一种氧化酶及其应用
阅读：1020发布：2020-07-10
专利汇可以提供一种氧化酶及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种来源于雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)的L‑α‑羟酸 氧 化酶 基因的获得及其克隆表达，属于 生物 工程 领域。公开了其底物特异性，同时该L‑α‑羟酸氧化酶可以氧化(S)‑α‑羟酸酯，可应用于光学纯(R)‑α‑羟酸酯的制备。，下面是一种氧化酶及其应用专利的具体信息内容。
1.一种来源于雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)的L-α-羟酸氧化酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示。
2.根据权利要求1所述的L-α-羟酸氧化酶，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示。
3.根据权利要求1所述的L-α-羟酸氧化酶，其最适反应温度为40℃，最适反应pH为4。
4.根据权利要求1所述的L-α-羟酸氧化酶，可氧化L-乳酸、乙醇酸、L-苯乳酸、L-对羟基苯乳酸、L-酒石酸、L-苹果酸、L-扁桃酸、丹参素，生成对应的酮酸。
5.根据权利要求1所述的L-α-羟酸氧化酶，可氧化外消旋α-羟酸酯中的(S)-α-羟酸酯，拆分制备得到相应的光学纯(R)-α-羟酸酯及α-酮酸酯，所述的α-羟酸酯为下列之一：丹参素冰片酯、丹参素异丙酯、苯乳酸冰片酯、苯乳酸异丙酯、对羟基苯乳酸冰片酯、对羟基苯乳酸异丙酯、乳酸冰片酯、扁桃酸冰片酯、扁桃酸异丙酯、丹参素细辛醇酯、苯乳酸细辛醇酯、对羟基苯乳酸细辛醇酯。
一种氧化酶及其应用
技术领域
背景技术
[0002] L-α-羟酸氧化酶(L-α-hydroxyacid oxidase)是一种以FMN(FAD)为辅酶的脱氢酶(Aliphatic l-α-hydroxyacid oxidase from rat livers purification and properties.Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Enzymology 1968,167:9-22)，通常包含有乙醇酸氧化酶(glycolate oxidase)(Preparation and some properties of crystalline glycolic acid oxidase of spinach.J.Biol.Chem.1958,231(1):135–57)、L-乳酸氧化酶(L-lactate oxidase)(Conversion of L-lactate oxidase to a long chain alpha-hydroxyacid oxidase by site-directed mutagenesis of alanine 95to glycine.J Biol Chem.19968；271(45):28300-28305)。可用于生物传感器中测定乳酸的含量，或氧化L-乳酸生产丙酮酸。也有被用于光学纯α-羟酸的制备(中国专利201210109290.4)
[0003] 目前为止，已经在恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，绿色气球菌(Aerococcus viridians)，链球菌属(Streptococcus sp.)，片球菌属(Pediococcus sp.)，乳酸乳球菌(Lactococus lactis)，迟钝爱德华菌(Edwardsiella tarda)，耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis),运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)和过氧化醋杆菌(Acetobacter peroxidans)等细菌中克隆表达得到了L-乳酸氧化酶。L-乳酸氧化酶也在一些真菌中检测到，例如白地霉(Geotrichum candidum)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。(Search for Lactate Oxidase Producer Microorganisms，Applied Biochemistry and Microbiology,2007,43(2)178–181)
[0004] 本发明首次从Kerstersia gyiorum DSM 16618中克隆表达出一种新型的L-α-羟酸氧化酶，该酶不仅可以氧化(S)-α-羟酸，而且可以氧化(S)-α-羟酸酯，可应用于光学纯(R)-α-羟酸酯和(R)-α-羟酸的制备。
发明内容
[0005] 本发明从雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)中克隆得到了一种L-α-羟酸氧化酶的基因，利用大肠杆菌工程菌异源表达，公开了其相关的酶学特性，并进行了应用研究。
[0006] 本发明的技术方案如下：
[0007] 1、菌株
[0008] 本发明L-α-羟酸氧化酶基因的来源菌株为：Providencia rettgeri ATCC29944，购自美国ATCC菌种库。
[0009] 2、L-α-羟酸氧化酶基因的克隆
[0010] 提取Providencia rettgeri ATCC 29944菌体基因组总DNA。设计特异性引物，应用PCR方法，扩增出L-α-羟酸氧化酶基因全长编码框序列。并构建重组质粒。
[0011] 3、L-α-羟酸氧化酶表达与纯化
[0013] 4、L-α-羟酸氧化酶的酶学性质分析
[0014] 以L-乳酸为底物研究pH对本发明所述L-α-羟酸氧化酶酶活的影响。
[0015] 以L-乳酸为底物研究温度对本发明所述L-α-羟酸氧化酶酶活的影响。
[0017] 酶活测定方法为：根据Characterization of a Lactate Oxidase from a Strain of Gram Negative Bacterium from Soil，Applied Biochemistry and Biotechnology,56,1996,278-288。所述方法进行。
[0018] 5、L-α-羟酸氧化酶拆分混旋的α-羟酸酯
[0019] 拆分α-羟酸酯(alpha-hydroxy esters)的方法为：取纯化好的酶0.1克于50mL三角瓶中，加入溶有α-羟酸酯5mM的pH 7的磷酸盐缓冲液中，于30℃，150rpm水浴摇床中转化16h，转化后液相色谱分析上清液。(S)-α-羟酸酯中的α-羟基被脱氢氧化成对应的α-酮酸酯，(R)-α-羟酸酯不被氧化。
[0020] 产物(R)-α-羟酸酯的光学纯度通过对映体过量值(％e.e)来评价：
[0021] 对映体过量值％e.e＝[(SR-SS)/(SR+SS)]×100％
[0022] (R)-α-羟酸酯得率(％)＝(SR/S0)×100％
[0023] 式中SR为反应后(R)-对映体的峰面积，SS为反应后(S)-对映体的液相色谱峰面积，S0为反应前(R)-和(S)-对映体的液相色谱峰面积之和。
[0024] 产物测定液相色谱条件为：Chiralcel OD-H手性柱(4.6×250mm)，流动相体积比为正己烷：异丙醇：三氟乙酸＝80:20:0.1，流速为0.5mL/min，柱温25℃，检测波长210nm，进样量20μL。
[0025] 所述的α-羟酸酯为下列之一：丹参素冰片酯、丹参素异丙酯、苯乳酸冰片酯、苯乳酸异丙酯、对羟基苯乳酸冰片酯、对羟基苯乳酸异丙酯、扁桃酸冰片酯、扁桃酸异丙酯、丹参素细辛醇酯、乳酸冰片酯、苯乳酸细辛醇酯、对羟基苯乳酸细辛醇酯。
[0026] 所述的α-羟酸酯，根据中国专利200610042787.3、201410180490.8、201410175950.8和20140699506.6公布的方法合成。
[0027] 本发表明的有益之处：从Providencia rettgeri ATCC 29944中克隆得到了一种L-α-羟酸氧化酶，该酶可以氧化(S)-α-羟酸和(S)-α-羟酸酯，可用于规模化制备手性纯(R)-α-羟酸酯，具有重要的工业应用价值。
具体实施方式
[0028] 实施例1
[0029] 本实施例为本发明所述L-α-羟酸氧化酶基因的克隆与大肠杆菌工程菌构建。
[0030] 1、Providencia rettgeri ATCC 29944DNA的提取
[0031] 将Providencia rettgeri ATCC 29944菌株在LB培养基中培养12h，12,000rmp/min离心10min得到菌体，应用细菌基因组DNA抽提试剂盒(TaKaRa公司)按照其操作提取菌体基因组总DNA，放冰箱备用。
[0032] 2、大肠杆菌感受态制备
[0033] (1)接种E.coli DH5α和BL21(DE3)分别于含有20mL LB培养基的250mL摇瓶中，37℃、200rpm/min培养过夜。
[0034] (2)按1％接种量接种于50mL LB培养基中，37℃培养至OD600约0.6(约2～3h)。
[0035] (3)将菌液转移到50mL预冷的离心管中，冰上放置30min，8000rpm/min、4℃离心5min。
[0036] (4)弃上清，加入5mL预冷的0.1mol/L CaCl2溶液，使菌体悬浮，冰上放置20min，8000rpm/min、4℃离心5min。重复2次。
[0037] (5)弃上清，加入1.5mL预冷的0.1mol/L CaCl2溶液(含15％甘油)，轻轻悬浮菌体，然后按每个离心管(1.5mL)加入100μL菌液分装，-70℃冰箱保藏备用。
[0038] 3、L-α-羟酸氧化酶基因的克隆
[0039] (1)引物设计
[0040] 设计引物序列为：
[0041] 引物1：5'GCCGGGATCCATGAAAAGCAAAATATTAAAAAC 3'
[0042] 引物2：5'GCCGTCTAGATTATTGATTAAAACTAGCATCAGTA 3'
[0043] (2)PCR扩增
[0044] 用以上合成的两条引物，以Providencia rettgeri ATCC 2994的基因组DNA为模板进行PCR扩增。
[0045] 本步骤中扩增体系为：
[0046]
[0047] 扩增程序为：
[0048] 98℃，10min
[0049] 98℃，10sec；55℃，15sec；72℃，2min反应30个循环
[0050] 72℃，10min
[0051] PCR产物送华大基因测序后得到该酶的基因序列，如SEQ ID NO:1所示。根据该基因序列得到的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0052] (3)双酶切和连接
[0053] 将pColdⅡ质粒和PCR产物进行双酶切，酶切体系为：10×cut buffer 3μl,DNA 4μl，酶BamHI和XbaI各0.5μl，无菌水2μl共30μl。37℃水浴下双酶切1h。将DNA片段克隆到pColdⅡ载体上，并转化到E.coli DH5α感受态细胞中。连接体系：10×DNA ligase buffer 2.5μl，DNA片段8μl，载体DNA 2μl，T4DNA ligase 1μl，无菌水11.5μl共25μl。16℃水浴下连接12h-16h。
[0054] (4)转化
[0055] 步骤：
[0056] 1在连接体系中加入100μl DH5α感受态细菌，轻混匀，冰浴30min。
[0057] 2放入预热的42℃水浴中，放置90s进行热休克处理。
[0058] 3立即冰浴2min。
[0059] 4加入1ml不含抗生素的LB培养液，37℃培养1h使菌体复苏。
[0060] 5将菌体均匀涂布在含抗生素的LB平板上。
[0061] 6培养24h长势良好。挑单菌落进行菌落PCR，核酸电泳验证，提取重组质粒。将重组质粒导入BL21大肠杆菌感受态中，保存备用。
[0062] 实施例2
[0063] 本实施例为本发明所述L-α-羟酸氧化酶的诱导表达及分离纯化。
[0064] 1、加500μl重组菌液到50ml LB培养液中。37℃培养2.5h，15℃下静置0.5h。再加20μl 0.5M的IPTG，15℃下冷诱导培养24h。将发酵液进行离心(8000rmp/min，10min)得到菌体，用磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液(20mmol/L，pH 7.0)复溶菌体，超声破碎仪破碎，离心(8000rmp/min，10min)收集上清得到粗酶液。
[0065] 2、将步骤1得到的粗酶液采用AKTA avant 150蛋白纯化系统操作进行镍柱纯化，洗脱方法为：将A1、A2、B1、B2四根管路都放进水里，设置system flow 20ml/min流速，进行排气。然后设置system flow 1ml/min、flow path(column position 3)、delta pressure 0.3、pre-pressure 0.5、Gradient 0、inset A1，待水滴均匀流出后装柱子，平衡十分钟之后把A1放进结合液中，B1放进洗脱液中，再进行排气一次，平衡二十分钟，然后上样粗酶液，用500mM的高浓度咪唑缓冲液(B1所处溶液)梯度洗脱目的蛋白，将吸附在离子柱上的蛋白洗脱下来得到纯化的酶。纯化后的酶经冷冻干燥备用。
[0066] 实施例3
[0067] 本实施例为本发明所述L-α-羟酸氧化酶的最适温度。以L-乳酸为底物，将底物与pH为4.0的磷酸缓冲液在30-60℃不同的温度条件下水浴15min，测定α-羟酸氧化酶的酶活，确定酶的最适反应温度为40℃。
[0068] 实施例4
[0069] 本实施例为本发明所述L-α-羟酸氧化酶的最适pH值。以L-乳酸为底物，将底物在pH 3-9，40℃水浴15min测定酶的酶活，结果发现在pH 4.0条件下α-羟酸氧化酶酶活最高。
[0070] 实施例5
[0071] 本实施例为本发明所述L-α-羟酸氧化酶与不同底物的反应特性列于表2。
[0072] 表2L-α-羟酸氧化酶对不同底物的活性
[0073]
[0074] 实施例6
[0075] 根据发明内容中的方法拆分各种外消旋α-羟酸酯，结果如下表所示：
[0076] 表3拆分各种外消旋α-羟酸酯的效果
[0077]
[0078]
[0079] 由上表可以看出，当在反应时间充分时，可以得到各类高光学纯的(R)-α-羟酸酯，该酶的光学专一性非常好。
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