点を示す： １． 改善された粘弾性及び上昇した２，３−ＤＰＧ−含分に基づく赤血球機能性の改善 ２． 貯蔵下での赤血球生存期間の延長 ３． 貯蔵期間の延長 ４． 正常な赤血球機能の回復 α−リポ酸及び／又はその鏡像異性体及び／又はその誘導体を、赤血球−液状貯蔵物（４℃）の貯蔵の前に、同種及び自己の赤血球濃縮物に、並びに−７０℃〜−９０
℃で、かつ液体窒素−１９６℃／−１４０℃（気相）での適用で赤血球−凍結貯蔵する際に同種及び自己の赤血球濃縮物に添加することにより、本発明の前記の利点が達成される。

【００２２】一方で、α−リポ酸及び／又はその鏡像異性体及び／又はその誘導体を血液貯蔵物の貯蔵前に、本発明により添加することにより、前記の利点が達成され、他方で、記載の方法と並んで、前記の物質の使用に新規性がある。 誘導体の概念には、本発明では、殊に、
ジヒドロリポ酸、代謝物６，８−ビスノルテトラリポ酸；テトラリポ酸及びα−リポ酸の塩並びにそのエステル及びアミドが該当する。

【００２３】

【実施例】 方法ここで得られた結果は、ヒトの赤血球を用いて達成し、
その際、血液及び血液バッグのための前記に記載の従来技術に従い処理した。

【００２４】Ｄ，Ｌ−α−リポ酸及び／又はその鏡像異性体及び／又はその誘導体の作用の立証． ３のために、
生化学的立証方法と並んでシヌソイド振動性毛細管−流動測定(sinusoidalen oszillierenden Kapillar-Rheome
trie)の特殊な方法を使用した(Chmiel H., 1990)。 最も新しい方法として血液の粘弾流動特性の測定を、臨床血液流動学における赤血球の病理学的変化の測定のために使用する(例えば、動脈梗塞疾患、卒中発作及び一般的に末梢血管疾患で)。

【００２５】粘弾性の測定のために、動的流動実験を実施し、その際、時間に依存して、変形及び剪断応力を測定する（シヌソイド振動性剪断実験）。 非線状粘弾性液体としての血液は、剪断の振幅が上昇する際にη'及びη”の減少を示す。

【００２６】この場合に「例」で記載の測定のために、
振動性毛細管−流動計、ＯＣＲ−Ｄ(A. Paar, Graz, Au
stria)を使用し、その際、この方法は、円形の断面を有するガラス毛細管を通る容積流動率及び圧力勾配の同時の測定に基づく。 この粘弾性は、弾性変形（エネルギー蓄積）と粘性変形（エネルギー消耗）を区別することができる。 η”の上昇値は、強い凝集物形成及び微小循環中の血流の妨害をもたらす凝集体の形成を伴う増加性弾性の赤血球（柔軟性に乏しい）の形成を伴う硬直した細胞を示す。これらの特性は、細胞膜の状態及び前記のルーロー−形成をもたらす「橋かけ」−機構と結び付いている。 より高い剪断率でのη'の減少は、赤血球の方向及び伸長の変更並びにエネルギー消耗の減少により生じうる。 η'は、ヘマトクリット及び血漿粘度のみではなく、凝集特性及び膜の弾性特性にも依存する。

【００２７】ここで使用の物質の作用は、血液貯蔵物中で次のように明らかである： Ａ 赤血球濃縮物 １． 貯蔵期間が延びるにつれて対照血液は、粘稠性になっていくが、老化による血液粘度の上昇（動的成分ｎ'）は、ほぼ完全に抑制された。 前記の物質の粘度は、１５日後の値で停止したままであった（対照との差は、１０％以上であり、これは、老化による悪化の１０
０％の補償に相当する）。

【００２８】２． 血液粘度の弾性成分（ｎ”）は、血液細胞の弾性特性を記載している。血液貯蔵物が古くなるにつれて、血液粘度の弾性成分は高まり、これは、全体の粘度を高める。このパラメーターでは、対照物との比較差は２０％であり、かつ老化による細胞流動性の悪化は、完全に補償された。これにより、α−リポ酸の細胞と結びついた作用が、重要であることが分かる。

【００２９】３．２，３−ＤＰＧ（ジホスホグリセレート）の上昇は５０日後で、５０％。 ４． ここで使用されるα−リポ酸の添加は、他の適用での薬剤としての１０年に及ぶ使用で、その良好な認容性が証明されている。 貯蔵条件下での酸化ストレスに対する保護のための他の物質は、より僅かな効果を有するのみであり、かつ輸血後の患者の副作用と結び付いている
(Knight JA et al., 1992)。 α−リポ酸の既に公知である抗酸化作用は、全ての形で、マロンジアルデヒドの約２０％の還元をもたらした（損害の半減）。

【００３０】Ｂ 凍結貯蔵物 １． 対照物群での赤血球の凝集能(Erythrozytenaggreab
ilitaet)の値は、解凍及び再懸濁の後に、液体貯蔵１５
日後のそれに相応した。 本発明の前記の物質の添加により、凍結貯蔵された物質で、著しくより高い値（約３３
％）即ち正常範囲への一致を達成した。 マロンジアルデヒド−及び粘弾性−作用は、Ａと同様である。

【００３１】新規発明の利点 −貯蔵もしくは老化による細胞構造及び構造に関する機能（血液粘度及び細胞流動性）の変化を回避することができるか、もしくはほぼ回避することができる。 この作用は、前記の物質を可能な限り早期（貯蔵前）に、かつ損害の発生前に使用すると（前処理;Priming）、更により明らかになる。

【００３２】−更に、このような前処理−効果は、自己血漿中での再懸濁及びインキュベーション（再輸血のシミュレーション）の間にも効果を保持することが明らかである。

【００３３】−前記の物質の作用は、長い貯蔵期間（６
０日間）を経てもその反応性を保持し、かつ凍結融解法の後にも保持される。

【００３４】２，３−ＤＰＧの上昇、改良された粘弾性、添加剤として非毒性。

【００３５】−従来技術による血液貯蔵物は、約３５日後に廃棄すべきであるので（給血血液の量制限）、血液のより長い貯蔵の可能性は、ヒトへの供給を改善する。
これにより、献血は軽減され、かつ関連病院の血液供給が改善される（費用の減少）。

【００３６】−生理学的物質としてのα−リポ酸の認容性 例ケース１：赤血球−濃縮物（従来技術参照） ケース２：凍結貯蔵された赤血球（従来技術参照）

【図面の簡単な説明】

【図１】安定剤の使用下での本発明の赤血球濃縮物の製法を示す図

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヘルマン−アウグスト ヘンリヒ ドイツ連邦共和国 ヴュルツブルク シュ タインバッハタール 44 (72)発明者 ヴォルフガング ガイゼ ドイツ連邦共和国 ディプバッハ ベルク トハイマー シュトラーセ ２ (72)発明者 ハインツ ウルリヒ ドイツ連邦共和国 ニーデルンベルク バ イエルンシュトラーセ ２