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一种用于对鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌进行同时计数的培养基及其应用

阅读：395发布：2024-01-22

专利汇可以提供一种用于对鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌进行同时计数的培养基及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供了一种用于对鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌进行同时计数的培养基及其应用，该培养基是由盐酸林可霉素改良MRS琼脂后得到，本发明首创性的将盐酸林可霉素改良MRS琼脂后的培养基用于鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌的同时计数。本发明还进一步提供了应用上述培养基对鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌进行同时计数的方法，首先取上述培养基并放置凝固得基础层，而后在基础层上加入待测混合样品和上述培养基并放置凝固得中间层，随后在中间层上加入上述培养基并放置凝固得表层，上述基础层、中间层与表层构成夹层平板，最后将夹层平板进行厌氧培养后，分别对鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌进行计数。上述方法降低了实验器皿、实验试剂和人力资源成本。，下面是一种用于对鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌进行同时计数的培养基及其应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种用于对鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌进行同时计数的培养基，其特征在于，所述培养基是由盐酸林可霉素改良MRS琼脂后得到。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基是通过如下方法制备：
(1)将MRS琼脂融化并在45℃～55℃下保温；
(2)向步骤(1)中加入浓度为0.005～0.01mg/mL的盐酸克林霉素溶液；
其中，所述MRS琼脂与所述盐酸克林霉素溶液的体积比为100：(0.5～1.2)。
3.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于，所述盐酸克林霉素溶液的浓度为
0.01mg/mL。
4.根据权利要求2或3所述的培养基，其特征在于，所述MRS琼脂与所述盐酸克林霉素溶液的体积比为100：1。
5.一种权利要求1-4任一项所述的培养基在对鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌进行同时计数中的应用。
6.一种应用权利要求1-4任一项所述的培养基对鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌进行同时计数的方法，包括如下步骤，
基础层的制备：取所述培养基并放置凝固得基础层；
中间层的制备：在所述基础层上加入待测混合样品和所述培养基混合均匀并放置凝固得中间层；
表层的制备：在所述中间层上加入所述培养基并放置凝固得表层；
所述基础层、中间层与表层构成夹层平板；
对所述夹层平板进行厌氧培养，然后分别对所述鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌进行计数；
其中，所述待测混合样品至少包含鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述待测混合样品还包括双歧杆菌和/或嗜热链球菌。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述厌氧培养的温度为35℃～37℃，时间为48h～72h。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述厌氧培养的温度为36℃，时间为72h。
10.根据权利要求6-9任一项所述的方法，其特征在于，分别构成所述基础层、中间层和表层的所述培养基的体积比为(5～10)：(10～15)：(5～10)。

说明书全文

一种用于对鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌进行同时计数的培养

基及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于菌种计数技术领域，具体涉及一种用于对鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌进行同时计数的培养基及其应用。

背景技术

[0002] 乳酸菌具有改善胃功能、调整肠道菌群、抑制病原菌生长、提高蛋白质和维生素代谢、防止便秘、缓解乳糖不耐症、抗肿瘤、增强免疫系统和降低胆固醇等功效，因此被越来越多的添加到食品和保健品中。嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌和嗜热链球菌等均属于乳酸菌，为了确保上述乳酸菌在人体内发挥正常的生理保健功能，食品组织和保健品组织均要求对乳酸菌产品中不同乳酸菌菌种的含量进行标识，因此，研究简便易行的乳酸菌计数方法，对于加强乳酸菌产品的监控、提高产品质量和保护消费者的利益及健康均具有极其重要的意义。

[0003] 《中华人民共和国轻工行业标准QB/T 4575-2013》中公开了嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、双歧杆菌和嗜热链球菌等乳酸菌的计数方法，该计数方法通过利用选择性培养基，使目标菌生长，抑制非目标菌生长，以达到选择性计数的目的。例如，对于嗜酸乳杆菌与其他乳酸菌的混合产品的选择性检测，采用盐酸克林霉素和盐酸环丙沙星改性的MRS培养基进行厌氧培养以抑制除嗜酸乳杆菌外的其他乳酸菌生长，而此培养基上嗜酸乳杆菌生长良好，由此可实现嗜酸乳杆菌的选择性计数；对于鼠李糖乳杆菌与其他乳酸菌的混合产品的选择性检测，采用万古霉素改性的MRS培养基进行厌氧培养以抑制除鼠李糖乳杆菌外的其他乳酸菌生长，而此培养基上鼠李糖乳杆菌生长良好，由此可实现鼠李糖乳杆菌的选择性计数；对于双歧杆菌与其他乳酸菌的混合产品的选择性检测，采用莫匹罗星锂盐溶液改性的MRS培养基进行厌氧培养以抑制除双歧杆菌外的其他乳酸菌生长，而此培养基上双歧杆菌生长良好，由此可实现双歧杆菌的选择性计数。

[0004] 然而，上述方法均只能针对单一菌种进行计数，而乳酸菌产品中含有的乳酸菌菌种种类较多，采用上述方法计数时，每一种乳酸菌菌种的选择性计数都需要单独进行检测实验，每个检测实验都需要配制合适的选择性培养基，不仅消耗大量的实验器材(例如实验器皿、实验试剂)，而且人力资源的成本也较高。因此，亟需研发一次检测实验可同时实现两种或两种以上乳酸菌菌种的计数方法，以达到降低实验器皿、实验试剂等的消耗，同时节省人力成本，提高工作效率的目的。

发明内容

[0005] 本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术中乳酸菌产品的计数方法只能针对单一菌种进行计数，造成实验器皿、实验试剂和人力资源的成本较高的缺陷，进而提供一种混合样品中鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌同时计数的方法，从而降低实验器皿、实验试剂和人力资源的成本、提高工作效率使之有利于企业对乳酸菌菌种的计数。

[0006] 本发明解决上述技术问题采用的技术方案为：

[0007] 一种用于对鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌进行同时计数的培养基，所述培养基是由盐酸林可霉素改良MRS琼脂后得到。

[0008] 上述培养基是通过如下方法制备：

[0009] (1)将MRS琼脂融化并在45℃～55℃下保温；

[0010] (2)向步骤(1)中加入浓度为0.005～0.01mg/mL的盐酸克林霉素溶液；其中，所述MRS琼脂与所述盐酸克林霉素溶液的体积比为100：(0.5～1.2)。

[0011] 所述盐酸克林霉素溶液浓度为0.01mg/mL。

[0012] 所述MRS琼脂与所述盐酸克林霉素溶液的体积比为100：1。

[0013] 一种上述培养基在对鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌进行同时计数中的应用。

[0014] 一种应用上述培养基对鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌进行同时计数的方法，包括如下步骤，

[0015] 基础层的制备：取所述培养基并放置凝固得基础层；

[0016] 中间层的制备：在所述基础层上加入待测混合样品和所述培养基混合均匀并放置凝固得中间层；

[0017] 表层的制备：在所述中间层上加入所述培养基并放置凝固得表层；

[0018] 所述基础层、中间层与表层构成夹层平板；

[0019] 对所述夹层平板进行厌氧培养，然后分别对所述鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌进行计数；

[0020] 其中，所述待测混合样品至少包含鼠李糖乳杆菌和/或嗜酸乳杆菌。

[0021] 所述待测混合样品还包括双歧杆菌或嗜热链球菌。

[0022] 所述厌氧培养的温度为35℃～37℃，时间为48h～72h。

[0023] 所述厌氧培养的温度为36℃，时间为72h。

[0024] 分别构成所述基础层、中间层和表层的所述培养基的体积比为(5～10)：(10～15)：(5～10)。

[0025] 本发明的上述技术方案具有如下优点：

[0026] (1)本发明所述的用于对鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌进行同时计数的培养基，该培养基是由盐酸林可霉素改良MRS琼脂后得到，本发明首创性的将盐酸林可霉素改良MRS琼脂后的培养基用于鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌的同时计数。

[0027] (2)本发明所述的应用上述培养基对鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌进行同时计数的方法，首先取盐酸林可霉素改良的MRS琼脂培养基并放置凝固得基础层，而后在基础层上加入待测混合样品和盐酸林可霉素改良的MRS琼脂培养基并放置凝固得中间层，随后在中间层上加入盐酸林可霉素改良的MRS琼脂培养基并放置凝固得表层，上述基础层、中间层与表层构成夹层平板，最后将夹层平板进行厌氧培养后，分别对鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌进行计数。一方面，上述方法首创性的采用盐酸林可霉素改良的MRS琼脂培养基实现了对待测混合样品中鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌的同时计数，由于鼠李糖乳杆菌在上述方法培养后的夹层平板中呈菌斑形态且菌斑直径大于2mm，嗜酸乳杆菌在上述方法培养后的夹层平板中呈菌斑形态且菌斑直径小于1mm，双歧杆菌和嗜热链球菌在上述方法培养后的夹层平板中无菌斑形态完全不生长，因此可在一次实验中通过菌斑直径的大小实现混合样品中鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌的同时计数，也即实现了在一次检测实验中对两种乳酸菌菌种的同时计数，由此降低了实验器皿、实验试剂和人力资源成本，提高了工作效率，有利于企业对不同菌种乳酸菌的快速计数；另一方面，采用具有基础层、中间层和表层的夹层平板对待测混合样品进行培养可以有效地避免鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌在普通平板的最底面和最顶面形成异型菌斑，异型菌斑的直径大小不同于正常菌斑，例如嗜酸乳杆菌在普通平板的最底面和最顶面会形成直径大于2mm的菌斑，因此无法分辨为鼠李糖乳杆菌还是嗜酸乳杆菌，对计数结果形成干扰，由此采用夹层平板技术极大地提高了计数的准确性；此外，采用盐酸林可霉素改良的MRS琼脂培养基对待测混合样品进行菌种的计数时，鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌在盐酸林可霉素改良的MRS琼脂培养基上生长的菌群之间相互无干扰，这也进一步提高了菌种计数的准确性。

[0028] (3)本发明所述的应用上述培养基对鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌进行同时计数的方法，将构成基础层、中间层和表层的培养基的体积比控制为(5～10)：(10～15)：(5～10)的范围之内，有利于待测混合样品中菌种的均匀分布，便于计数。附图说明

[0029] 图1为实施例1提供的对夹层平板进行厌氧培养后待测混合样品中不同菌种的生长菌斑图；其中，菌斑直径大于2mm的为鼠李糖乳杆菌；菌斑直径小于1mm的为嗜酸乳杆菌；双歧杆菌和嗜热链球菌无菌斑形态完全不生长。

具体实施方式

[0030] 下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。

[0031] 实施例1

[0032] 本实施例提供的对待测混合样品中鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌进行同时计数的方法，包括如下步骤，

[0033] 培养基的制备：将MRS琼脂融化并在46℃进行水浴保温，然后向100mL温度保持在46℃的MRS琼脂中加入1mL浓度为0.005mg/mL的盐酸克林霉素溶液，即可得到培养基；

[0034] (1)取温度保持在46℃的8mL盐酸林可霉素改良的MRS琼脂培养基倒入无菌平板中并放置凝固得夹层平板的基础层；

[0035] (2)将鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌和嗜热链球菌的标准菌种分别增菌48h，分别取上述四种增菌液各1mL混匀后作为混合样品，并将混合样品进行10倍梯度稀释至10-6梯度浓度，而后取上述稀释至10-6梯度浓度的稀释液1mL，作为待测稀释液；在基础层上加入1mL上述待测稀释液和温度保持在46℃的12mL盐酸林可霉素改良的MRS琼脂培养基混合均匀后，放置凝固得夹层平板的中间层；

[0036] (3)在中间层上加入温度保持在46℃的7mL盐酸林可霉素改良的MRS琼脂培养基并放置凝固得夹层平板的表层；

[0037] (4)将上述夹层平板在36℃厌氧培养48h，然后分别对鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌进行计数；

[0038] 上述待测混合样品是由鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌和嗜热链球菌组成。

[0039] 实施例2

[0040] 本实施例提供的对待测混合样品中鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌进行同时计数的方法，包括如下步骤，

[0041] 混合菌粉样品A由鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌和嗜热链球菌的冻干菌粉混合均匀而成；

[0042] 培养基的制备：将MRS琼脂融化并在45℃进行水浴保温，然后向100mL温度保持在45℃的MRS琼脂中加入1mL浓度为0.01mg/mL的盐酸克林霉素溶液，即可得到培养基；

[0043] (1)取温度保持在45℃的10mL盐酸林可霉素改良的MRS琼脂培养基倒入无菌平板中并放置凝固得夹层平板的基础层；

[0044] (2)将鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌和嗜热链球菌的混合样品A进行10倍梯度稀释至10-6梯度浓度和10-7梯度浓度，每个梯度浓度对应一个基础层，向两个基础层上分别加入1mL上述10-6、10-7梯度稀释液，而后再向两个基础层上分别加入温度保持在45℃的10mL盐酸林可霉素改良的MRS琼脂培养基，每个基础上均需将梯度稀释液和盐酸林可霉素改良的MRS琼脂培养基混合均匀并放置凝固得夹层平板的中间层；

[0045] (3)分别向两个中间层上加入温度保持在45℃的10mL盐酸林可霉素改良的MRS琼脂培养基并放置凝固得夹层平板的表层；

[0046] (4)将上述两个夹层平板在35℃厌氧培养72h，然后分别对鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌进行计数；

[0047] 选取菌落数在30CFU～300CFU之间，无蔓延菌落生长的夹层平板计数菌落总数，菌落总数的计算按照以下方法：

[0048] (1)若10-6梯度稀释液和10-7梯度稀释液中只有一个稀释度夹层平板上的菌落数在30CFU～300CFU之间，则菌落总数的计算按照以下方法：计算两个夹层平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为菌落总数结果；

[0049] (2)若上述10-6、10-7梯度稀释液的夹层平板菌落数均在30CFU～300CFU之间，则菌落总数的计算按照下述公式计算：

[0050] 式中：N＝∑C/(n1+0.1n2)d

[0051] N——样品中菌落数；

[0052] ∑C——平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和；

[0053] n1——第一稀释度(低稀释倍数)平板个数；

[0054] n2——第二稀释度(高稀释倍数)平板个数；

[0055] d——稀释因子(第一稀释度)；

[0056] 实施例3

[0057] 本实施例提供的对待测混合样品中鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌进行同时计数的方法，包括如下步骤，

[0058] 混合菌粉样品B由鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌和嗜热链球菌的冻干菌粉混合均匀而成；

[0059] 培养基的制备：将MRS琼脂融化并在55℃进行水浴保温，然后向100mL温度保持在55℃的MRS琼脂中加入1.2mL浓度为0.006mg/mL的盐酸克林霉素溶液，即可得到培养基；

[0060] (1)取温度保持在55℃的5mL盐酸林可霉素改良的MRS琼脂培养基倒入无菌平板中并放置凝固得夹层平板的基础层；

[0061] (2)将鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌和嗜热链球菌的混合样品B进行10倍梯度稀释至10-7梯度浓度和10-8梯度浓度，每个梯度浓度对应一个基础层，向两个基础层上分别加入1mL上述10-7、10-8梯度稀释液，而后再向两个基础层上分别加入温度保持在55℃的15mL盐酸林可霉素改良的MRS琼脂培养基，每个基础上均需将梯度稀释液和盐酸林可霉素改良的MRS琼脂培养基混合均匀并放置凝固得夹层平板的中间层；

[0062] (3)分别向两个中间层上加入温度保持在55℃的5mL盐酸林可霉素改良的MRS琼脂培养基并放置凝固得夹层平板的表层；

[0063] (4)将上述两个夹层平板在37℃厌氧培养48h，然后分别对鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌进行计数；

[0064] 选取菌落数在30CFU～300CFU之间，无蔓延菌落生长的夹层平板计数菌落总数，菌落总数的计算按照以下方法：

[0065] (1)若10-7梯度稀释液和10-8梯度稀释液中只有一个稀释度夹层平板上的菌落数在30CFU～300CFU之间，则菌落总数的计算按照以下方法：计算两个夹层平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为菌落总数结果；

[0066] (2)若上述10-7、10-8梯度稀释液的夹层平板菌落数均在30CFU～300CFU之间，则菌落总数的计算按照下述公式计算：

[0067] 式中：N＝∑C/(n1+0.1n2)d

[0068] N——样品中菌落数；

[0069] ∑C——平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和；

[0070] n1——第一稀释度(低稀释倍数)平板个数；

[0071] n2——第二稀释度(高稀释倍数)平板个数；

[0072] d——稀释因子(第一稀释度)；

[0073] 实施例4

[0074] 本实施例提供的对待测混合样品中鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌进行同时计数的方法，包括如下步骤，

[0075] 培养基的制备：将MRS琼脂融化并在47℃进行水浴保温，然后向100mL温度保持在47℃的MRS琼脂中加入0.5mL浓度为0.01mg/mL的盐酸克林霉素溶液，即可得到培养基；

[0076] (1)取温度保持在47℃的8mL盐酸林可霉素改良的MRS琼脂培养基倒入无菌平板中并放置凝固得夹层平板的基础层；

[0077] (2)将鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌的标准菌种分别增菌48h，分别取上述两种增菌液各1mL混匀后作为混合样品，并将混合样品进行10倍梯度稀释至10-6梯度浓度，而后取上述稀释至10-6梯度浓度的稀释液1mL，作为待测稀释液；在基础层上加入1mL上述待测稀释液和温度保持在47℃的12mL盐酸林可霉素改良的MRS琼脂培养基混合均匀后，放置凝固制备夹层平板的中间层；

[0078] (3)在中间层上加入温度保持在47℃的7mL盐酸林可霉素改良的MRS琼脂培养基并放置凝固制备夹层平板的表层；

[0079] (4)将上述夹层平板在35℃厌氧培养48h，然后分别对鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌进行计数；

[0080] 上述待测混合样品是由鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌组成。

[0081] 实施例5

[0082] 本实施例提供的对待测混合样品中鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌进行同时计数的方法，包括如下步骤，

[0083] 培养基的制备：将MRS琼脂融化并在50℃进行水浴保温，然后向100mL温度保持在50℃的MRS琼脂中加入0.8mL浓度为0.009mg/mL的盐酸克林霉素溶液，即可得到培养基；

[0084] (1)取温度保持在50℃的8mL盐酸林可霉素改良的MRS琼脂培养基倒入无菌平板中并放置凝固得夹层平板的基础层；

[0085] (2)将鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌和双歧杆菌的标准菌种分别增菌48h，分别取上述三种增菌液各1mL混匀后作为混合样品，并将混合样品进行10倍梯度稀释至10-6梯度浓度，而后取上述稀释至10-6梯度浓度的稀释液1mL，作为待测稀释液；在基础层上加入1mL上述待测稀释液和温度保持在50℃的12mL盐酸林可霉素改良的MRS琼脂培养基混合均匀后，放置凝固得夹层平板的中间层；

[0086] (3)在中间层上加入温度保持在50℃的7mL盐酸林可霉素改良的MRS琼脂培养基并放置凝固得夹层平板的表层；

[0087] (4)将上述夹层平板在36℃厌氧培养72h，然后分别对鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌进行计数；

[0088] 上述待测混合样品是由鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌和双歧杆菌组成。

[0089] 实验例1

[0090] 将鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌和嗜热链球菌的标准菌种分别增菌48h后得到4种增菌液，并将4种增菌液进行10倍梯度稀释至10-6梯度浓度，而后分别取上述四种稀释至10-6梯度浓度的菌液各0.25mL，作为四种待测稀释液，采用《中华人民共和国国家标准GB 4789.35-2016》中的方法对上述四种待测稀释液进行计数，作为第一组计数结果；

[0091] 采用实施例1中的方法制备盐酸林可霉素改良的MRS琼脂培养基，同样采用实施例1中的方法制备夹层平板的基础层；同样采用实施例1中鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌和嗜热链球菌的标准菌种48h增菌液，并将增菌液进行10倍梯度稀释至10-6梯度浓度，而后分别取上述四种稀释至10-6梯度浓度的菌液各0.25mL，作为四种待测稀释液，在基础层上分别加入上述四种待测稀释液和温度保持在46℃的12mL盐酸林可霉素改良的MRS琼脂培养基并放置凝固制备夹层平板的中间层，然后采用与实施例1相同的方法制备夹层平板的表层以及进行厌氧培养，厌氧培养结束后对上述四种待测稀释液进行计数，作为第二组计数结果；

[0092] 采用本发明的计数方法对实施例1提供的混合样品中的鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌进行计数，作为第三组计数结果；

[0093] 上述第一组计数结果、第二组计数结果与第三组计数结果如表1所示。

[0094] 表1每组的计数结果

[0095]

[0096] 表1中将第一组计数结果与第二组计数结果相比可知，(1)鼠李糖乳杆菌采用《中华人民共和国国家标准GB 4789.35-2016》的计数方法与第二组计数方法的计数检测结果偏差r＝0.019，远远小于0.15的偏差要求，由此可知本发明计数方法中采用的盐酸林可霉素改良的MRS琼脂培养基不会影响鼠李糖乳杆菌的生长；

[0097] (2)嗜酸乳杆菌采用《中华人民共和国国家标准GB 4789.35-2016》计数方法与第二组计数方法的计数检测结果偏差r＝0.011，远远小于0.15的偏差要求，由此可知本发明计数方法中采用的盐酸林可霉素改良的MRS琼脂培养基不会影响嗜酸乳杆菌的生长；

[0098] (3)双歧杆菌和嗜热链球菌在本发明计数方法中采用的盐酸林可霉素改良的MRS琼脂培养基上不生长。

[0099] 将第一组计数结果与第三组计数结果相比可知，(1)采用本发明实施例1中的方法检测的混匀液中鼠李糖乳杆菌的计数结果和采用《中华人民共和国国家标准GB4789.35-2016》中的方法对鼠李糖乳杆菌的计数结果的偏差r＝0.014，远远小于0.15的偏差要求，由此表明本发明提供的混合样品中鼠李糖乳杆菌的计数方法准确性较高，且混合样品中鼠李糖乳杆菌的生长不会受到嗜酸乳杆菌、双歧杆菌和嗜热链球菌的影响；

[0100] (2)采用本发明实施例1中的方法检测的混匀液中嗜酸乳杆菌的计数结果和采用《中华人民共和国国家标准GB4789.35-2016》中的方法对嗜酸乳杆菌的计数结果的偏差r＝0.006，远远小于0.15的偏差要求，由此表明本发明提供的混合样品中嗜酸乳杆菌的计数方法准确性较高，且混合样品中嗜酸乳杆菌的生长不会受到鼠李糖乳杆菌、双歧杆菌和嗜热链球菌的影响。

[0101] 实验例2

[0102] 将鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌的混合菌粉样品A进行10倍梯度稀释至10-6梯度浓度和10-7梯度浓度，而后取上述10-6、10-7梯度浓度的稀释液各1mL，作为待测稀释液，采用《中华人民共和国轻工行业标准QB/T4575-2013》中的方法对上述待测稀释液分别进行鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌计数；

[0103] 采用本发明的计数方法对实施例2提供的混合样品中的鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌进行计数；

[0104] 两种方法的计数结果如表2所示。

[0105] 表2两种方法的计数结果

[0106]

[0107] 由表2可知，采用本发明实施例2中的方法检测的混合菌粉样品中鼠李糖乳杆菌的计数结果和采用《中华人民共和国轻工行业标准QB/T4575-2013》中的方法对鼠李糖乳杆菌的计数结果的偏差r＝0.041，远远小于0.15的偏差要求，由此表明本发明提供的混合样品中鼠李糖乳杆菌的计数方法准确性较高；采用本发明实施例2中的方法检测的混合菌粉样品中嗜酸乳杆菌的计数结果和采用《中华人民共和国轻工行业标准QB/T 4575-2013》中的方法对嗜酸乳杆菌的计数结果的偏差r＝0.030，远远小于0.15的偏差要求，由此表明本发明提供的混合样品中嗜酸乳杆菌的计数方法准确性较高。

[0108] 此外，采用本发明方法进行计数时，由于鼠李糖乳杆菌在本发明方法培养后的夹层平板中呈菌斑形态且菌斑直径大于2mm，嗜酸乳杆菌在本发明方法培养后的夹层平板中呈菌斑形态且菌斑直径小于1mm，双歧杆菌和嗜热链球菌在上述方法培养后的夹层平板中无菌斑形态完全不生长，因此可在一次实验中通过菌斑直径的大小实现混合样品中鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌的同时计数，也即实现了在一次检测实验中对两种乳酸菌菌种的同时计数，由此降低了实验器皿、实验试剂和人力资源成本，提高了工作效率，有利于企业实现对混合样品中不同菌种乳酸菌的快速计数；与此同时，采用具有基础层、中间层和表层的夹层平板对待测混合样品进行培养可以有效地避免鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌在夹层平板的最底面和最顶面形成异型菌斑，异型菌斑的直径大小不同于正常菌斑，因此无法分辨为鼠李糖乳杆菌还是嗜酸乳杆菌，由此采用夹层平板极大地提高了计数的准确性；再者，采用盐酸林可霉素改良的MRS琼脂培养基对待测混合样品进行菌种的计数时，鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌在盐酸林可霉素改良的MRS琼脂培养基上生长的菌群之间相互无干扰，这也进一步提高了菌种计数的准确性。

[0109] 实验例3

[0110] 将鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌和嗜热链球菌的混合菌粉样品B进行10倍梯度稀释至10-7梯度浓度和10-8梯度浓度，而后取上述10-7、10-8梯度浓度的稀释液各1mL，作为待测稀释液，采用《中华人民共和国轻工行业标准QB/T 4575-2013》中的方法对上述待测稀释液进行计数；

[0111] 采用本发明的计数方法对实施例3提供的混合样品中的鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌进行计数；

[0112] 两种方法的计数结果如表3所示。

[0113] 表3两种方法的计数结果

[0114]

[0115]

[0116] 由表3可知，采用本发明实施例3中的方法检测的混合菌粉样品中鼠李糖乳杆菌的计数结果和采用《中华人民共和国轻工行业标准QB/T4575-2013》中的方法对鼠李糖乳杆菌的计数结果的偏差r＝0.005，远远小于0.15的偏差要求，由此表明本发明提供的混合样品中鼠李糖乳杆菌的计数方法准确性较高；采用本发明实施例3中的方法检测的混匀液中嗜酸乳杆菌的计数结果和采用《中华人民共和国轻工行业标准QB/T 4575-2013》中的方法对嗜酸乳杆菌的计数结果的偏差r＝0.032，远远小于0.15的偏差要求，由此表明本发明提供的混合样品中嗜酸乳杆菌的计数方法准确性较高。

[0117] 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

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