(一)技术领域
[0001] 本
发明涉及一种针对弓形虫核酸的恒温扩增快速检测方法，适合对弓形虫核酸的定性检测。(二)背景技术
[0002] 先天性弓形虫病是一种在人类优生优育中受到极大关注的寄生虫病，其病原体刚地弓形虫(Toxoplasma gondii，Tox)经母体胎盘传播，从而感染
胎儿。在母体早孕期间可导致流产、早产、死产、畸形和无脑儿、脑积
水、小头畸形等；在妊娠中、晚期，婴儿多呈隐性感染，出生后可出现精神
运动障碍、脑
钙化灶、
视网膜脉络膜炎等先天性弓形虫病症候群。2005年，全国第2次寄生虫调查显示，孕妇感染率为6.25％-32.9％。我国每年约有5.5-9万名新生儿受弓形虫侵害，对母婴健康造成极大的危害，严重影响出生人口素质，给优生优育工作带来极大障碍。
[0003] 目前，Tox已被列为全球感染性致畸TORCH综合征的重要病因。妊娠期Tox感染产前诊断直接关系到胎儿的处置，能在孕前和孕早期发现宫内感染是
预防先天性弓形虫病发生的重要措施。如在孕前或孕早期检测，及时采取相应措施，可减少63％的先天性弓形虫感染。虽然Tox
抗体检测是我国优生优育5项检测中的项目之一，但目前病原学、免疫学、分子
生物学等实验室检测方法对弓形虫病的早期诊断仍存在许多不足，不能满足优生优育中准确、快速、简便的检测需求。因此，建立一种核酸快速检测方法对弓形虫病的防治至关重要，使临床医师能及早、准确地诊断孕前与孕期的Tox感染，对于指导临床用药、防止宫内感染、控制畸形胎儿出生，实现人群的优生优育具有十分重要意义。
[0004] 交叉引物恒温扩增技术(Crossing Priming Amplification，CPA)是一项全新的恒温扩增检测技术。该技术与LAMP、RCA、TMA、NASBA等恒温扩增技术的引物设计原理不尽相同，不论是在反应系统还是产物判定上都有很大改进和创新，反应更加迅速、检测灵敏度更高。基于此，本研究拟采用交叉引物恒温扩增技术，开发一种快速、简便的弓形虫核酸检测方法，为孕前及孕期育龄妇女Tox感染的早期、快速、准确诊断提供技术支持。(三)发明内容
[0005] 本发明目的是提供一种准确、灵敏、快速地检测弓形虫核酸的恒温扩增检测试剂盒及其检测方法。
[0006] 本发明采用的技术方案是：
[0007] 本发明提供一种弓形虫核酸恒温扩增检测试剂盒，所述试剂盒包括：
[0008] (1)DNA提取试剂；
[0009] (2)PCR恒温扩增反应液；所述PCR恒温扩增反应液包括引物和探针；所述引物为外围引物和扩增交叉引物；所述探针为正向5′端Biotin标记探针和反向5′端FAM标记探针；
[0010] 所述外围引物为正向外围引物和反向外围引物，其核苷酸序列如下：
[0011] 正向外围引物为(F3)：5′-CGACATCGCATTCAAGGGA-3′；
[0012] 反向外围引物为(B3)：5′-GTGGCTTTTCTGGAGGTACA-3′；
[0013] 所述探针的核苷酸序列为：
[0014] 正向5′端Biotin标记探针(LF)：
[0015] 5′-Biotin-TCTCTTGTCTCGAATACACGAAC-3′；
[0016] 反向5′端FAM标记探针(LB)：
[0017] 5′-FAM-TGCCAGAAGAAGGGTACGT-3′；
[0018] 所述扩增交叉引物为扩增正向引物和扩增反向引物，其核苷酸序列分别为：
[0019] 扩增正向引物(FIP)：
[0020] 5′-CTTCAGCCGTCTTGTGGGGG-AGAGATCCAGCAGATCTCGT-3′；
[0021] 扩增反向引物(BIP)：
[0022] 5′-TTGTGCTGCCTCCTCTCATGG-CAGCGGGAAATACAGCTCTT-3′；
[0023] (3)阳性对照：含有弓形虫B1基因的DNA质粒；
[0024] (4)阴性对照：无菌双蒸水。
[0025] 进一步，本发明所述阳性对照为含有长度为210bp的弓形虫B1基因序列的
片段，所述弓形虫B1基因的核苷酸序列如下(SEQ ID NO.1)：
[0026] acgac atcgcattca agggaagaga tccagcagat ctcgttcgtg tattcgagac aagagagatc cgcccccaca agacggctga agaatgcaac attcttgtgc tgcctcctct catggcaaat gctagaagaa gggtacgtgt tgcatcataa caagagctgt atttcccgct ggcaaataca ggtgaaatgt acctccagaa aagccac。
[0027] 进一步，本发明所述阳性对照按如下步骤制备：
[0028] 以包含扩增区域的弓形虫B1基因为模板，通过两条外围引物进行PCR扩增获得目的基因；利用PCR纯化试剂盒对PCR扩增产物进行纯化；将纯化后的扩增产物通过T-easy质粒
转染试剂盒构建完整的含有目的基因的质粒序列，用分光光度计对所抽提的质粒定量并稀释至1个拷贝/μl，获得阳性对照，-20℃保存。
[0029] 进一步，本发明所述PCR恒温扩增反应液包括：DNA、引物、探针、10×Buffer(NEB公司)，MgSO4，dNTPs溶液，Bst DNA聚合酶(NEB公司)和无菌双蒸水。
[0030] 进一步，本发明所述PCR恒温扩增反应液组成为：引物2μL、Bst DNA聚合酶1μL、10×buffer 2μL、dNTP终浓度为1.4μmoL/L、MgSO4终浓度为10μmoL/L、DNA 2-3μL，加水至终体积为25μL；所述引物混合物为3对引物(浓度稀释为20μmoL/L)按照FIP：BIP：LF：LB：F3：B3＝4：4：2：2：1：1的体积比混合而成。
[0031] 本发明还提供一种所述弓形虫核酸恒温扩增检测试剂盒的应用方法，所述应用方法为：
[0032] a)用DNA提取试剂从待检测的标本中提取DNA；
[0033] b)将步骤a)提取得到的DNA作为模板加入到装有恒温扩增反应液的PCR管中，在65℃下扩增反应35分钟；标准阳性模板(即阳性对照)加入阳性对照PCR管中，标准阴性模板(即阴性对照)加入阴性对照PCR管中，所述标准阳性模板为含有弓形虫B1基因片段的质粒，所述标准阴性模板为无菌双蒸水；
[0034] c)将反应后的PCR管放置到核酸
试纸条防污染检测装置(购自杭州优思达生物技术公司3号装置)中进行检测，2分钟以后判读结果，当试纸条的检测线呈阳性时，说明样品中含有弓形虫核酸。该试纸条包括在带有不干胶的
衬垫上按顺序有样品垫、有色颗粒结合物垫和吸水
滤纸垫，上述各部分在相邻处部分重叠，
纤维膜上设有检测线和质控线，其中有色颗粒结合物垫上的有色颗粒有抗FAM抗体包被，检测线上有亲和素包被，质控线上有抗FAM抗体，有色颗粒选自胶体金颗粒、乳胶颗粒。
[0035] 在本发明提供的试剂盒中，有两条外围引物，两条交叉引物和两条检测探针。本试剂盒中的6条寡聚核苷酸序列依靠Bst DNA聚合酶的高活性的链置换特性，使得链置换DNA合成不断的自我扩增循环。在本发明提供的弓形虫核酸的恒温扩增检测试剂盒中，对不同2+
的反应条件进行了优化，如引物和探针的浓度，Mg 浓度，反应
温度等的优化，并将本发明与核酸检测试纸条检测系统相结合，建立了弓形虫核酸恒温扩增定性检测的方法。该试剂盒的灵敏度可达到104copies/mL，可以满足快速检测弓形虫核酸的要求，作为弓形虫病确诊的一个辅助方法，具体弓形虫病的确诊还需要结合临床诊断。
[0036] 本发明与
现有技术相比，具有以下优点和效果：
[0037] (1)本发明所述弓形虫的核酸恒温扩增检测试剂盒的特异性好，灵敏度高，步骤简单，可重复性高；灵敏度可达到104copies/mL；
[0038] (2)反应速度快，恒温扩增仅需35min，核酸试纸条检测结果需1～2min，单个样本从样本处理到完成检测，仅需1小时左右；
[0039] (3)整个扩增和检测过程中不需要打开PCR管盖，减少了扩增产物污染的机会；整个反应过程不需要复杂的仪器。(四)
附图说明
[0040] 图1为核酸检测试纸条原理示意图。
[0041] 图2为特异性实验结果，图中1-7分别表示恶性疟，间日疟，卵形疟classical亚型，卵形疟wallikeri亚型，三日疟，巴贝虫，利士曼原虫。
[0042] 图3为敏感性实验，图中1-6分别表示4.5×107、4.5×106、4.5×105、4.5×104、4.5×103和4.5×102copies/ml的实验结果。(五)具体实施方式
[0043] 下面结合具体
实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
[0044] 实施例1本发明弓形虫核酸恒温扩增试剂盒的组成与配制
[0045] (1)DNA提取试剂，Qiagen的DNA提取试剂盒；
[0046] (2)恒温扩增反应液：引物2μL、Bst DNA聚合酶1μL、10×buffer 2μL、dNTP终浓度为1.4μmoL/L、MgSO4终浓度为10μmoL/L、DNA 2-3μL，加水至终体积为25μL；所述引物混合物为3对引物(浓度稀释为20μmoL/L)按照FIP：BIP：LF：LB：F3：B3＝4：4：2：2：1：1的体积比混合而成；
[0047] 所述外围引物为正向外围引物和反向外围引物，其核苷酸序列如下：
[0048] 正向外围引物为(F3)：5′-CGACATCGCATTCAAGGGA-3′；
[0049] 反向外围引物为(B3)：5′-GTGGCTTTTCTGGAGGTACA-3′；
[0050] 所述两条探针的核苷酸序列分别为：
[0051] 正向5′端Biotin标记探针(LF)：
[0052] 5′-Biotin-TCTCTTGTCTCGAATACACGAAC-3′；
[0053] 反向5′端FAM标记探针(LB)：
[0054] 5′-FAM-TGCCAGAAGAAGGGTACGT-3′；
[0055] 所述两条扩增交叉引物为扩增正向引物和扩增反向引物，其核苷酸序列分别为：
[0056] 扩增正向引物(FIP)：
[0057] 5′-CTTCAGCCGTCTTGTGGGGG-AGAGATCCAGCAGATCTCGT-3′；
[0058] 扩增反向引物(BIP)：
[0059] 5′-TTGTGCTGCCTCCTCTCATGG-CAGCGGGAAATACAGCTCTT-3′；
[0060] 所有的引物和探针均由上海生工生物有限公司合成。
[0061] (3)阳性对照：含有长约210bp的弓形虫B1基因序列，弓形虫B1基因序列如SEQ ID NO.1所示：
[0062] acgac atcgcattca agggaagaga tccagcagat ctcgttcgtg tattcgagac aagagagatc cgcccccaca agacggctga agaatgcaac attcttgtgc tgcctcctct catggcaaat gctagaagaa gggtacgtgt tgcatcataa caagagctgt atttcccgct ggcaaataca ggtgaaatgt acctccagaa aagccac；
[0063] 阳性对照按如下步骤制备：
[0064] 以包含扩增区域的弓形虫B1基因基因片段为模板，通过两条外围引物进行PCR扩增获得目的基因；利用PCR纯化试剂盒对PCR扩增产物进行纯化；将纯化后的扩增产物通过T-easy质粒转染试剂盒构建完整的含有目的基因的质粒序列，用分光光度计对所抽提的质粒测A280定量并稀释至1个拷贝/μl，-20℃保存。
[0065] (4)阴性对照：无菌双蒸水。
[0066] 实施例2用本发明试剂盒检测弓形虫核酸的具体方法
[0067] a)用DNA提取试剂从待检测的标本中提取DNA；
[0068] b)取步骤a)获得的DNA作为模板，加入到装恒温扩增反应液的PCR管中，其中模板DNA 3μl，反应液总体积25μl，60℃扩增反应35分钟；阳性和阴性对照PCR管中分别加入阳性模板和阴性模板。
[0069] c)将反应后的PCR管放置到核酸试纸条防污染检测装置(杭州优思达生物技术公司3号装置)中进行检测，2分钟以后判读结果。当样本中含有弓形虫核酸时，试纸条的检测线上呈阳性。所述核酸试纸条防污染检测装置包括：在带有不干胶的衬垫上按顺序有样品垫、有色颗粒结合物垫和吸水滤纸垫，上述各部分在相邻处部分重叠，纤维膜上设有检测线(C)和质控线(T)，其中有色颗粒结合物垫上的有色颗粒有抗FAM抗体包被，检测线上有亲和素包被，质控线上有抗FAM抗体，有色颗粒选自胶体金颗粒。
[0070] 反复重复实验3次，检测结果无显著性差异，说明本试剂盒的不同批次间的检测结果具有可比性，具有良好的重复性。上述实施例说明，用本发明的试剂盒来检测重复性好，且对样本的检测仅仅需要1个小时左右就能完成，大大缩短检测时间。
[0071] 实施例3用本发明试剂盒检弓形虫的特异性
[0072] 按照实施例2的方法检测恶性疟，间日疟，卵形疟classical亚型，卵形疟wallikeri亚型，三日疟，巴贝虫，利士曼原虫等原虫的核酸样本，检测均为阴性，如图2所示，提示用本发明试剂盒检测弓形虫核酸具有很强的特异性。
[0073] 实施例4用本发明试剂盒检测弓形虫核酸的灵敏度
[0074] 对含有弓形虫B1基因片段的质粒DNA进行定量，分别稀释至浓度为107、106、105、104、103和102copies/ml，采用实施例2中所述方法来确定本发明试剂盒用于检测弓形虫核酸的灵敏度，结果如图3所示，图中1-6分别表示107、106、105、104、103和102copies/ml的实验结果，可以发现该试剂盒检测灵敏度可达104copies/mL，可以满足快速检测弓形虫的要求。
