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一种濒危孑遗树种水松 种子组培苗瓶外生根培养方法

阅读：180发布：2024-02-20

专利汇可以提供一种濒危孑遗树种水松种子组培苗瓶外生根培养方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明是一种濒危孑遗树种水松种子组培苗瓶外生根培养方法。将水松种子表面消毒后接种于MS培养基中，30d时50％种子发芽，取带1.5cm长下胚轴的无菌苗顶芽为外植体，在培养基I中进行丛生芽诱导，诱导率达80％，切下新生的顶芽和带侧芽芽段，在培养基II中进行继代培养，获得继代芽，继代增殖系数7.5，反复切下继代芽顶芽和芽段，在培养基II中增殖扩繁，获得大量增殖继代芽。单个切下4‑6cm长顶芽，用含有500mg.L‑1的α‑ 萘乙酸溶液进行速蘸处理后，移栽至穴盘中瓶外生根，盖上塑料穴盘盖保湿。生根处理60d后，生根率达64％，生根苗移栽至营养钵，移栽成活率达95％。本方法简便易行，可以使瓶内难生根树种水松成功完成组培快速繁殖，可应用于大规模工厂化生产濒危孑遗树种水松，解决了水松试管无性繁殖问题。，下面是一种濒危孑遗树种水松种子组培苗瓶外生根培养方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种濒危孑遗植物水松种子组培苗瓶外生根培育方法，其特征在于：包括外植体消毒、外植体启动培养、丛生芽诱导、继代增殖扩繁、组培苗瓶外生根、移栽营养钵培育，获得水松组培瓶外生根苗，其操作步骤如下：
(1)外植体消毒：以水松饱满种子为外植体，冲洗干净后用消毒液进行消毒；
(2)外植体启动培养：消毒过的水松种子接种于MS培养基中进行萌发培养，30d时50％的种子成功萌发出芽；
(3)丛生芽诱导：截取带1.5cm下胚轴的无菌苗顶芽为外植体，在培养基I中进行丛芽诱导获得水松丛生芽；
(4)继代增殖扩繁：将诱导出的丛生芽，单个切下丛生芽的顶芽和带侧芽芽段，接种到培养基II中进行增殖，获得继代芽，重复循环继代芽增殖的步骤，直至获得大量足够瓶外生根的继代芽；
-1
(5)组培苗瓶外生根：将单个切下生长健壮、高4-6cm的继代芽，用含有200mg·L ，
300mg·L-1，500mg·L-1的α-萘乙酸溶液进行速蘸处理后，移植于装有瓶外生根基质的穴盘中，种植后盖上塑料穴盘盖保湿；
(6)移栽到营养钵：待苗木生根后长势稳定时，移栽到营养钵，并按常规方法进行水肥及病虫害等育苗管理；
步骤(3)所述的培养基I其原料组分为：MS培养基+ZT 0.1mg·L-1+IBA 0.1mg·L-1+卡拉胶9g·L-1+蔗糖30g·L-1，pH调至5.8；
步骤(4)所述的培养基II其原料组分为：MS培养基+ZT 0.5mg·L-1+IBA 0.3mg·L-1+卡拉胶9g·L-1+蔗糖30g·L-1，pH调至5.8；
步骤(2)-(4)控制温度25±2℃，光照1500-2000Lx，每日光照12h；
步骤(5)瓶外生根基质其原料组分和体积配比为：泥炭土：珍珠岩＝5：1；移栽之前，移栽基质用高温的方法进行消毒，移栽时基质湿度保持在60-70％；移栽后，用塑料穴盘盖覆盖，保持空气湿度在80-90％；
步骤(5)控制温度22-29℃，光照5000-6000Lx，每日光照12h。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)所述的外植体消毒方法是：取饱满水松种子，自来水冲洗干净后，用0.1％HgCl2消毒3-8min，用无菌水冲洗2遍，接种于MS培养基中。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)所述的MS培养基的组分为：NH4NO3
1650mg·L-1；KNO3 1900mg·L-1；MgSO4·7H2O 370mg·L-1；KH2PO4 170mg·L-1；CaCl2·2H2O
440mg·L-1；Na2-EDTA 37.3mg·L-1；FeSO4·7H2O 27.8mg·L-1；MnSO4·4H2O 22.3mg·L-1；
ZnSO4.7H2O 8.6mg·L-1；H3BO3 6.2mg·L-1；KI 0.83mg·L-1；Na2MoO4·2H2O 0.25mg·L-1；
-1 -1 -1
CuSO4·5H2O 0.025mg·L ；CoCl2·6H2O 0.025mg·L ；肌醇100mg·L ；维生素B1
0.1mg·L-1；烟酸0.5mg·L-1；维生素B6 0.5mg·L-1；甘氨酸2.0mg·L-1。

说明书全文

一种濒危孑遗树种水松 种子组培苗瓶外生根培养方法

技术领域

[0001] 本发明属于濒危树种植物组织培养繁殖技术领域，具体涉及一种濒危树种水松组织培养技术，尤其涉及一种水松种子组培苗瓶外生根培育方法。

背景技术

[0002] 水松Glyptostrobus pensilis Staunt.Koch，又名水莲、水帝松、水杉松、水枞、水极、长柏等，水松为杉科(Taxodiaceae)水松属落叶或半落叶乔木，是仅零星分布于我国广东、广西、福建、江西、云南等南方省区和越南北部的单种属植物。水松始生于1亿多年前的中生代，号称“植物活化石”，是与恐龙同时代的原始古生物，1999年国务院公布《国家重点保护野生植物名录》中被列为我国一级保护植物。水松在中生代时曾广泛分布于北半球，至晚第三纪，特别是第四纪冰川期以后，气温下降，水松的分布区剧烈收缩南移，最后在北美和欧洲均灭绝，仅在受冰期影响较小的我国长江流域以南部分地区及越南保存下来，成为孑遗树种。因此，水松对研究杉科植物系统发育、古植物学和第四纪冰川气候等方面都有重要的科学价值，对物种的形成与演化，物种资源的保护均有重大的科学意义。

[0003] 水松树形优美，树干粗壮挺直。枝叶疏密适度，可做庭园观赏树和风景林。其根系发达，由于可以产生屈膝状呼吸根，因此可以直接生长于水边或沼泽地，是防风固堤和农田防护的优良树种。水松的材质轻软，能耐水湿，耐腐力强，除做建筑用材外，还可用于造船、涵洞和木闸板。球果及树皮含单宁，可提取拷胶，用于浸染渔网。根部木质更轻，浮力大，被广泛用于加工救生圈和软木塞。水松树皮、叶和果实均可入药，可以治疗风湿性关节炎和皮炎等疾病。

[0004] 水松对生境的依赖程度很高，繁殖更新能力不强，自然条件下，种子多数是掉落在水中，被水浸坏，不能萌发；幼苗不能长期生长在水中，怕霜冻；成年树易受冻害，不耐污浊的空气，尤忌含硫的气体；球果易受虫害，严重影响结实率。种种因素导致水松的自然更新困难，加之人们对水松的过度砍伐开发，致使现在只保留了极少量的天然林群落，大部分地区的水松为栽培群落，而且个体数量日益减少。对水松的组织培养繁殖技术的研究是克服水松自然繁殖困难的有效方法。水松因其树体高大并且多生长于水边，因此采种困难，扦插繁殖生根率又很低，研究水松组织培养繁殖技术是一条高效快速的扩繁途径，水松种子组培苗瓶内生根非常困难，生根率很低，瓶外生根方法的研究成功为组培快繁濒危孑遗树种水松提供了可靠的技术支撑。

发明内容

[0005] 本发明提供了一种濒危孑遗树种水松种子组培苗瓶外生根培育方法。

[0006] 本发明是这样实现的：

[0007] 一种水松种子组培苗瓶外生根方法，包括种子外植体消毒、外植体启动培养、丛生芽诱导、继代增殖扩繁、组培苗瓶外生根、移栽至营养钵，其操作步骤如下：

[0008] (1)外植体消毒：以水松饱满种子为外植体，冲洗干净后用消毒液进行消毒。

[0009] (2)外植体启动培养：消毒过的水松种子接种于MS培养基中进行萌发培养，30d时50％的种子成功萌发出芽。

[0010] (3)丛生芽诱导：截取带1.5cm下胚轴的无菌苗顶芽为外植体，在培养基I中进行丛芽诱导获得水松丛生芽；

[0011] (4)继代增殖扩繁：将诱导出的丛生芽，单个切下伸长芽的顶芽和带侧芽芽段，接种到培养基II中进行增殖，获得继代芽，重复循环继代芽增殖的步骤，直至获得大量足够瓶外生根培养的继代芽；

[0012] (5)组培苗瓶外生根：将单个切下生长健壮、高4-6cm的继代芽，用含有200mg.L-1、300mg.L-1、500mg.L-1的α-萘乙酸溶液进行速蘸处理后，移植于装有瓶外生根基质的穴盘中，种植后盖上塑料穴盘盖保湿。

[0013] (6)移栽到营养钵：待苗木生根后长势稳定时，移栽到营养钵，并按常规方法进行水肥及病虫害等育苗管理。

[0014] 以上所述的MS培养基组分为：NH4NO3 1650mg.L-1；KNO3 1900mg.L-1；MgSO4.7H2O 370mg.L-1；KH2PO4 170mg.L-1；CaCl2.2H2O 440mg.L-1；Na2-EDTA 37.3mg.L-1；FeSO4.7H2O
27.8mg.L-1；MnSO4.4H2O 22.3mg.L-1；ZnSO4.7H2O 8.6mg.L-1；H3BO3 6.2mg.L-1；KI 0.83mg.L-1 -1 -1 -1
；Na2MoO4.2H2O 0.25mg.L ；CuSO4.5H2O 0.025mg.L ；CoCl2.6H2O 0.025mg.L ；肌醇
100mg.L-1；维生素B1 0.1mg.L-1；烟酸0.5mg.L-1；维生素B6 0.5mg.L-1；甘氨酸2.0mg.L-1。

[0015] 以上所述的培养基I其原料组分为：MS培养基+ZT 0.1mg.L-1+IBA 0.1mg.L-1+卡拉胶9g.L-1+蔗糖30g.L-1，pH调至5.8。

[0016] 以上所述的培养基II其原料组分为：MS培养基+ZT 0.5mg.L-1+IBA 0.3mg.L-1+卡拉胶9g.L-1+蔗糖30g.L-1，pH调至5.8。

[0017] 以上所述的丛生芽诱导、继代增殖扩繁控制温度25±2℃，光照1500-2000Lx，每日光照12h。

[0018] 以上所述的瓶外生根基质其原料组分和体积配比为：泥炭土∶珍珠岩＝5∶1。移栽之前，移栽基质用高温的方法进行消毒，移栽时基质湿度保持在60-70％。移栽后，用塑料穴盘盖覆盖，保持穴盘盖内空气湿度在80-90％。

[0019] 以上所述的组培苗瓶外生根过程控制温度22-29℃，光照5000-6000Lx，每日光照12h。

[0020] 本发明相对于现有的技术具有以下两个方面特点：

[0021] 1、本发明的水松种子组培苗瓶外生根方法，使瓶内生根困难的水松组织培养快速繁殖得以实现，且简化了试管苗生产程序，降低了生产成本，提高了生产效率。

[0022] 2、采用本发明的生根方法，生根效率显著提高，生根处理60d后，水松种子组培苗生根率达60％以上，最高生根率达64％，且根系质量较高，移栽成活率达90％以上，最高成活率达95％以上，具有较好的经济效益，社会效益和生态效益。附图说明

[0023] 图1无菌水松种子萌发

[0024] 图2水松种子组培苗丛生芽诱导

[0025] 图3水松种子组培苗继代增殖培养

[0026] 图4移栽至穴盘的水松瓶外生根苗

[0027] 图5生根的水松瓶外生根苗

[0028] 图6移栽至营养钵的水松瓶外生根苗

具体实施方式

[0029] 下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

[0030] 实施例1

[0031] 1、实验材料

[0032] 水松种子由珠海市斗门县林业局提供。

[0033] 2、实验方法

[0034] (1)外植体消毒和启动培养

[0035] 取饱满水松种子，自来水冲洗干净后，用0.1％HgCl2消毒8min，用无菌水冲洗3遍，接种于MS培养基中。30d时50％的种子成功萌发出芽。

[0036] (2)丛生芽诱导

[0037] 截取带1.5cm下胚轴的无菌苗顶芽为外植体，接种到MS培养基+ZT 0.1mg.L-1+IBA 0.1mg.L-1+卡拉胶9g.L-1+蔗糖30g.L-1中进行丛芽诱导，培养30d后，获得水松无菌丛生芽；
平均丛芽诱导率达80％。

[0038] (3)继代增殖扩繁

[0039] 将诱导出的丛生芽，单个切下丛生芽的顶芽和带侧芽芽段，接种到MS培养基+ZT 0.5mg.L-1+IBA 0.3mg.L-1+卡拉胶9g.L-1+蔗糖30g.L-1，中进行增殖，90d后，形成新的丛生芽，且新芽伸长良好，有的芽可以伸长8-10cm，培养1代增殖系数达7.5。反复切下丛生芽的顶芽和带侧芽芽段，接种于上述培养基中，重复增殖步骤，直至获得大量足够瓶外生根的继代芽；

[0040] (4)组培苗瓶外生根

[0041] 将单个切下生长健壮、高4-6cm的继代芽，用含有200mg.L-1的α-萘乙酸溶液进行速蘸处理后，移植于装有瓶外生根基质的穴盘中，基质原料组分和体积配比为：泥炭土∶珍珠岩＝5∶1，移栽之前将基质进行高温消毒，移栽时基质湿度保持在60-70％，移栽后盖上塑料穴盘盖保湿，使空气湿度保持在80-90％。20d之后有小根形成。根据基质湿度情况及时喷雾化水，保证基质湿度和空气湿度达到以上的最佳水平。60d后形成一定的根系，生根率达到55％，将生根苗移栽至营养钵，进行常规水肥和病虫害防治管理，成活率达90％以上。

[0042] 上述启动培养、丛生芽诱导、继代增殖扩繁控制温度25±2℃，光照1500-2000Lx，每日光照12h。

[0043] 上述组培苗瓶外生根过程控制温度22-29℃，光照5000-6000Lx，每日光照12h。

[0044] 实施例2

[0045] 1、实验材料

[0046] 水松种子由珠海市斗门县林业局提供。

[0047] 2、实验方法

[0048] (1)外植体消毒和启动培养

[0049] 取饱满水松种子，自来水冲洗干净后，用0.1％HgCl2消毒5min，用无菌水冲洗3遍，接种于MS培养基中。30d时45％的种子成功萌发出芽。

[0050] (2)丛生芽诱导

[0051] 截取带1.5cm下胚轴的无菌苗顶芽为外植体，接种到MS培养基+ZT 0.1mg.L-1+IBA 0.05mg.L-1+卡拉胶9g.L-1+蔗糖30g.L-1中进行丛芽诱导，培养30d后，获得水松无菌丛生芽；
平均丛芽诱导率达75％。

[0052] (3)继代增殖扩繁

[0053] 将诱导出的丛生芽，单个切下丛生芽的顶芽和带侧芽芽段，接种到MS培养基+ZT 0.3mg.L-1+IBA 0.1mg.L-1+卡拉胶9g.L-1+蔗糖30g.L-1，中进行增殖，90d后，形成新的丛生芽，且新芽伸长良好，有的芽可以伸长7-9cm，培养1代增殖系数达6.9。反复切下丛生芽的顶芽和带侧芽芽段，接种于上述培养基中，重复增殖步骤，直至获得大量足够瓶外生根的继代芽；

[0054] (4)组培苗瓶外生根

[0055] 将单个切下生长健壮、高4-6cm的继代芽，用含有300mg.L-1的α-萘乙酸溶液进行速蘸处理后，移植于装有瓶外生根基质的穴盘中，基质原料组分和体积配比为：泥炭土∶珍珠岩＝5∶1，移栽之前将基质进行高温消毒，移栽时基质湿度保持在60-70％，移栽后盖上塑料穴盘盖保湿，使空气湿度保持在80-90％。20d之后有小根形成。根据基质湿度情况及时喷雾化水，保证基质湿度和空气湿度达到以上的最佳水平。60d后形成一定的根系，生根率达到60.00％，将生根苗移栽至营养钵，进行常规水肥和病虫害防治管理，成活率达92％以上。

[0056] 上述启动培养、丛生芽诱导、继代增殖扩繁控制条件同实施例1。

[0057] 上述组培苗瓶外生根控制条件同实施例1。

[0058] 实施例3

[0059] 1、实验材料

[0060] 水松种子由珠海市斗门县林业局提供。

[0061] 2、实验方法

[0062] (1)外植体消毒和启动培养

[0063] 取饱满水松种子，自来水冲洗干净后，用0.1％HgCl2消毒3min，用无菌水冲洗3遍，接种于MS培养基中。30d时40％的种子成功萌发出芽。

[0064] (2)丛生芽诱导

[0065] 截取带1.5cm下胚轴的无菌苗顶芽为外植体，接种到MS培养基+ZT 0.1mg.L-1+IBA 0.3mg.L-1+卡拉胶9g.L-1+蔗糖30g.L-1中进行丛芽诱导，培养30d后，获得水松无菌丛生芽；
平均丛芽诱导率达70％。

[0066] (3)继代增殖扩繁

[0067] 将诱导出的丛生芽，单个切下丛生芽的顶芽和带侧芽芽段，接种到MS培养基+ZT 0.5mg.L-1+IBA 0.1mg.L-1+卡拉胶9g.L-1+蔗糖30g.L-1，中进行增殖，90d后，形成新的丛生芽，且新芽伸长良好，有的芽可以伸长6-10cm，培养1代增殖系数达6.5。反复切下丛生芽的顶芽和带侧芽芽段，接种于上述培养基中，重复增殖步骤，直至获得大量足够瓶外生根的继代芽；

[0068] (4)组培苗瓶外生根

[0069] 将单个切下生长健壮、高4-6cm的继代芽，用含有500mg.L-1的α-萘乙酸溶液进行速蘸处理后，移植于装有瓶外生根基质的穴盘中，基质原料组分和体积配比为：泥炭土∶珍珠岩＝5∶1，移栽之前将基质进行高温消毒，移栽时基质湿度保持在60-70％，移栽后盖上塑料穴盘盖保湿，使空气湿度保持在80-90％。20d之后有小根形成。根据基质湿度情况及时喷雾化水，保证基质湿度和空气湿度达到以上的最佳水平。60d后形成一定的根系，生根率达到64％，将生根苗移栽至营养钵，进行常规水肥和病虫害防治管理，成活率达95％以上。

[0070] 上述启动培养、丛生芽诱导、继代增殖扩繁控制条件同实施例1。

[0071] 上述组培苗瓶外生根控制条件同实施例1。

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