可溶性CD146作为生物标志物在选择用于植入哺乳动物的体外受精胚胎中的用途
阅读：597发布：2020-05-17
专利汇可以提供可溶性CD146作为生物标志物在选择用于植入哺乳动物的体外受精胚胎中的用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及人类生育 治疗 领域。本发明更具体地涉及将可溶性CD146(sCD146)鉴定为 生物 标志物，所述生物标志物在胚胎培养基中测量时可用于确定胚胎是否可以被选择用于植入 哺乳动物 的子宫中。因此，本发明提供了用于(预先)选择适合植入的胚胎的新的工具和相关 试剂 盒 。本发明还涉及在经受胚胎转移的人中促进妊娠的方法。，下面是可溶性CD146作为生物标志物在选择用于植入哺乳动物的体外受精胚胎中的用途专利的具体信息内容。
1.结合sCD146的可检测单克隆抗体在制备用于获取关于通过体外受精(IVF)获得的胚胎的有用信息的试剂或试剂盒中的用途。
2.结合sCD146的可检测单克隆抗体在制备用于确定通过体外受精(IVF)获得的胚胎是否可以被选择用于植入哺乳动物子宫中的试剂或试剂盒中的用途。
3.权利要求2的用途，其中sCD146以高于阈值的量存在于胚胎培养基中指示哺乳动物子宫中胚胎植入失败的高风险，并且sCD146以等于或低于阈值的量存在指示哺乳动物子宫中胚胎植入成功的机会。
4.权利要求2或3的用途，其中所述哺乳动物为人。
5.权利要求1-3任一项的用途，其中所述试剂或试剂盒用于评估体外受精胚胎在哺乳动物子宫中的植入潜力。
6.权利要求1-3任一项的用途，其中所述试剂或试剂盒用于取消具有植入失败高风险的胚胎的植入资格。
7.权利要求1-3任一项的用途，其中所述试剂或试剂盒用于选择用于植入哺乳动物子宫中的体外受精胚胎。
8.权利要求1-3任一项的用途，其中所述试剂或试剂盒用于预先选择用于植入哺乳动物子宫中的体外受精胚胎。
可溶性CD146作为生物标志物在选择用于植入哺乳动物的体
外受精胚胎中的用途
技术领域
[0001] 本发明涉及人类生育治疗领域。发明人实际上在本文中鉴定了一种新的生物标志物，即，可溶性CD146(sCD146)，所述生物标志物在胚胎培养基中测量时可用于确定所述胚胎是否可以被选择用于植入哺乳动物的子宫中。因此，本发明提供了用于(预先)选择适合植入的胚胎的新的工具和相关试剂盒。本发明还涉及在经受胚胎转移的人中促进妊娠的方法。
背景技术
[0002] 尽管在过去的十年中，体外受精(IVF)中的胚胎培养条件和转移技术均得到改善，但是未实现妊娠和分娩率的显著改善(Kupka MS等,Hum Reprod.2014)。超过70％的胚胎植入失败。在这种情况下，不止一个胚胎被转移以增加妊娠的机会。然而，多胚胎转移诱发了多胎妊娠的显著风险，已知所述多胎妊娠会引起胎儿和孕产妇的发病率和死亡率增加。为了避免这种风险，单胚胎转移已作为减少多胞胎频率的一种策略而被提出(McLernon等,BMJ.2010；Pandian Z等,Cochrane Database Syst Rev.2013)。迄今为止，胚胎质量的评估在形态学上用几个标准核定，所述标准包括细胞大小和对称性、细胞数目、卵裂阶段、无核细胞碎片。然而，胚胎质量不与胚胎活力以及植入潜力严格相关。因此，对植入预后的更好的评估需要寻找植入的生物学标志物，以允许转移表现出高植入潜力的单个胚胎。
[0003] 已经证明胚胎在早期阶段表达膜CD146(Wang等,Journal of Reproduction and Contraception,2008)，并且最近发明人鉴定到，可溶性CD146是妊娠大鼠中调节胚胎植入的新因子(Kaspi等,Angiogenesis,2013)。
[0004] CD146(或Ag S-Endo 1/MUC 18/M-CAM)是属于免疫球蛋白超家族的粘附分子，其基本上位于内皮连接处(Bardin等，Blood 2001)。在生理学上，CD146无处不在地并且组成性地表达在人内皮上，CD146在人内皮上参与内皮单层的粘着(cohesion)。CD146也以膜蛋白水解产生的可溶性形式存在。可溶性CD146(sCD146)被证明既存在于培养的内皮细胞的上清液中，也存在于正常人和病人血清中(Bardin等FEBS Lett 1998)(Bardin等Thromb Haemost 2003)。
[0005] 在产科学中，膜CD146由卵丘卵母细胞复合体、植入前胚胎、绒毛外滋养层细胞和子宫内膜表达(Wang等，J Reprod Contracept 2008)。另外，抗CD146阻断抗体的使用防止了胚胎的体外植入和体内植入小鼠中。阻断存在于子宫内膜细胞上的膜CD146的AA 98抗体防止了囊胚的植入(Liu等J Cell Physiol，2008)。在先兆子痫中，与这些滋养层细胞的浸润能力下降相关，CD146的表达大大降低或缺失(Liu等，Lab Investig J Tech Methods Pathol 2004)。关于所述可溶性形式，在正常妊娠期间血清sCD146随着胎龄而降低(Kaspi等，Angiogenesis 2013)。另外，发明人报道了，与至少有一个存活孩子的女性相比，至少有两次不明原因的胎儿流产的女性中的sCD146升高(Pasquier等，Thromb Haemost 2005)。他们还报道了sCD146对绒毛外滋养层细胞的不同作用：i)在体外，抑制绒毛外滋养层细胞系、HTR/Svneo细胞的迁移、增殖和假毛细血管形成；ii)在离体的胎盘外植体中，降低浸润潜力；以及iii)最后，在妊娠大鼠的模型中，反复注射sCD146会降低妊娠率以及每窝的胚胎数量。这些大鼠胎盘的胎盘组织学研究显示，这些效应伴随着糖原细胞迁移的减少，所述糖原细胞与女性中的绒毛外滋养层细胞类似(Kaspi等，Angiogenesis 2013)。
发明内容
[0006] 发明人在本文中通过ELISA和蛋白质印迹(Western blot)实验揭示了在胚胎培养基中存在可溶性CD146蛋白(sCD146)。他们证明，sCD146在胚胎培养基中测量时可以有利地用作生物标志物，以用于取消与植入失败高风险相关联的胚胎在子宫内植入的资格，用于鉴定可植入胚胎，或用于在若干胚胎中选择与最大植入潜力相关联的胚胎。
[0007] 因此，本文描述的第一个目的涉及胚胎培养基中存在的可溶性CD146蛋白(sCD146)的用途，其作为将所述胚胎植入哺乳动物子宫中的生物标志物。
[0008] 本文中还描述了一种用于获取关于通过体外受精(IVF)获得的胚胎的有用信息的早期非侵入性方法，特别是用于评估/确定体外受精胚胎的植入潜力，通常用于鉴定当转移到哺乳动物子宫中时具有植入潜力的胚胎(“可植入胚胎”)。通常实施这样的方法以取消胚胎植入哺乳动物子宫中的资格，或相反地选择，例如预先选择，用于植入哺乳动物子宫中的胚胎。
[0010] 本文中还描述了包含结合sCD146的可检测单克隆抗体的试剂盒；以及这种试剂盒的用途，其用于在通过体外受精(IVF)获得的胚胎中鉴定适合植入哺乳动物子宫中的胚胎，优选用于选择与最大植入潜力相关联的胚胎，或者用于检查单个胚胎的植入状态(“可植入性”)。
[0011] 本文还描述了在经受胚胎转移的人中促进妊娠的方法，所述方法包括在胚胎培养基中给药sCD146的体外步骤以及将剂量与阈值进行比较的步骤。
[0012] 发明详述
[0014] sCD146是一种代表早期非侵入性生物标志物的创新工具。因为本发明，选择适合转移到哺乳动物子宫中的胚胎不再仅仅依赖于胚胎形态学标准。无论伊斯坦布尔(Istanbul)分类定义的胚胎质量如何(“高”、“一般”或“差”质量)，都可以在任何胚胎培养基中测试sCD146。此外，可以在胚胎发育的早期并且比使用现有技术的情形更早进行所述选择。sCD146确实可以在胚胎发育早期，通常早至卵母细胞体外受精后两天，在胚胎培养基中检测到。
[0015] 本文所述的新型生物标志物有利地允许将单个胚胎，通常是在几个胚胎中表现出最大植入潜力的胚胎，转移到哺乳动物的子宫中。可以采取这种选择来避免IVF[经典IVF或卵胞浆内单精子注射IVF(ICSI-IVF)]背景下多胎妊娠和相关并发症的风险，同时显著提高妊娠机会并降低与IVF程序相关的成本。
[0016] 本说明书还提供了一种用于获取关于通过体外受精(IVF)获得的胚胎的有用信息的方法，特别是用于评估/确定体外受精胚胎的植入潜力，优选地用于鉴定/选择当转移到哺乳动物子宫中时具有植入潜力的胚胎(“可植入胚胎”)。通常使用这样的方法以取消体外受精胚胎植入哺乳动物子宫中的资格，或相反地选择，例如预先选择，用于植入哺乳动物子宫中的体外受精胚胎。
[0017] 本发明的方法有利地是非侵入性的，并且包括在胚胎培养基中，通常是在胚胎培养基的上清液中给药sCD146的体外步骤，和将剂量与阈值进行比较的步骤。当根据本发明的方法预先选择胚胎时，该方法可以进一步包括随后的形态学选择步骤，所述形态学选择步骤在于使用根据技术人员认可值的标准检查胚胎，如细胞大小和对称性、细胞数目、卵裂阶段、存在无核细胞碎片。
[0018] 所使用的培养基可以是胚胎培养或转移中常规使用的任何常规培养基。所述培养基通常是人造培养基，其基本上包含葡萄糖、丙酮酸盐和提供能量的组分以及在其中发育的植入前胚胎所释放的因子。所述培养基可以进一步包含例如氨基酸、核苷酸、维生素和胆固醇。
[0019] 考虑到应该消除被朊病毒或其他传染原污染的风险，无血清培养基是优选的。
[0020] 定期更新所述培养基。所述培养基在整个培养期间可以是相同的，或者可以根据发育阶段而在培养期间发生变化。
[0021] 适宜培养基的一个实例为补充有10％人血清白蛋白的 (生命全球(Life Global))。这样的培养基可以适当地用于培养，直到在第5天形成囊胚。
[0022] 待收集的培养基或培养基上清液优选为在收集前进行至少1天的胚胎培养的那种培养基或培养基上清液。
[0023] 考虑到向胚胎提供足够量的培养基的必要性以及从培养基中收集胚胎的便利性这两方面，上述人胚胎的培养优选在对应于每个人胚胎50μL-1mL培养基，更优选为每个人胚胎500-800μL培养基，通常为每个人胚胎600μL培养基的培养基量中进行。
[0024] 所收集的培养基或培养上清液可以直接测试，或在测试前冷冻储存和解冻。还允许添加一种或多种药学惰性稀释剂(例如无菌纯化水或含有人血浆白蛋白、葡萄糖、氯化钠等包含在 中的化合物的水溶液)以通过稀释将体积增加至更容易处理的体积，例如0.2mL或0.5mL。
[0025] 本文描述的具体方法是用于获取关于通过体外受精(IVF)获得的胚胎的有用信息并且优选地使用所述信息确定所述胚胎是否可以被选择用于植入哺乳动物子宫中的方法。该方法包括在胚胎培养基中给药sCD146的体外步骤和将剂量与阈值进行比较的步骤。在所述胚胎培养基中sCD146以高于阈值的量存在指示哺乳动物子宫中胚胎植入失败的高风险(与所述胚胎植入失败的高风险相关联)，并且sCD146以等于或低于所述阈值的量存在指示哺乳动物子宫中胚胎植入成功的机会(与所述胚胎植入成功的机会相关联)。sCD146的浓度最低时，胚胎植入成功的机会最高。所述“阈值”可以根据用于培养的培养基的性质以及具体测试的这部分培养基(上清液或总培养基)而变化。例如，如在实验部分中进行的，当使用培养基(生命全球)在培养基上清液上进行给药时，所述阈值为每毫升上清液
1164pg。
1164pg。
[0026] 所述给药步骤有利地在卵母细胞受精后两到五天之间，优选在卵母细胞受精后两天，通常在胚胎转移到哺乳动物子宫中的当天进行。
[0027] 本文还描述了一种包含结合sCD146的可检测抗体，优选为结合sCD146的可检测单克隆抗体的试剂盒，通常为体外受精胚胎选择试剂盒；以及所述试剂盒用于确定通过体外受精(IVF)获得的胚胎是否可以被选择用于植入哺乳动物子宫中的用途。
[0028] 具体的试剂盒包含结合sCD146的可检测抗体，优选结合sCD146的可检测单克隆抗体；以及任选地，当所述可检测抗体与胚胎培养基中的sCD146结合时揭示所述可检测抗体的合适底物，优选选择性结合CD146的可溶性形式且不结合CD146膜结合形式的可检测(单克隆)抗体。所述试剂盒任选地还包括用于制备对照的不含sCD146的药学惰性稀释剂，或至少一种包含已知浓度的sCD146的溶液，优选包含不同已知浓度的sCD146的几种溶液(例如2、3、4、5或6种溶液)，以及校准曲线(通常从0pg/ml到10000pg/ml)。通常，所述试剂盒还包含一个或多个装有一种或多种本文公开的物质(抗体、稀释剂和溶液)的容器。与这样的容器相关联，可以添加标签贴示，以提供根据所公开的方法使用上述物质的说明。
[0029] 所述结合sCD146的抗体可以是合成的、单克隆的或多克隆的，并且可以通过本领域公知的技术制备。
[0030] 结合sCD146的单克隆抗体有利地选自BioCytex的克隆COM 3D9、克隆COM 2F6、克隆COM 5G6、克隆COM 7A4和克隆F4-35H7(S-endo 1)，并且优选克隆COM 7A4。
[0031] 制备这种抗体的方法在本领域中是已知的(参见例如Despoix N,Walzer T,Jouve N,Blot-Chabaud M,Bardin N,Paul P,Lyonnet L,Vivier E,Dignat-George F,Vély F.小鼠CD146/MCAM是自然杀伤细胞成熟的标志物(Mouse CD146/MCAM is a marker of natural killer cell maturation).Eur J Immunol.2008；38:2855-64)。
[0032] 试剂盒的结合sCD146的可检测单克隆抗体优选为浓缩剂型，以便检测胚胎培养基或上清液中低浓度的sCD146。因此优选使用浓缩的抗体。在优选的实施方式中，所述浓缩的抗体允许在含有不超过100ng/ml，优选不超过50ng/ml，甚至更优选不超过10ng/ml sCD146的胚胎培养基的上清液中检测出sCD146。
[0033] 确定sCD146的存在以及测量sCD146的量，优选在免疫测定法中通过将培养基或培养上清液直接与适当的抗原接触的一步法或通过暗含生物样品的初步处理的方法来测定。所述免疫测定法可以通过本领域公知的方法：在固相或均相中，在一个或两个步骤中，通过竞争方法等进行。
[0034] 更优选地，所述免疫测定法选自ELISA、FEIA、蛋白质印迹、斑点印迹、基于珠子的测定法、抗原阵列和放射免疫测定法。
[0035] 在ELISA中，抗原必须固定在固体表面上，然后与连接到酶上的抗体复合。通过评估与底物温育产生有色产物的结合酶的活性来完成检测。
[0036] 在FEIA中，所述有色产物是发荧光的。
[0037] 在放射免疫测定法中，最终产物是放射性的。
[0038] 使用斑点印迹方案进行的蛋白质检测类似于蛋白质印迹，因为这两种方法都允许鉴定和分析感兴趣的蛋白质。斑点印迹方法与传统的蛋白质印迹技术的区别在于不使用电泳来分离蛋白质样品。相反，将样品蛋白质点在膜上并与抗体探针杂交。
[0039] 可以使用先前描述的各方法，例如使用正常对照以将值进行归一化，然后建立比率，或使用阳性对照作为校准物(以任意单位表示)，来获得半定量测量结果。
[0040] 所述检测可以在固体支持物上进行，所述固体支持物例如为微板(microplaque)或固体颗粒、试管等，所述微板上铺设有与待检测和定量的sCD146相对应的抗原。
[0041] 在本发明的背景下可以使用的识别sCD146的抗体，优选用一个或多个标签(检测标记)标记，以允许进行鉴定、追踪、检测和/或测量。检测标记可以选自例如：荧光团、磁珠、抗原表位、特定酶的底物、特定配体的结合结构域以及可以检测或定量的任何其他分子或部分。在本发明的背景下可以使用的抗体还可以是用于鉴定、追踪、检测和/或测量所述识别sCD146的抗体的抗抗体(anti-antibodies)。
[0042] 所述不含sCD146的药学惰性稀释剂可以选自例如：无菌纯化水或含有人血浆白蛋白、葡萄糖、氯化钠等的水溶液例如 培养基。
[0043] 本文还描述了在经受胚胎转移的哺乳动物中，通常在人中，促进妊娠(提高实现妊娠的成功率)的方法，所述方法包括：体外步骤i)在胚胎培养基中给药sCD146；步骤ii)将剂量与符合本发明的阈值进行比较，并且如果所述剂量等于或低于所述阈值则判定所述胚胎适合于植入哺乳动物子宫中，如果所述剂量高于所述阈值则判定所述胚胎不适合于植入哺乳动物子宫中；任选地步骤iii)使用形态学标准检查所述胚胎；以及步骤iv)如果所述剂量等于或低于所述阈值并且如果所述胚胎满足植入的形态学标准，则将所述胚胎转移到哺乳动物子宫中。
[0044] 在之前描述的方法中，任选的步骤iii)可以首先执行，即在步骤i)和ii)之前执行。在另一种实施方式中，步骤iii)可以在步骤i)和ii)之间执行。
[0046] 图1：夫妻和胚胎的分布。
[0047] 图2：对通过ELISA测试为阳性或阴性的胚胎上清液进行蛋白质印迹分析。阴性对照对应于没有任何胚胎的培养基。MW为分子量
[0048] 图3：第2天(D2)和第3天(D3)的sCD146浓度。
[0049] 图4：根据伊斯坦布尔分类定义的胚胎质量(类型1“高”n＝90，类型2“一般”n＝190，或类型3“差”n＝43)的sCD146浓度。
[0050] 图5：植入(是，n＝63)和未植入胚胎(否，n＝172)之间sCD146浓度的比较[0051] 图6：根据sCD146值的妊娠百分比。实施例
[0052] 材料与方法
[0053] 患者
[0054] 从2013年3月至2014年12月，发明人对在La Conception大学医院(法国马赛，AP-HM)医疗中心生殖部门进行体外受精(IVF)尝试的162对夫妻进行了初步试点研究。所有夫妻都被告知来自转移的胚胎的胚胎培养基将在胚胎转移后被保留用于研究目的，并选择参与或不参与本研究。每对夫妻仅被纳入一次。发明人从本研究中排除了未同意的卵母细胞和精子捐献者以及患者。机构审查委员会批准了这项调查。
[0055] 治疗方案
[0056] 使用三种类型的方案对患者进行受控的卵巢过度刺激：长激动剂方案(在前一周期的黄体期中施用GnRH激动剂)；短激动剂方案(自IVF周期的第一天起每日施用GnRH激动剂)；以及拮抗剂方案(从第5天起每日施用GnRH拮抗剂)。根据体重指数、女性年龄、第3日基础FSH值和窦状卵泡数量，以在150IU/天至450IU/天范围内的剂量使用重组FSH和/或hMG。患者常规地进行从卵巢过度刺激第8天开始的连续经阴道超声以及进行血清雌二醇(E2)测量。然后根据卵巢响应调整促性腺激素的剂量。当至少三个卵泡达到16mm的平均直径时，使用皮下注射重组人绒毛膜促性腺激素(hCG， Merck-Serono，250μg)触发排卵。
在施用hCG后35小时，使用经阴道超声引导的卵泡穿刺在局部或全身麻醉下进行取卵。然后根据精子参数，使用常规方案进行常规的IVF或者卵胞浆内单精子注射(ICSI-IVF)。然后，在授精后18h评估正常受精(即具有两个原核的受精卵母细胞，所谓的二倍体受精卵)后，将受精卵在37℃、5％CO2下在500μl 培养基(生命全球)中单独培养直到胚胎转移当日(第2天或第3天)。
在施用hCG后35小时，使用经阴道超声引导的卵泡穿刺在局部或全身麻醉下进行取卵。然后根据精子参数，使用常规方案进行常规的IVF或者卵胞浆内单精子注射(ICSI-IVF)。然后，在授精后18h评估正常受精(即具有两个原核的受精卵母细胞，所谓的二倍体受精卵)后，将受精卵在37℃、5％CO2下在500μl 培养基(生命全球)中单独培养直到胚胎转移当日(第2天或第3天)。
[0057] 在授精后26小时观察它们以检测早期细胞分裂。根据基于伊斯坦布尔共识的细胞大小和对称性、碎片化以及细胞数量的评分系统，将获得的二倍体胚胎在转移前进行分级(生殖医学的Alpha科学家和胚胎学ESHRE特别兴趣组(Alpha Scientists in Reproductive Medicine and ESHRE Special Interest Group of Embryology).Hum Reprod.2011)。
[0058] 然后将胚胎分为3个亚组：
[0059] 1/高质量胚胎，其具有同样大小的细胞，无碎片化或少于10％，以及第2天时有4个细胞或第3天时有8个细胞；在可用时被优先选择用于转移；
[0060] 2/一般质量胚胎，其大多数细胞具有阶段特异性的细胞大小，和/或10-25％碎片化，和/或第2天时有3或5个细胞或第3天时有6、7或9个细胞；
[0061] 3/差质量胚胎，其没有阶段特异性的细胞大小，和/或严重碎片化(>25％)，和/或第2天时有2个细胞或大于5个细胞或第3天时有小于6或大于9个细胞。
[0062] 然后，在胚胎转移后，每日以孕酮片剂(地屈孕酮(DuphastonR)，30毫克/天，法国简易股份有限公司(SAS)Abbot产品)维持黄体期。在胚胎转移后14天，通过血清阳性hCG水平(>100IU/l)诊断妊娠。在胚胎转移后第5周期间，通过在阴道超声检查中存在具有心脏活动的孕囊来证实临床妊娠。
[0063] 胚胎上清液
[0064] 在胚胎转移后，单独收集各转移胚胎的培养基(500μl )，在-20℃冷冻和存储直到sCD146定量。收集胚胎上清液是一种非侵入性技术；患者的护理没有变化。在所有患者中回顾性地比较IVF结果。
[0065] 胚胎上清液中存在sCD146的确认
[0066] 在人胚胎早期阶段中已经鉴定到CD146(Wang H等，J of Reprod and contracept 2008)，并且已知滋养层细胞中膜CD146的脱落可以生成可溶性形式(Kaspi等,Angiogenesis,2013)。然而，文献中没有关于胚胎分泌sCD146的数据。发明人对胚胎上清液进行蛋白质印记分析以确认胚胎释放sCD146。将50μl胚胎上清液或阴性对照(培养基)进行
4-12％NuPage SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(英杰(In Vitrogen)/生命技术(Life Technologies)，美国)并转移到硝酸纤维素膜上。使用Bio-Rad分子量标记。在恒定电压(60V)下进行2小时的转移。在用TBS-吐温20(TBST)中的4％牛血清白蛋白(BSA)封闭后，用在TBST中稀释(1:3000)的抗人CD146抗体(7A4 1mg/l，Biocytex，法国马赛)在4℃持续振荡过夜来证实可溶性CD146。通过HRP偶联的山羊抗小鼠抗体(赛默飞世尔(Thermo Scientific)，美国)来揭示可溶性CD146。扫描膜并用G:Box-Chemi-XT4(Syngene，英国剑桥)分析。
4-12％NuPage SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(英杰(In Vitrogen)/生命技术(Life Technologies)，美国)并转移到硝酸纤维素膜上。使用Bio-Rad分子量标记。在恒定电压(60V)下进行2小时的转移。在用TBS-吐温20(TBST)中的4％牛血清白蛋白(BSA)封闭后，用在TBST中稀释(1:3000)的抗人CD146抗体(7A4 1mg/l，Biocytex，法国马赛)在4℃持续振荡过夜来证实可溶性CD146。通过HRP偶联的山羊抗小鼠抗体(赛默飞世尔(Thermo Scientific)，美国)来揭示可溶性CD146。扫描膜并用G:Box-Chemi-XT4(Syngene，英国剑桥)分析。
[0067] 可溶性CD146测定
[0068] 使用可商够的ELISA测定(CY-QUANT sCD146，Biocytex，马赛)的调整后的方法测定sCD146。将板用特异性单克隆小鼠抗人CD146F(ab')2片段包被。将200μL 1/2稀释的胚胎上清液加入到每个孔中并在室温下温育30分钟。温育后，将板洗涤五次，然后与特定稀释剂中1：1000稀释度的HRP偶联的特异性抗CD146单克隆抗体(7A4-HRP，1mg/ml，Biocytex，法国马赛)在室温下温育30分钟，然后洗涤五次。将200μL四甲基联苯胺(TMB)底物在室温下温育约20分钟。然后通过加入100μL酸溶液终止比色反应。信号强度直接与样品中最初包含的sCD146的浓度有关。该技术的调整是基于将试剂盒的稀释剂替换为在与胚胎上清液相同的条件(37℃，5％CO2，48小时)下保存、但没有胚胎的胚胎培养基，以提高该测试的重复性和再现性。也使用浓缩的抗CD146抗体，因为上清液中sCD146的浓度低于人血清或血浆中的浓度(7A4-HRP，1mg/ml，Biocytesx，法国马赛)。使用含有已知浓度的sCD146(从0pg/ml至10000pg/ml)的溶液的校准曲线确定胚胎上清液中sCD146的浓度。由于上清液的低体积以及供应商的建议(200μl/孔)，每个样品被稀释(1：2)并进行一式一份的分析。在450nm下测量光密度(OD)。
[0069] 进行重复性和再现性分析，并且数据显示出4％的重复性和11％的再现性(n＝3次测试)。
[0070] 收集的数据
[0071] 发明人收集了患者的临床和生物学数据(年龄、体重指数、吸烟习惯、不孕症的指征和持续时间、通过窦状卵泡计数和第3日基础FSH和AMH血浆水平评价的卵巢储备的评估)，IVF周期的特征和实验室数据(以往IVF-ICSI尝试次数、常规IVF或ICSI-IVF、卵巢刺激方案、触发日雌二醇水平和子宫内膜厚度、取出的卵母细胞数目、成熟卵母细胞数目、获得的二倍体胚胎数目和转移的胚胎数目、转移的胚胎的形态学分数、转移日期)，以及临床妊娠的发生。
[0072] 统计学分析
[0073] 数据表示为平均值±SEM。使用Prism软件(GraphPad Software Inc.，圣地亚哥)进行统计学分析。使用非参数Mann Whitney和卡方检验确定显著性差异。因为我们对于每对夫妻都有若干观测值，所以使用具有多变量模型的广义估算方程(GEE)。p值<0.05被认为是显著的。
[0074] 结果
[0075] 基线患者特征
[0076] 研究组包括162对经受IVF或IVF-ICSI且具有至少一个转移胚胎的夫妻。在取出的1505个卵母细胞中，有1199个是成熟的(81.2％)，获得907个胚胎并且738个是二倍体。在第
2/3天，共转移了261个胚胎，其中每次转移一个或两个胚胎。在所研究的162对夫妻中，有
138对夫妻获得了完整的数据(sCD146测试结果和妊娠测试)，他们具有225个转移的胚胎(图1)。这225个转移的胚胎导致了36例临床妊娠，包括33例单胞胎和3例双胞胎。在第2天转移了146个胚胎(D2，64.8％)，在第3天转移了79个胚胎(D3，35.2％)。平均转移胚胎数目为
1.63(SD+/-0.53)，植入率为17.3％(39个孕囊/225个胚胎)。整体妊娠率为26.1％(36例妊娠/138例患者)。
2/3天，共转移了261个胚胎，其中每次转移一个或两个胚胎。在所研究的162对夫妻中，有
138对夫妻获得了完整的数据(sCD146测试结果和妊娠测试)，他们具有225个转移的胚胎(图1)。这225个转移的胚胎导致了36例临床妊娠，包括33例单胞胎和3例双胞胎。在第2天转移了146个胚胎(D2，64.8％)，在第3天转移了79个胚胎(D3，35.2％)。平均转移胚胎数目为
1.63(SD+/-0.53)，植入率为17.3％(39个孕囊/225个胚胎)。整体妊娠率为26.1％(36例妊娠/138例患者)。
[0077] 在这225个胚胎中，按照伊斯坦布尔分类，64个是“高质量胚胎”，125个是“一般质量”，并且36个是“差质量”。它们的植入率分别为26.2％、12％和5.7％。
[0078] 女性平均年龄为33.1岁(SD+/-4.51)。在21.5％的尝试中使用短激动剂方案、在58.3％的尝试中使用长激动剂方案以及在20.2％的尝试中使用拮抗剂方案来进行受控的卵巢过度刺激。54％的夫妻进行经典的体外受精，46％进行卵胞浆内单精子注射。IVF周期的平均值为1.77(SD+/-0.97)。IVF的指征与58％夫妻的男性不育或42％夫妻的女性不育有关。表1总结了所研究人群的特征(卵巢储备状态，植入的临床预后因素，卵巢响应和触发日的子宫内膜状态)。
[0079] 表1：所研究人群的特征。数据表示为平均值+/-SD和中位数[IQR]
[0080]
[0081] 来自第二天的胚胎上清液中存在sCD146
[0082] 为了确认胚胎上清液中存在sCD146，发明人对具有以下各种sCD146浓度的4个样品进行蛋白质印迹分析：通过ELISA评估为220pg/ml的第一个样品(在第2天转移)，1178pg/ml的第二个样品(在第2天转移)，3850pg/ml的第3个样品(在第3天转移)，最后一个样品是阴性对照并且对应于用于该测定的稀释剂(胚胎培养基，在与胚胎上清液相同的条件下保存但没有胚胎)(图2)。
[0083] 由于胚胎在第2天(D2)或第3天(D3)转移，发明人比较了D2和D3胚胎上清液中sCD146的浓度。在D2或D3转移之间sCD146的浓度没有表现出显著差异(p＝0.36)(图3)。
[0084] sCD146浓度和胚胎质量
[0085] 在实践中，基于胚胎的形态学选择胚胎。这是转移前评估的唯一标准。因此，发明人研究了sCD146浓度与伊斯坦布尔分类所定义的胚胎质量之间的关系。他们发现sCD146的浓度与胚胎类型无关(图4)。
[0086] sCD146浓度和IVF结果
[0087] 发明人发现在植入和未植入的胚胎之间存在sCD146浓度的显著差异(图5)，其中低浓度与高植入潜力相关。在使用共变量伊斯坦布尔分类和FSH率的调整进行逐步多变量分析后，他们证实了低sCD146浓度与植入之间的显著相关性，Wald卡方为5.39(p＝0.02)。
[0088] sCD146作为植入的生物标志物的功效
[0089] 计算出的ROC曲线显示，植入的最佳灵敏度(71％)和特异性(60％)出现在1164pg/mL sCD146处。在这个阈值，妊娠百分比增加了约40％。3个伊斯坦布尔组中都维持了这种增强，其中在高、一般和差的胚胎质量组中分别增强了20％、30％和77％(图6)。
[0090] 结论
[0091] 为了避免多胎妊娠和相关并发症的风险，有必要只选择一个胚胎进行转移。因此胚胎植入潜力的预测在IVF中是必不可少的。在这个实验中，发明人表明sCD146代表了一种用于选择具有最高植入潜力的胚胎的早期、非侵入性和创新性生物标志物。有趣的是，这种生物标志物独立于作为目前唯一选择标准的伊斯坦布尔分类所定义的形态学标准。因此，利用sCD146进行的胚胎选择对任何一组胚胎来说都是有用的。因此，sCD146代表了第一个提高胚胎选择准确性以及IVF有效性的胚胎选择生物标志物。
[0092] 早期、精确和准确选择具有最佳植入潜力的胚胎确实是增加IVF中妊娠机会的最佳策略。
[0093] 发明人在他们的实验中通过ELISA和蛋白质印迹两者证明了胚胎上清液中存在sCD146。最早可以第2天在胚胎上清液中实现这种检测。这些结果说明sCD146在IVF中是有利的生物标志物，因为直到现在还没有生物标志物可以在囊胚早期阶段中被检测到。此外，sCD146的使用显示出另一个优点，因为大多数中心在第2天或第3天转移胚胎，这是与sCD146检测相容的时期。最后，sCD146的早期检测也与降低成本有关。
[0094] 胚胎上清液中的sCD146浓度代表了一种用于选择具有最高植入潜力的胚胎的早期、非侵入性和创新性生物标志物。该生物标志物通过减少获得妊娠的时间和成本而有利地改善了IVF的有效性。
[0095] 参考文献
[0096] -生殖医学的Alpha科学家和胚胎学ESHRE特别兴趣组(Alpha Scientists in Reproductive Medicine and ESHRE Special Interest Group of Embryology).关于胚胎评估的伊斯坦布尔共识研讨会：专家会议记录(The Istanbul consensus workshop on embryo assessment:proceedings of an expert meeting).Hum Reprod.2011；26:1270-1283.
[0097] -Bardin等,FEBS Lett 1998
[0098] -Bardin等,Blood 2001
[0099] -Bardin等,Thromb Haemost 2003
[0100] -Kaspi等,Angiogenesis,2013
[0101] -Kupka MS,Ferraretti AP,de Mouzon J,Erb K,D'Hooghe T,Castilla JA,Calhaz-Jorge C,2010年欧洲辅助生殖技术：ESHRE欧洲注册结果(Assisted reproductive technology in Europe,2010:results generated from European registers by ESHRE).生殖与胚胎学(Reproduction and Embryology).Hum Reprod.2014；29:2099-113.[0102] -Liu等,J Cell Physiol,2008
[0103] -Liu等,Lab Investig J Tech Methods Pathol 2004
[0104] -McLernon DJ,Harrild K,Bergh C,Davies MJ,de Neubourg D,Dumoulin JC,Gerris J,Kremer JA,Martikainen H,Mol BW,Norman RJ,Thurin-Kjellberg A,Tiitinen A,van Montfoort AP,van Peperstraten AM,Van Royen E,Bhattacharya S.选择性单胚胎转移与双胚胎转移相比的临床有效性：来自随机试验的个体患者数据的meta分析(Clinical effectiveness of elective single versus double embryo transfer:meta-analysis of individual patient data from randomised trials).BMJ.2010；21:
341:c6945.
341:c6945.
[0105] -Pandian Z,Marjoribanks J,Ozturk O,Serour G,Bhattacharya S.在体外受精或卵胞浆内单精子注射后转移胚胎的数目(Number of embryos for transfer following in vitro fertilisation or intra-cytoplasmic sperm injection).Cochrane Database Syst Rev.2013；29；7:CD003416.
[0106] -Pasquier等,Thromb Haemost 2005
[0107] -Wang等,Journal of Reproduction and Contraception,2008
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 基于窄带物联网的错时停车管理系统与方法 | 2020-05-19 | 875 |
| 用于实体网络分析的系统和方法 | 2020-05-11 | 598 |
| 一种新型的免控件使用数字证书的方法 | 2020-05-13 | 186 |
| 一种公共事业联合缴费及电力自助综合服务终端 | 2020-05-17 | 661 |
| 一种城市环境大数据收录管理器 | 2020-05-14 | 185 |
| 自动化便民服务系统的咨询服务装置及数据处理方法 | 2020-05-19 | 505 |
| 一种电动自行车多功能后座 | 2020-05-08 | 180 |
| 一种公共事业专用办公桌 | 2020-05-11 | 29 |
| 一种发声型节水式公厕小便器 | 2020-05-08 | 525 |
| 一种高空电动树干注药器 | 2020-05-12 | 373 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
公共事业热门专利
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈