技术领域
[0001] 本
发明涉及
生物技术领域，具体是一种适用于缢蛏鳃组织miRNA的提取方法；本方法也适用于其他海洋贝类miRNA的提取，提取的miRNA可用于miRNA cDNA的合成、miRNA前体的克隆以及miRNA靶基因验证实验。
背景技术
[0002] miRNA(microRNA)是长度约为21个核苷酸的一类内源性非编码单链RNA，跟靶mRNA 3’UTR结合成沉默
复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)，从而引起靶mRNA的降解或者抑制其翻译。从Lee等首次发现
线虫miRNA能通过抑制翻译来调节幼虫发育开始，miRNA进入了科学家的视线。之后，科学家运用多种生物技术来研究miRNA的功能，包括参与细胞生长、分化、凋亡、代谢以及应激反应等生物学过程。已有文献表明，miRNA参与团头鲂(Megalobrama amblycephala)和花鳗鲡(Anguilla Marmorata)应对低
氧环境胁迫、克氏原螯虾(Procambarus clarkia)应对
盐度环境胁迫以及
马氏珠母贝(Pinctada martensii)生物矿化的过程。目前，有学者发现miRNA可参与海洋贝类应对环境胁迫。Zhao等
鉴别出8个与渗透压调节相关的太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)和香港巨牡蛎(Crassostrea hongkongensis)miRNA；Zhou等用
温度和灿烂弧菌刺激长牡蛎(C.gigas)时，发现大量miRNAs被诱导或抑制；Bao等筛选到5个与镉胁迫应答相关且表达显著差异的泥蚶(Tegillarca granosa)miRNAs。
[0003] 由于缢蛏埋栖生活于池塘或滩涂的泥滩中，一般洞穴深度为体长的5-8倍，时常会面临高盐高
氨氮的威胁；又由于缢蛏鳃组织是呼吸系统和排泄系统双系统重要的组成部分，所以，鳃组织对缢蛏代谢排毒、调节渗透压尤为重要。由于鳃组织miRNA较为稳定且种类多，具有潜在的研究价值。因此，鳃组织miRNA提取是不可或缺的一步。但现有miRNA提取方法往往会遗漏部分miRNA，使得得不到或者得到部分目的miRNA，导致后续实验结果不可靠。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于针对现有海洋生物miRNA提取方法，提供一种能够有效富集鳃组织中的miRNA、提取效率与
试剂盒相当、成本大大降低且有利于海洋生物miRNA的生物学分析的一种缢蛏鳃组织miRNA快速提取方法。
[0005] 为了解决上述问题，本发明提供了一种缢蛏鳃组织miRNA提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0006] (1)将缢蛏鳃组织取出，并迅速用
磷酸缓冲盐(PBS)溶液洗净，放入液氮使其完全冻结；
[0007] (2)取出100-200mg鳃组织，加入1mL以
质量比8:2比例配置的Trizol试剂以及无
水乙醇的混合试剂，匀浆3次，每次匀浆后进行液体
冰浴5s，静置10min后得到匀
浆液；
[0008] (3)吸取步骤(2)所得匀浆液的上清液900uL，并加入上清液体积比为1/3的氯仿混合，摇动2min，冰浴5min，离心后得到3层液体，miRNA存在于最上层液体中；
[0009] (4)将步骤(3)中上层液体加入至miRNA分离柱中静置后进行离心；(重复)[0010] (5)将步骤(4)液体与同体积DNaseI酶-异丙醇-高盐缓冲液混合，置于温度为-20℃
冰箱中10-60min；
[0011] (6)将步骤(5)所得
混合液离心得到miRNA沉淀，弃净液体，用乙醇清洗，离心(重复)；
[0012] (7)将步骤(6)离心后所得沉淀进行乙醇清洗，再次离心；
[0013] (8)将步骤(7)离心后的产物去掉液体，进行离心，并吸去剩余液体，室温晾干5min；
[0014] (9)用DEPC水溶解沉淀，最后得到缢蛏鳃组织miRNA。
[0015] 作为优选的方案，所述步骤(1)中，磷酸缓冲盐溶液的具体制备方法为以质量配比为8：0.2:1.44:0.24的
氯化钠、氯化
钾、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾以pH为7.2混合定容1L然后高压
蒸汽灭菌，室温保存后所得。
[0016] 作为优选的方案，所述步骤(3)中，还包括对匀浆液进行预离心的操作，具体步骤为：将步骤(2)所得匀浆液在4℃下以12000r/min的速度进行离心10min，之后按步骤(3)继续反应，最终得到3层液体，miRNA存在最上层液体中，
中间层主要为
蛋白质，底层则主要为DNA。
[0017] 作为优选的方案，所述步骤(4)、(6)的操作均为2次。
[0018] 作为优选的方案，所述步骤(5)中还包括在液体混合时在混合液中添加少量糖原-乙酸钠的操作，以帮助沉淀。
[0019] 作为优选的方案，所述步骤(6)中，DNaseI酶-异丙醇-高盐缓冲液的具体制备方法为以氯化钠0.3506g，
柠檬酸钠2.3528g，余量为DEPC水的配方配成10mL的高盐缓冲液，之后加入质量为1％的DNaseI酶以及3mL的异丙醇得到DNaseI酶-异丙醇-高盐缓冲液。
[0020] 作为优选的方案，所述步骤(7)中采用的乙醇为80％乙醇，所述步骤(8)中采用的乙醇为无水乙醇。
[0021] 作为优选的方案，所述步骤(3)、(4)、(8)中离心的条件分别为在4℃下采用12000r/min的速度下离心15min、10min、10-30s，所述步骤(6)中两次离心的条件分别为在4℃的条件下以12000r/min的速度离心10min以及在4℃的条件下以7500r/min的速度离心
5min；所述步骤(7)离心的条件为在4℃下采用7500r/min的速度离心5min。
[0022] 作为优选的方案，所述步骤(2)中，在静置10min的过程中还包括每2分钟进行一次摇匀的操作，可以使trizol更好的裂解细胞和保护总RNA。
[0023] 该技术方案具有以下有益的技术效果：
[0024] 1、通过本发明的方法能够充分分离小RNA与大RNA，去除DNA的影响，避免给后续实验带来的影响；
[0025] 2、通过加入用异丙醇-高盐缓冲液，有效富集miRNA，便于实验结果精确；
[0026] 3、在实验中采用不同浓度的无水乙醇清洗，有效去除水、盐离子等杂质；
[0027] 4、通过本发明的方法所获得的miRNA在实时
荧光定量检测中所得的Ct值比miRNeasy mini kit试剂盒提出的低；
[0028] 5、与
现有技术相比，本技术所需
费用更低，有利于推广与应用。
附图说明
[0029] 图1是本发明中
实施例2、对比例1以及对比例2的条带比较图；
[0030] 图2是本发明中实施例2、对比例1以及对比例2的miR-8245a-5p的Ct值比较图；
[0031] 图2中从左到右的曲线分别为实施例2、对比例1、对比例2。
具体实施方式
[0032] 以下结合具体实施例，对本发明做进一步描述。
[0033] 以下所提供的实施例并非用以限制本发明所涵盖的范围，所描述的步骤也不是用以限制其执行顺序。本领域技术人员结合现有公知常识对本发明做显而易见的改进，亦落入本发明要求的保护范围之内。
[0034] 实施例1
[0035] 缢蛏鳃组织miRNA提取的优化，具体操作如下：
[0036] (1)将缢蛏鳃组织取出，迅速用PBS洗净，放入液氮冻结完全；
[0037] (2)取出鳃组织200mg，加入Trizol：无水乙醇＝8:2 1mL，匀浆(10000r/min，10s，冰水)3次，每次匀浆后液体冰浴5s，静置10min(每2分钟进行一次摇匀操作)；
[0038] (3)加入匀浆液1/3体积的氯仿混合，摇动2min，冰浴5min，离心(4℃，12000r/min，15min)得到3层液体，miRNA存在最上层液体中；
[0039] (4)(3)中所述的匀浆液可进一步改进，先进行离心(4℃，12000r/min，10min)，之后加入匀浆液体积1/3的氯仿混合，继续摇动2min，冰浴5min，离心(4℃，12000r/min，15min)得到3层液体，miRNA存在最上层液体中；
[0040] (5)将上层液体加入到miRNA分离柱中，静置，离心(4℃，12000r/min，10min)；
[0041] (6)将步骤(5)重复一次，然后将所得液体与同体积的DNaseI酶-异丙醇-高盐缓冲液混合，置于温度为-20℃冰箱中30min；
[0042] (7)离心(4℃，12000r/min，10min)得到miRNA沉淀，弃净液体，然后用80％乙醇清洗，继续离心(4℃，12000r/min，5min)，并重复一次步骤(7)的操作；
[0043] (8)获得的沉淀用100％无水乙醇清洗，离心(4℃，12000r/min，5min)；
[0044] (9)去掉液体，离心(4℃，12000r/min，10-30s)，吸去剩余液体，室温晾干5min；
[0045] (10)用DEPC水溶解沉淀，得到miRNA。
[0046] 实施例2
[0047] 缢蛏鳃组织miRNA提取的优化，具体操作如下：
[0048] (1)将缢蛏鳃组织取出，迅速用PBS洗净，放入液氮冻结完全；
[0049] (2)取出鳃组织200mg，加入Trizol：无水乙醇＝8:2 1.2mL，匀浆(10000r/min，5s，冰水)3次，每次匀浆后液体冰浴5s，静置10min(每2分钟进行一次摇匀操作)；
[0050] (3)吸取上清液900uL，加入1/3体积的氯仿混合，摇动2min，冰浴5min，离心(4℃，12000r/min，15min)得到3层液体，miRNA存在最上层液体中；
[0051] (4)(3)中所述的匀浆液可进一步改进，离心(4℃，12000r/min，10min)，吸取上清液900mL，加入1/3体积的氯仿混合，摇动2min，冰浴5min，离心(4℃，12000r/min，15min)得到3层液体，miRNA存在最上层液体中；
[0052] (5)将上层液体加入到miRNA分离柱中，静置，离心(4℃，12000r/min，10min)；
[0053] (6)将步骤(5)重复一次，将液体与同体积DNaseI酶-异丙醇-高盐缓冲液混合，置-20℃冰箱中30min；
[0054] (7)离心(4℃，12000r/min，10min)得到miRNA沉淀，弃净液体，用80％乙醇清洗，离心(4℃，7500r/min，5min)，重复一次步骤(7)的操作；
[0055] (8)沉淀用100％无水乙醇清洗，离心(4℃，7500r/min，5min)；
[0056] (9)去掉液体，离心(4℃，12000r/min，10-30s)，吸去剩余液体，室温晾干5min；
[0057] (10)用DEPC水溶解沉淀，得到miRNA。
[0058] 本发明与其他方法提取鳃组织miRNA对比：
[0059] 对比例1
[0060] 采用SanPrep柱式microRNA抽提试剂盒
[0061] 取100mg冻存组织，加入1ml miRNA Extractor，匀浆(10000r/min，30s，冰水)，室温放置10min。加入200ml氯仿，振荡30s，室温3min。离心(4℃，12000r/min，10min)。加入上清液：无水乙醇＝1:1.5，混匀，全部溶液加至
吸附柱中(吸附柱(Spin Column TR)放入收集管)，静置1min，离心(4℃，12000r/min，2min)，收集液干净离心管中。加入2/3体积的无水乙醇，混匀。全部溶液加至吸附柱(Spin Column MR)中，静置1min，离心(4℃，12000r/min，2min)，弃废液。将吸附柱(Spin Column MR)放回收集管中，加入500μl RPE Solution，静置
2min，离心(4℃，10000r/min，30s)，弃废液。重复一次。离心(4℃，12000r/min，2min)。将吸附柱放入干净离心管中，在吸附膜中央加入20μl RNase-free water，静置2min，离心(4℃，
12000r/min，2min)，将所得到的小RNA溶液置于-80℃保存或用于后续试验。
[0062] 对比例2
[0063] 采用Isolation of miRNA from Cells and Tissue实施
[0064] 用1ml Reagent裂解组织，匀浆。将匀浆液在室温下静置2-3min；向匀浆液中加入200μL氯仿，剧烈振荡15s，冰浴10min。4℃，12000g，15min离心。加入1/2体积的无水乙醇，振荡混匀。将混合物全部转移至2mL RNAMini column中。离心(室温，10000r/min，1min)。加入0.9倍无水乙醇至离心管中，振荡混匀。取 RNA Mini column，置于新收集管中。混合物加入吸附柱中，弃液。重复步骤，将剩余样品加入吸附柱中，离心(室温，10000r/min，1min)，弃液，加500μl RWB Wash Buffer，离心(室温，10000r/min，1min)，弃液，重复一次。离心(室温，13000r/min，2min)，完全干燥 matrix。吸附柱至新1.5ml离心管中并在膜上加入20μL DEPC水。室温静置5min，离心(13000r/min，
2min)。
[0065] 缢蛏鳃组织miR-8245a-5p的定量检测：
[0066] 取实施例2中的操作步骤提取的缢蛏鳃miRNA，用微量分光光度计检测纯度和浓度，以及用qRT-PCR检测实施例2、对比例1和对比例2提取鳃miRNA方法的表达水平，qRT-PCR程序参照miRNA cDNA第一链合成试剂盒和miRNA荧光定量检测试剂盒
说明书进行。
[0067] 设计miR-8245a-5p的茎环引物：
[0068] GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC；
[0069] 设计miR-8245a-5p的引物：
[0070] miR8245a5p-F：GCGCGATAGCTGTCGGTAA
[0071] miR8245a5p-R：AGTGCAGGGTCCGAGGTATT
[0072] 使用U6引物作为内参引物：
[0073] U6-F：CTCGCTTCGGCAGCACA
[0074] U6-R：AACGCTTCACGAATTTGCGT
[0075] qRT-PCR程序：
[0076] 预变性：95℃5min；
[0077] 循环反应：95℃10s，60℃30s，40循环
[0078] 溶解曲线：95℃15s，60℃60s，95℃15s
[0079] 以上述条件对本发明实施例2和对比例1和对比例2的方法提取鳃miR-8245a-5p的Ct值进行了相关的测试，测试的方法如上测试的结果如图2以及表1所示。
[0080] 对本发明实施例2以及对比例1/2所制得的miRNA进行了相关纯度和浓度的测试，测试的结果如表1所示：
[0081] 表1按本发明实施例2和对比例1和对比例2的方法提取鳃miRNA的纯度和浓度比较[0082]
[0083] 对本发明实施例2和对比例1和对比例2的方法提取鳃miRNA的条带比较进行了相关测试，测试的结果如图1所示；由结果可知，与对比例1和对比例2提取的鳃miRNA相比，实施例2所得的鳃miRNA纯度高，产率高，qRT-PCR检测miR-8245a-5p的Ct值在19-20之间(Ct值越低表明qRT-PCR扩增效率越高)，因此本发明的方法提取的缢蛏鳃miRNA完全满足qRT-PCR的需要。
[0084] 上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、
修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附
权利要求的保护范围内。
