一种木聚糖酶高产曲霉突变株的筛选方法
阅读：594发布：2024-02-19
专利汇可以提供一种木聚糖酶高产曲霉突变株的筛选方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种木聚糖酶高产曲霉突变株的筛选方法，主要步骤包括利用富集培养基，通过菌株的多次转接，将正突变菌株培养成为诱变样品中的优势菌株，然后通过同样剂量诱变剂处理后样品的分组实验，从每一组的样品中筛选几株木聚糖酶高产菌株，再针对所选菌株进行深入筛选。与传统突变菌株的随机筛选方法相比，本发明所用方法缩小了筛选范围，提高了筛选效率，显著提高了正突变菌株被筛选出来的几率，使正突变菌株的大批量筛选更具操作性。，下面是一种木聚糖酶高产曲霉突变株的筛选方法专利的具体信息内容。
1.一种木聚糖酶高产曲霉突变株的筛选方法，其特征在于：该方法的具体步骤如下：
1)以土曲霉(Aspergillus terreus)菌株FC7-1作为出发菌株，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.11657,分别取一定量孢子悬液，经不同剂量诱变剂进行处理；
2)将经诱变剂处理的各孢子悬液平均分为10份，以5-10％的接种量分别接种到富集培养基，25-32℃，静止培养12-48h后再次转接；
3)转接3-5次后，以1-3％的接种量接种到发酵培养基，25-32℃，180rpm震荡培养3-5天后得到孢子悬液样品，检测发酵液中木聚糖酶活力；
4)根据发酵液中木聚糖酶活力检测结果，分别从各同样剂量诱变剂处理后的10份孢子悬液样品中挑选1-3个木聚糖酶高产样品，取所选样品接种到富集培养基，25-32℃，180rpm震荡培养12-36h；
5)从步骤4的富集培养基中挑选3-5个较大的菌丝体，分别接种至平板筛选培养基，25-
32℃，倒置培养2-3天收集孢子，制备孢子悬液；
6)血球计数板检测孢子悬液浓度，将步骤5)得到的所有孢子悬液调整至同一浓度，以
1-3％的接种量接种到发酵培养基，25-32℃，180rpm震荡培养3-5天后检测发酵液中木聚糖酶活力，根据发酵液中木聚糖酶活力筛选得到高产木聚糖酶的突变菌株。
2.根据权利要求1所述的一种木聚糖酶高产曲霉突变株的筛选方法，其特征在于：所述的诱变剂为烷化剂、电离辐射、非电离辐射中的一种。
3.根据权利要求2所述的一种木聚糖酶高产曲霉突变株的筛选方法，其特征在于：所述的烷化剂为亚硝基胍或甲基磺酸乙酯中的一种，其诱变剂量为浓度0.1-1g/L。
4.根据权利要求2所述的一种木聚糖酶高产曲霉突变株的筛选方法，其特征在于：所述的电离辐射为α射线，β射线，γ射线，X射线，快中子中的一种，其诱变剂量为0.5-5KGy。
5.根据权利要求2所述的一种木聚糖酶高产曲霉突变株的筛选方法，其特征在于：所述的非电离辐射为紫外或微波中的一种，其诱变剂量分别为：紫外10-60W，照射距离15-30cm，照射时间10-120s；微波300-3000MHz,处理时间30-300s。
6.根据权利要求1-5任一所述的一种木聚糖酶高产曲霉突变株的筛选方法，其特征在于：所述的富集培养基：木聚糖5-15g/L；酵母粉0.3-0.5g/L；硝酸钠1.5-3g/L；磷酸二氢钾
0.5-2g/L；氯化钠0.3-0.8g/L；七水合硫酸镁0.2-0.5g/L；七水合硫酸亚铁0.01-0.03g/L；
pH5.0-6.0。
7.根据权利要求6所述的一种木聚糖酶高产曲霉突变株的筛选方法，其特征在于：发酵培养基：蛋白胨5-15g/L；酵母粉5-15g/L；木聚糖5-15g/L；七水合硫酸镁0.2-0.5g/L；磷酸二氢钾1.5-3g/L；氯化钙0.2-0.5g/L；吐温-80 1mL/L，pH自然。
8.根据权利要求7所述的一种木聚糖酶高产曲霉突变株的筛选方法，其特征在于：平板筛选培养基：木聚糖5-15g/L；酵母粉0.2-0.5g/L；硝酸钠1-3g/L；磷酸二氢钾0.5-2g/L；氯化钠0.2-0.5g/L；七水合硫酸镁0.2-0.5g/L；七水合硫酸亚铁0.01-0.03g/L；琼脂20-25g/L；pH5.0-6.0。
9.根据权利要求1-5任一所述的一种木聚糖酶高产曲霉突变株的筛选方法，其特征在于：所述全部步骤均要求以未诱变菌株作为对照同步进行。
一种木聚糖酶高产曲霉突变株的筛选方法
技术领域
背景技术
[0002] 木聚糖酶是一类随机断裂木聚糖主链中β-1,4-糖苷键的糖苷水解酶(EC3.2.1.x)，木聚糖酶最初被称为戊糖酶，1961年，国际生化与分子联合会将之命名为内切-β-1,4-木聚糖酶，编号为EC3.2.1.8。木聚糖酶在食品、动物饲料、纺织、造纸和以及医药和化工等行业都得到了广泛应用。
[0003] 木聚糖酶来源广泛，在原核生物、真核生物以及一些高等真核生物中均已发现了木聚糖酶的存在。目前报道的产生木聚糖酶的真菌大多数集中在曲霉属(Aspergillus)和木霉属(Trichoderma)。
[0004] CN103923840B一种高产木聚糖酶的黑曲霉及其应用,公开了一种高产木聚糖酶的黑曲霉及其应用。黑曲霉(Aspergillus niger)SM751，其保藏号为：CGMCC No.8670。该菌所产生的木聚糖酶在多种抑制物的混合作用下，酶活受到激活，相较空白对照，酶活最高激活率达到了33.43％。本发明提供的黑曲霉(Aspergillus niger)SM751，其能高产高酶活的、能耐受预处理后发酵抑制物的木聚糖酶，因此在木质纤维素酶解领域具有广泛的应用。
[0005] CN102787080A一株曲霉菌株及其在制备木聚糖酶中的应用,公开了一株曲霉菌株及其在制备木聚糖酶中的应用。本发明提供的曲霉(Aspergillus sp.)菌株FC2-2，其保藏编号为CGMCC No.6049。本发明还提供了生产木聚糖酶的方法，包括如下步骤：将上述的曲霉(Aspergillus sp.)菌株FC2-2进行液体发酵，收集发酵产物，离心去除菌体后得到的发酵上清液可作为木聚糖酶制剂，该木聚糖酶制剂含有的木聚糖酶的最适pH值为5.5、最适温度为60℃，其在50℃条件下具有较好的稳定性，且其水解甘蔗渣木聚糖的主要产物是木二糖。该木聚糖酶制剂在保健品木二糖的生产中具有应用潜力。
[0006] 在工业应用中，为了提高木聚糖酶活力，降低生产成本，研究人员通常会利用各种物理、化学方法对野生菌株进行诱变，以期得到高产木聚糖酶的突变菌株。目前所使用的突变菌株的筛选方法为大多为随机挑选，或者选择筛选平板上生长较为旺盛的单菌落，以及与野生型相比形态有所变化的单菌落。然后接种至发酵培养基中培养后检测木聚糖酶活力。这种筛选方法存在目的不明确、筛选效率低以及工作量过大等缺点，故而需要一种更具针对性、效率更高、更容易得到正突变菌株的筛选方法。
发明内容
[0007] 本发明提供一种工作强度小、筛选效率更高的木聚糖酶高产曲霉突变株的筛选方法。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：
[0009] 一种木聚糖酶高产曲霉突变株的筛选方法，该方法的具体步骤如下：
[0010] 1)以土曲霉(Aspergillus terreus)菌株FC7-1作为出发菌株，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.11657,分别取一定量孢子悬液，经不同剂量诱变剂进行处理；
[0011] 2)将经诱变剂处理的各孢子悬液平均分为10份，以5-10％的接种量分别接种到富集培养基，25-32℃，静止培养12-48h后再次转接；
[0012] 3)转接3-5次后，以1-3％的接种量接种到发酵培养基，25-32℃，180rpm震荡培养3-5天后得到孢子悬液样品，检测发酵液中木聚糖酶活力；
[0013] 4)根据发酵液中木聚糖酶活力检测结果，分别从各同样剂量诱变剂处理后的10份孢子悬液样品中挑选1-3个木聚糖酶高产样品，取所选样品接种到富集培养基，25-32℃，180rpm震荡培养12-36h；
[0014] 5)从步骤4)的富集培养基中挑选3-5个较大的菌丝体，分别接种至平板筛选培养基，25-32℃，倒置培养2-3天收集孢子，制备孢子悬液；
[0015] 6)血球计数板检测孢子悬液浓度，将步骤5)得到的所有孢子悬液调整至同一浓度，以1-3％的接种量接种到发酵培养基，25-32℃，180rpm震荡培养3-5天后检测发酵液中木聚糖酶活力，根据发酵液中木聚糖酶活力筛选得到高产木聚糖酶的突变菌株。
[0017] 进一步，以上所述的一种木聚糖酶高产曲霉突变株的筛选方法，所述的烷化剂为亚硝基胍或甲基磺酸乙酯中的一种，其诱变剂量为浓度0.1-1g/L。诱变剂量为浓度为烷化剂在其溶剂与孢子悬液混合体中的浓度。
[0019] 进一步，以上所述的一种木聚糖酶高产曲霉突变株的筛选方法，所述的非电离辐射为紫外、红外、微波中的一种，其诱变剂量分别为：紫外10-60W，照射距离15-30cm，照射时间10-120s；微波300-3000MHz,处理时间30-300s。
[0020] 进一步，以上任一所述的一种木聚糖酶高产曲霉突变株的筛选方法，其特征在于：所述的富集培养基：木聚糖5-15g/L；酵母粉0.3-0.5g/L；硝酸钠1.5-3g/L；磷酸二氢钾0.5-
2g/L；氯化钠0.3-0.8g/L；七水合硫酸镁0.2-0.5g/L；七水合硫酸亚铁0.01-0.03g/L；pH
5.0-6.0。
2g/L；氯化钠0.3-0.8g/L；七水合硫酸镁0.2-0.5g/L；七水合硫酸亚铁0.01-0.03g/L；pH
5.0-6.0。
[0021] 进一步，以上所述的一种木聚糖酶高产曲霉突变株的筛选方法，发酵培养基：蛋白胨5-15g/L；酵母粉5-15g/L；木聚糖5-15g/L；七水合硫酸镁0.2-0.5g/L；磷酸二氢钾1.5-3g/L；氯化钙0.2-0.5g/L；吐温-80 1mL/L，pH自然。
[0022] 进一步，以上所述的一种木聚糖酶高产曲霉突变株的筛选方法，平板筛选培养基：木聚糖5-15g/L；酵母粉0.2-0.5g/L；硝酸钠1-3g/L；磷酸二氢钾0.5-2g/L；氯化钠0.2-
0.5g/L；七水合硫酸镁0.2-0.5g/L；七水合硫酸亚铁0.01-0.03g/L；琼脂20-25g/L；pH5.0-
6.0。
0.5g/L；七水合硫酸镁0.2-0.5g/L；七水合硫酸亚铁0.01-0.03g/L；琼脂20-25g/L；pH5.0-
6.0。
[0023] 进一步，以上任一所述的一种木聚糖酶高产曲霉突变株的筛选方法，所述全部步骤均要求以未诱变菌株作为对照同步进行。
[0024] 本发明具有以下有益效果：
[0025] 1、本发明利用富集培养基，将正突变菌株培养成优势菌株，然后经过对相同剂量诱变剂处理的样品分组进行的筛选实验，大大提高了正突变菌株被筛选得到的可能性。
[0026] 2、本发明改变了以往的随机筛选模式，简化了筛选程序，能够大大提高木聚糖酶高产菌株的筛选效率，使木聚糖酶高产菌株的大批量筛选更具操作性。
具体实施方式
[0027] 下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
[0028] 培养基准备
[0029] 富集培养基：木聚糖5-15g/L；酵母粉0.3-0.5g/L；硝酸钠1.5-3g/L；磷酸二氢钾0.5-2g/L；氯化钠0.3-0.8g/L；七水合硫酸镁0.2-0.5g/L；七水合硫酸亚铁0.01-0.03g/L；
pH 5.0-6.0。
pH 5.0-6.0。
[0030] 平板筛选培养基：木聚糖5-15g/L；酵母粉0.2-0.5g/L；硝酸钠1-3g/L；磷酸二氢钾0.5-2g/L；氯化钠0.2-0.5g/L；七水合硫酸镁0.2-0.5g/L；七水合硫酸亚铁0.01-0.03g/L；
琼脂20-25g/L；pH 5.0-6.0
琼脂20-25g/L；pH 5.0-6.0
[0031] 发酵培养基：蛋白胨5-15g/L；酵母粉5-15g/L；木聚糖5-15g/L；七水合硫酸镁0.2-0.5g/L；磷酸二氢钾1.5-3g/L；氯化钙0.2-0.5g/L；吐温-80 1mL/L，pH自然。
[0032] 发酵液中木聚糖酶活力检测
[0033] 发酵液中木聚糖酶活力测定采用3,5-二硝基水杨酸(3,5-dinitrosalicylate,DNS)法，具体步骤如下：
[0034] 将木糖溶于无菌去离子水中，制成不同浓度的木糖标准液(0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL)；在500μL木糖标准液中加入1mL DNS，沸水浴5min显色，冷却至室温(25℃)，540nm处测定光吸收值；得到光吸收值和木糖浓度的标准曲线。标准曲线的函数式为y＝3.0925x+0.0177(R2＝0.9990)(y为光吸收值，x为木糖浓度)。
[0035] 向2mL EP管中加入250μL 1％桦木木聚糖溶液，然后加入250μL适当稀释的发酵液，在最适条件下反应10min，期间不断振荡，使酶与底物充分接触，反应结束后加入1mL DNS,沸水浴5min显色，冷却至室温，1,200rpm离心1min，取出上清液200μL，540nm处测定上清液的光吸收值，根据标准曲线和光吸收值计算木聚糖酶活力。木聚糖酶活力定义：在指定条件下水解木聚糖，每min释放出1μmol还原糖(相当于等量的木糖)所需的酶量为一个酶活力单位(U)。
[0036] 诱变菌株的获得：
[0037] 以本实验室菌株土曲霉FC7-1(保存于中国微生物菌种保藏中心，编号：CGMCC 11657)作为出发菌株，接种至筛选培养基平板上，28℃，倒置培养2天。在无菌条件下，用无菌水洗脱孢子，制备孢子悬液。
[0038] 高产γ-氨基丁酸的突变菌株的筛选
[0039] 实施例1
[0040] 1.分别取1ml孢子悬液，置于2ml无菌离心管内，进行α射线照射，照射剂量分别为0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5KGy。
[0041] 2.将未经α射线照射及将经α射线照射不同剂量的各1mL孢子悬液平均分为10份，以5％的接种量分别接种到富集培养基，25℃，静止培养12h后再次转接；
[0042] 3.转接3次后，以1％的接种量接种到发酵培养基，25℃，180rpm震荡培养3天后检测发酵液中木聚糖酶活力；
[0043] 4.根据发酵液中木聚糖酶活力检测结果，分别从各同样剂量诱变剂α射线处理后的10份孢子悬液样品中挑选1-3个木聚糖酶高产样品，取所选样品接种到富集培养基，25℃，180 rpm震荡培养12h；。
[0044] 5.从步骤4的富集培养基中挑选3-5个较大的菌丝体，分别接种至平板筛选培养基，25℃，倒置培养1天收集孢子，制备孢子悬液。
[0045] 6.血球计数板检测孢子悬液浓度，将步骤5得到的各孢子悬液均以1％的接种量接种到发酵培养基，25℃，180rpm震荡培养3天后检测发酵液中木聚糖酶活力高低。
[0046] 7.根据发酵液中木聚糖酶活力检测结果，筛选得到5株高产木聚糖酶的土曲霉突变菌株，与出发菌株相比，突变菌株所产木聚糖酶活力分别提高25％、37％、40％、46％、70％。
[0047] 实施例2
[0048] 1.分别取1ml孢子悬液，置于2ml无菌离心管内，进行β射线照射，照射剂量分别为0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5KGy。
[0049] 2.将未经β射线照射及将经β射线照射不同剂量的各1mL孢子悬液平均分为10份，以6％的接种量分别接种到富集培养基，28℃，静止培养24h后再次转接；
[0050] 3.转接4次后，以2％的接种量接种到发酵培养基，28℃，180rpm震荡培养4天后检测发酵液中木聚糖酶活力；
[0051] 4.根据发酵液中木聚糖酶活力检测结果，分别从各同样剂量诱变剂β射线处理后的10份孢子悬液样品中挑选1-3个木聚糖酶高产样品，取所选样品接种到富集培养基，28℃，180rpm震荡培养24h；。
[0052] 5.从步骤4的富集培养基中挑选3-5个较大的菌丝体，分别接种至平板筛选培养基，28℃，倒置培养2天收集孢子，制备孢子悬液。
[0053] 6.血球计数板检测孢子悬液浓度，将步骤5得到的各孢子悬液均以2％的接种量接种到发酵培养基，28℃，180rpm震荡培养4天后检测发酵液中木聚糖酶活力高低。
[0054] 7.根据发酵液中木聚糖酶活力检测结果，筛选得到5株高产木聚糖酶的土曲霉突变菌株，与出发菌株相比，突变菌株所产木聚糖酶活力分别提高30％、41％、46％、56％、68％。
[0055] 实施例3
[0056] 1.分别取1ml孢子悬液，置于2ml无菌离心管内，进行γ射线照射，照射剂量分别为0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5KGy。
[0057] 2.将未经γ射线照射及将经γ射线照射不同剂量的各1mL孢子悬液平均分为10份，以7％的接种量分别接种到富集培养基，30℃，静止培养36h后再次转接；
[0058] 3.转接5次后，以3％的接种量接种到发酵培养基，30℃，180rpm震荡培养5天后检测发酵液中木聚糖酶活力；
[0059] 4.根据发酵液中木聚糖酶活力检测结果，分别从各同样剂量诱变剂γ射线处理后的10份孢子悬液样品中挑选1-3个木聚糖酶高产样品，取所选样品接种到富集培养基，30℃，180rpm震荡培养36h；。
[0060] 5.从步骤4的富集培养基中挑选3-5个较大的菌丝体，分别接种至平板筛选培养基，30℃，倒置培养1天收集孢子，制备孢子悬液。
[0061] 6.血球计数板检测孢子悬液浓度，将步骤5得到的各孢子悬液均以3％的接种量接种到发酵培养基，30℃，180rpm震荡培养5天后检测发酵液中木聚糖酶活力高低。
[0062] 7.根据发酵液中木聚糖酶活力检测结果，筛选得到4株高产木聚糖酶的土曲霉突变菌株，与出发菌株相比，突变菌株所产木聚糖酶活力分别提高40％、43％、50％、76％。
[0063] 实施例4
[0064] 1.分别取1ml孢子悬液，置于2ml无菌离心管内，进行X射线照射，照射剂量分别为0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5KGy。
[0065] 2.将未经X射线照射及将经X射线照射不同剂量的各1mL孢子悬液平均分为10份，以8％的接种量分别接种到富集培养基，32℃，静止培养48h后再次转接；
[0066] 3.转接3-5次后，以1％的接种量接种到发酵培养基，32℃，180rpm震荡培养3天后检测发酵液中木聚糖酶活力；
[0067] 4.根据发酵液中木聚糖酶活力检测结果，分别从各同样剂量诱变剂X射线处理后的10份孢子悬液样品中挑选1-3个木聚糖酶高产样品，取所选样品接种到富集培养基，32℃，180rpm震荡培养48h；。
[0068] 5.从步骤4的富集培养基中挑选3-5个较大的菌丝体，分别接种至平板筛选培养基，32℃，倒置培养2天收集孢子，制备孢子悬液。
[0069] 6.血球计数板检测孢子悬液浓度，将步骤5得到的各孢子悬液均以1-3％的接种量接种到发酵培养基，32℃，180rpm震荡培养4天后检测发酵液中木聚糖酶活力高低。
[0070] 7.根据发酵液中木聚糖酶活力检测结果，筛选得到5株高产木聚糖酶的土曲霉突变菌株，与出发菌株相比，突变菌株所产木聚糖酶活力分别提高29％、45％、49％、55％、80％。
[0071] 实施例5
[0072] 1.分别取1ml孢子悬液，置于2ml无菌离心管内，进行快中子照射，照射剂量分别为0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5KGy。
[0073] 2.将未经快中子照射及将经快中子照射不同剂量的各1mL孢子悬液平均分为10份，以10％的接种量分别接种到富集培养基，28℃，静止培养24h后再次转接；
[0074] 3.转接3-5次后，以2％的接种量接种到发酵培养基，28℃，180rpm震荡培养4天后检测发酵液中木聚糖酶活力；
[0075] 4.根据发酵液中木聚糖酶活力检测结果，分别从各同样剂量诱变剂快中子处理后的10份孢子悬液样品中挑选1-3个木聚糖酶高产样品，取所选样品接种到富集培养基，28℃，180rpm震荡培养24h；。
[0076] 5.从步骤4的富集培养基中挑选3-5个较大的菌丝体，分别接种至平板筛选培养基，28℃，倒置培养1天收集孢子，制备孢子悬液。
[0077] 6.血球计数板检测孢子悬液浓度，将步骤5得到的各孢子悬液均以1-3％的接种量接种到发酵培养基，28℃，180rpm震荡培养4天后检测发酵液中木聚糖酶活力高低。
[0078] 7.根据发酵液中木聚糖酶活力检测结果，筛选得到7株高产木聚糖酶的土曲霉突变菌株，与出发菌株相比，突变菌株所产木聚糖酶活力分别提高28％、33％、48％、53％、56％、82％。
[0079] 实施例6
[0080] 1.将孢子悬液稀释至1×106cfu/ml，各取10mL装入灭菌的培养皿中，在紫外灯(紫外灯功率为15w，照射距离为15cm)下分别照射20s、30s、40s、50s、60s、70s、80s、90s、100s、110s、120s。
[0081] 2.将未经紫外照射及经紫外照射不同时间的各10mL孢子悬液平均分为10份，以5％的接种量分别接种到富集培养基，25℃，静止培养12h后再次转接；
[0082] 3.转接3次后，以1％的接种量接种到发酵培养基，25℃，180rpm震荡培养3天后检测发酵液中木聚糖酶活力；
[0083] 4.根据发酵液中木聚糖酶活力检测结果，分别从各紫外光照射同样时间后的10份孢子悬液样品中挑选1-3个木聚糖酶高产样品，取所选样品接种到富集培养基，25℃，180rpm震荡培养12h；。
[0084] 5.从步骤4的富集培养基中挑选3-5个较大的菌丝体，分别接种至平板筛选培养基，25℃，倒置培养1天收集孢子，制备孢子悬液。
[0085] 6.血球计数板检测孢子悬液浓度，将步骤5得到的各孢子悬液均以1％的接种量接种到发酵培养基，25℃，180rpm震荡培养3天后检测发酵液中木聚糖酶活力高低。
[0086] 7.根据发酵液中木聚糖酶活力检测结果，筛选得到5株高产木聚糖酶的土曲霉突变菌株，与出发菌株相比，突变菌株所产木聚糖酶活力分别提高25％、37％、40％、46％、70％。
[0087] 实施例7
[0088] 1.将孢子悬液稀释至1×106cfu/ml，各取10mL装入灭菌的培养皿中，在紫外灯(紫外灯功率为30w，照射距离为25cm)下分别照射20s、30s、40s、50s、60s、70s、80s、90s、100s、110s、120s。
[0089] 2.将未经紫外照射及经紫外照射不同时间的各10mL孢子悬液平均分为10份，以8％的接种量分别接种到富集培养基，32℃，静止培养48h后再次转接；
[0090] 3.转接3-5次后，以1％的接种量接种到发酵培养基，32℃，180rpm震荡培养3天后检测发酵液中木聚糖酶活力；
[0091] 4.根据发酵液中木聚糖酶活力检测结果，分别从各紫外光照射同样时间的10份孢子悬液样品中挑选1-3个木聚糖酶高产样品，取所选样品接种到富集培养基，32℃，180rpm震荡培养48h；。
[0092] 5.从步骤4的富集培养基中挑选3-5个较大的菌丝体，分别接种至平板筛选培养基，32℃，倒置培养2天收集孢子，制备孢子悬液。
[0093] 6.血球计数板检测孢子悬液浓度，将步骤5得到的各孢子悬液均以1-3％的接种量接种到发酵培养基，32℃，180rpm震荡培养4天后检测发酵液中木聚糖酶活力高低。
[0094] 7.根据发酵液中木聚糖酶活力检测结果，筛选得到8株高产木聚糖酶的土曲霉突变菌株，与出发菌株相比，突变菌株所产木聚糖酶活力分别提高29％、33％、45％、49％、55％、64％、80％、108％。
[0095] 实施例8
[0096] 1.将孢子悬液稀释至1×106cfu/ml，各取10mL装入灭菌的培养皿中，在紫外灯(紫外灯功率为60w，照射距离为30cm)下分别照射20s、30s、40s、50s、60s、70s、80s、90s、100s、110s、120s。
[0097] 2.将未经紫外照射及经紫外照射不同时间的各10mL孢子悬液平均分为10份，以10％的接种量分别接种到富集培养基，28℃，静止培养24h后再次转接；
[0098] 3.转接3-5次后，以2％的接种量接种到发酵培养基，28℃，180rpm震荡培养4天后检测发酵液中木聚糖酶活力；
[0099] 4.根据发酵液中木聚糖酶活力检测结果，分别从各紫外光照射同样时间后的10份孢子悬液样品中挑选1-3个木聚糖酶高产样品，取所选样品接种到富集培养基，28℃，180rpm震荡培养24h；。
[0100] 5.从步骤4的富集培养基中挑选3-5个较大的菌丝体，分别接种至平板筛选培养基，28℃，倒置培养1天收集孢子，制备孢子悬液。
[0101] 6.血球计数板检测孢子悬液浓度，将步骤5得到的各孢子悬液均以1-3％的接种量接种到发酵培养基，28℃，180rpm震荡培养4天后检测发酵液中木聚糖酶活力高低。
[0102] 7.根据发酵液中木聚糖酶活力检测结果，筛选得到4株高产木聚糖酶的土曲霉突变菌株，与出发菌株相比，突变菌株所产木聚糖酶活力分别提高、48％、53％、56％、82％。
[0103] 实施例9
[0104] 1.将孢子悬液稀释至1×106cfu/ml，各取10mL装入灭菌的培养皿中，在微波(微波频率为3000MHz)处理，处理时间为30s、60s、90s、120s、150s、180s、210s、240s、270s、300s。
[0105] 2.将未经微波处理及经微波处理不同时间的各10mL孢子悬液平均分为10份，以6％的接种量分别接种到富集培养基，28℃，静止培养24h后再次转接；
[0106] 3.转接4次后，以2％的接种量接种到发酵培养基，28℃，180rpm震荡培养4天后检测发酵液中木聚糖酶活力；
[0107] 4.根据发酵液中木聚糖酶活力检测结果，分别从各微波处理同样时间后的10份孢子悬液样品中挑选1-3个木聚糖酶高产样品，取所选样品接种到富集培养基，28℃，180rpm震荡培养24h；。
[0108] 5.从步骤4的富集培养基中挑选3-5个较大的菌丝体，分别接种至平板筛选培养基，28℃，倒置培养2天收集孢子，制备孢子悬液。
[0109] 6.血球计数板检测孢子悬液浓度，将步骤5得到的各孢子悬液均以2％的接种量接种到发酵培养基，28℃，180rpm震荡培养4天后检测发酵液中木聚糖酶活力高低。
[0110] 7.根据发酵液中木聚糖酶活力检测结果，筛选得到6株高产木聚糖酶的土曲霉突变菌株，与出发菌株相比，突变菌株所产木聚糖酶活力分别提高30％、41％、46％、56％、68％、76％。
[0111] 实施例10
[0112] 1.将孢子悬液稀释至1×106cfu/ml，各取10mL装入灭菌的培养皿中，在微波(微波频率为300MHz)处理，处理时间为30s、60s、90s、120s、150s、180s、210s、240s、270s、300s。
[0113] 2.将未经微波处理及经微波处理不同时间的各10mL孢子悬液平均分为10份，以7％的接种量分别接种到富集培养基，30℃，静止培养36h后再次转接；
[0114] 3.转接5次后，以3％的接种量接种到发酵培养基，30℃，180rpm震荡培养5天后检测发酵液中木聚糖酶活力；
[0115] 4.根据发酵液中木聚糖酶活力检测结果，分别从各微波处理同样时间后的10份孢子悬液样品中挑选1-3个木聚糖酶高产样品，取所选样品接种到富集培养基，30℃，180rpm震荡培养36h；。
[0116] 5.从步骤4的富集培养基中挑选3-5个较大的菌丝体，分别接种至平板筛选培养基，30℃，倒置培养1天收集孢子，制备孢子悬液。
[0117] 6.血球计数板检测孢子悬液浓度，将步骤5得到的各孢子悬液均以3％的接种量接种到发酵培养基，30℃，180rpm震荡培养5天后检测发酵液中木聚糖酶活力高低。
[0118] 7.根据发酵液中木聚糖酶活力检测结果，筛选得到3株高产木聚糖酶的土曲霉突变菌株，与出发菌株相比，突变菌株所产木聚糖酶活力分别提高40％、43％、67％。
[0119] 实施例11
[0120] 1.将孢子悬液稀释至1×106cfu/ml，各取10mL装入灭菌的培养皿中，在微波(微波频率为2450MHz)处理，处理时间为30s、60s、90s、120s、150s、180s、210s、240s、270s、300s。
[0121] 2.将未经微波处理及经微波处理不同时间的各10mL孢子悬液平均分为10份，以8％的接种量分别接种到富集培养基，32℃，静止培养48h后再次转接；
[0122] 3.转接3-5次后，以1％的接种量接种到发酵培养基，32℃，180rpm震荡培养3天后检测发酵液中木聚糖酶活力；
[0123] 4.根据发酵液中木聚糖酶活力检测结果，分别从各微波处理同样时间的10份孢子悬液样品中挑选1-3个木聚糖酶高产样品，取所选样品接种到富集培养基，32℃，180rpm震荡培养48h；。
[0124] 5.从步骤4的富集培养基中挑选3-5个较大的菌丝体，分别接种至平板筛选培养基，32℃，倒置培养2天收集孢子，制备孢子悬液。
[0125] 6.血球计数板检测孢子悬液浓度，将步骤5得到的各孢子悬液均以1-3％的接种量接种到发酵培养基，32℃，180rpm震荡培养4天后检测发酵液中木聚糖酶活力高低。
[0126] 7.根据发酵液中木聚糖酶活力检测结果，筛选得到5株高产木聚糖酶的土曲霉突变菌株，与出发菌株相比，突变菌株所产木聚糖酶活力分别提高29％、45％、49％、55％、80％。
[0127] 实施例12(烷化剂甲基磺酸乙酯(简称EMS))
[0128] 1.按1mg甲基磺酸乙酯(简称EMS)：1ml丙酮的比例配制甲基磺酸乙酯(简称EMS)溶液(1g/L)；各取0.2ml甲基磺酸乙酯溶液与0.8ml浓度为1×106cfu/ml孢子悬液混合，30℃下分别静止水浴处理10、20、30、40、50、60min。
[0129] 2.将未经甲基磺酸乙酯(简称EMS)处理及经甲基磺酸乙酯(简称EMS)处理不同时间的各1ml孢子悬液等分成10份，以5％的接种量分别接种到富集培养基，25℃，静止培养12h后再次转接；
[0130] 3.转接3次后，以1％的接种量接种到发酵培养基，25℃，180rpm震荡培养3天后检测发酵液中木聚糖酶活力；
[0131] 4.根据发酵液中木聚糖酶活力检测结果，分别从各EMS处理同样时间后的10份孢子悬液样品中挑选1-3个木聚糖酶高产样品，取所选样品接种到富集培养基，25℃，180rpm震荡培养12h；。
[0132] 5.从步骤4的富集培养基中挑选3-5个较大的菌丝体，分别接种至平板筛选培养基，25℃，倒置培养1天收集孢子，制备孢子悬液。
[0133] 6.血球计数板检测孢子悬液浓度，将步骤5得到的各孢子悬液均以1％的接种量接种到发酵培养基，25℃，180rpm震荡培养3天后检测发酵液中木聚糖酶活力高低。
[0134] 7.根据发酵液中木聚糖酶活力检测结果，筛选得到6株高产木聚糖酶的土曲霉突变菌株，与出发菌株相比，突变菌株所产木聚糖酶活力分别提高41％、57％、76％、94％、121％及156％。
[0135] 实施例13(烷化剂：亚硝基胍)
[0136] 1.按1mg亚硝基胍(NTG)：1ml丙酮的比例配制亚硝基胍溶液(1g/L)；各取0.2ml亚硝基胍溶液与0.8ml浓度为1×106cfu/ml孢子悬液混合，30℃下分别静止水浴处理10、20、30、40、50、60min。
[0137] 2.将未经亚硝基胍处理及经亚硝基胍处理不同时间的各1ml孢子悬液等分成10份，以7％的接种量分别接种到富集培养基，30℃，静止培养36h后再次转接；
[0138] 3.转接5次后，以3％的接种量接种到发酵培养基，30℃，180rpm震荡培养5天后检测发酵液中木聚糖酶活力；
[0139] 4.根据发酵液中木聚糖酶活力检测结果，分别从各NTG处理同样时间后的10份孢子悬液样品中挑选1-3个木聚糖酶高产样品，取所选样品接种到富集培养基，30℃，180rpm震荡培养36h；。
[0140] 5.从步骤4的富集培养基中挑选3-5个较大的菌丝体，接种至平板筛选培养基，30℃，倒置培养1天收集孢子，制备孢子悬液。
[0141] 6.血球计数板检测孢子悬液浓度，将步骤5得到的各孢子悬液均以3％的接种量接种到发酵培养基，30℃，180rpm震荡培养5天后检测发酵液中木聚糖酶活力高低。
[0142] 7.根据发酵液中木聚糖酶活力检测结果，筛选得到7株高产木聚糖酶的土曲霉突变菌株，与出发菌株相比，突变菌株所产木聚糖酶活力分别提高41％、57％、76％、94％、102％、121％及156％。
[0143] 实施例14(烷化剂：亚硝基胍)
[0144] 1.按1mg亚硝基胍(NTG)：1ml丙酮的比例配制亚硝基胍溶液(1g/L)；各取0.4ml亚硝基胍溶液与0.6ml浓度为1×106cfu/ml孢子悬液混合，30℃下分别静止水浴处理10、20、30、40、50、60min。
[0145] 2.将未经亚硝基胍处理及经亚硝基胍处理不同时间的各1ml孢子悬液等分成10份，以10％的接种量分别接种到富集培养基，28℃，静止培养24h后再次转接；
[0146] 3.转接3-5次后，以2％的接种量接种到发酵培养基，28℃，180rpm震荡培养4天后检测发酵液中木聚糖酶活力；
[0147] 4.根据发酵液中木聚糖酶活力检测结果，分别从各NTG处理同样时间后的10份孢子悬液样品中挑选1-3个木聚糖酶高产样品，取所选样品接种到富集培养基，28℃，180rpm震荡培养24h；。
[0148] 5.从步骤4的富集培养基中挑选3-5个较大的菌丝体，分别接种至平板筛选培养基，28℃，倒置培养1天收集孢子，制备孢子悬液。
[0149] 6.血球计数板检测孢子悬液浓度，将步骤5得到的各孢子悬液均以1-3％的接种量接种到发酵培养基，28℃，180rpm震荡培养4天后检测发酵液中木聚糖酶活力高低。
[0150] 7.根据发酵液中木聚糖酶活力检测结果，筛选得到6株高产木聚糖酶的土曲霉突变菌株，与出发菌株相比，突变菌株所产木聚糖酶活力分别提高45％、60％、78％、96％、130％及166％。
[0151] 筛选方法的可重复性
[0152] 本发明进行了多个批次(100批次以上)的菌株诱变及突变菌株的筛选，每个批次实验都能从50-120个分组样品中筛选得到3-8株突变菌株。
[0153] 本发明利用富集培养基，通过菌株的多次转接，将正突变菌株培养成为诱变样品中的优势菌株，然后通过同样剂量诱变剂处理后样品的分组实验，从每一组的样品中筛选几株木聚糖酶高产菌株，再针对所选菌株进行深入筛选。与传统突变菌株的随机筛选方法相比，本发明所用方法缩小了筛选范围，提高了筛选效率，显著提高了正突变菌株被筛选出来的几率，使正突变菌株的大批量筛选更具操作性。
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