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一种纳米凝胶的制备方法与应用

阅读：2发布：2020-09-03

专利汇可以提供一种纳米凝胶的制备方法与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种纳米凝胶的制备方法与应用。本发明将聚合物 -赖氨酸-四唑和透明质酸-胱胺-甲基丙烯酸混合液作为微流控的水相，有机溶剂作为微流控的油相；通过微流控技术得到纳米液滴，再进行光照反应得到纳米凝胶；聚合物为透明质酸或其衍生物。本发明通过联用微流控和光控“四唑-烯”点击化学方法制备纳米凝胶，得到的纳米凝胶尺寸较小，可达到100nm以下，且分布均一、粒径可控，在药物控制释放载体等领域具有很好的应用前景。本发明纳米凝胶的制备方式具有很强的选择性，形成的粒子理化性质稳定，与包载的药物不反应，可以很好的保持药物的功效，实现完全、可控的释放，从而可作为蛋白质和核酸药物的优良缓释载体。，下面是一种纳米凝胶的制备方法与应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种纳米凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将聚合物-赖氨酸-四唑和透明质酸-胱胺-甲基丙烯酸混合液作为微流控的水相，有机溶剂作为微流控的油相；通过微流控技术得到纳米液滴，然后进行光照反应得到纳米凝胶；所述的聚合物为透明质酸或其衍生物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的甲基丙烯酸基团与四唑基团的摩尔比为0.8～1.2:1。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的混合液中，聚合物-赖氨酸-四唑的浓度为0.5～50mg/mL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的有机溶剂为丙酮、乙腈或者乙醇。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的微流控总流速为0.06～60mL/min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的光照反应为紫外线光照反应，所述
2
紫外光的波长为302-390nm，强度为0.8～100mW/cm，时间为60～180s。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的透明质酸的衍生物为多肽GALA修饰的透明质酸或锌-二甲基吡啶胺修饰的透明质酸。
8.一种权利要求1～7任一项所述的方法制备得到的纳米凝胶。
9.权利要求8所述的纳米凝胶在药物缓释载体中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的应用包括应用所述的纳米凝胶负载蛋白药物或核酸药物。

说明书全文

一种纳米凝胶的制备方法与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种纳米凝胶的制备方法与应用，属于纳米材料技术领域。

背景技术

[0002] 恶性肿瘤严重威胁着人类的健康。化疗因显著的治疗效果和较快的治疗速度而常被用于临床癌症治疗。但常用的小分子化疗药物在对肿瘤细胞进行杀伤的同时，也会对正常细胞造成杀伤。与具有较高毒副作用的化疗药物相比，蛋白质药物和核酸药物因具有高选择性、优越的功效和低副作用而在肿瘤治疗中展现出巨大的潜力，但它们通常存在体内循环时间短、易酶解、内吞进入肿瘤细胞效率低等缺点。纳米凝胶是指通过物理或化学交联的具有空间网状结构的纳米级别尺寸的水凝胶，其高含水量、高生物相容性及大比表面积的特性特别适合包载蛋白质药物。纳米凝胶可以增加蛋白质在体内的稳定性，增强其循环时间和在肿瘤部位的积累。现如今，纳米凝胶的制备方法主要有：反向纳米沉淀法，原位自组装法，反向微乳液法。然而，通过上述方式制得的纳米凝胶，尺寸难以控制且一般粒径会大于100nm。据文献报道，大尺寸的纳米药物在肿瘤中显示出有限的渗透和积累。相比之下，尺寸小于100nm的纳米载体被认为能更好地穿透肿瘤组织，更多的被肿瘤细胞摄取，从而在体内展现出更加优异的治疗效果。因此需要开发小尺寸可内涵体逃逸的具有靶向性的生物可降解纳米凝胶载体，使其更好地应用于蛋白或核酸药物递送的领域。

发明内容

[0003] 为解决上述技术问题，本发明提供一种纳米凝胶的制备方法，本发明通过联用微流控和光控“四唑-烯”点击化学方法制备纳米凝胶，使用的微流控技术具有可控性强、高效快速、可大通量生产等优点，制备出的纳米凝胶尺寸较小，且分布均一、粒径可控，在药物控制释放载体等领域中具有很好的应用前景。

[0004] 本发明的第一个目的是提供一种纳米凝胶的制备方法，包括如下步骤：将聚合物-赖氨酸-四唑和透明质酸-胱胺-甲基丙烯酸混合液作为微流控的水相，有机溶剂作为微流控的油相；通过微流控技术得到纳米液滴，然后进行光照反应得到纳米凝胶；所述的聚合物为透明质酸或其衍生物。

[0005] 进一步地，所述的甲基丙烯酸基团与四唑基团的摩尔比为0.8～1.2:1。

[0006] 进一步地，所述的聚合物-赖氨酸-四唑的浓度为0.5～50mg/mL。

[0007] 进一步地，所述的有机溶剂为丙酮、乙腈或者乙醇。

[0008] 进一步地，所述的聚合物-赖氨酸-四唑和透明质酸-胱胺-甲基丙烯酸混合液是将聚合物-赖氨酸-四唑和透明质酸-胱胺-甲基丙烯酸溶解在水或缓冲溶液中得到，所述的缓冲溶液为磷酸盐缓冲液、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸半钠盐缓冲溶液、三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液或者2-吗啉乙磺酸缓冲溶液。

[0009] 进一步地，所述的微流控总流速为0.06～60mL/min。微流控芯片的材质为玻璃或PDMS。

[0010] 进一步地，所述的光照反应为紫外线光照反应，所述紫外光的波长为302-390nm，强度为0.8～100mW/cm2，时间为60～180s。

[0011] 进一步地，所述的透明质酸的衍生物为多肽GALA修饰的透明质酸或锌-二甲基吡啶胺修饰的透明质酸。

[0012] 进一步地，所述的多肽GALA的取代度≥0.5。

[0013] 进一步地，所述的锌-二甲基吡啶胺取代度≥2。

[0014] 本发明的第二个目的是提供上述方法制备得到的纳米凝胶。

[0015] 本发明的第三个目的是提供所述的纳米凝胶在药物缓释载体中的应用。

[0016] 进一步地，所述的应用包括应用所述的纳米凝胶负载蛋白药物或核酸药物。

[0017] 本发明的有益效果是：

[0018] 本发明通过联用微流控和光控“四唑-烯”点击化学方法制备纳米凝胶，使用的微流控技术具有可控性强、高效快速、可大通量生产等优点，制备出的纳米凝胶尺寸较小，可达到100nm以下，且分布均一、粒径可控，在药物控制释放载体等领域中具有很好的应用前景。本发明公开的纳米凝胶的制备方式具有很强的选择性，形成的粒子理化性质稳定，与包载的药物，尤其是蛋白质药物和核酸药物不反应，可以很好的保持药物的功效，实现完全、可控的释放，从而可作为蛋白质和核酸药物的优良缓释载体；达到病灶处，纳米凝胶缓释药物，达到切实有效的治疗效果，不会造成现有技术中药物浪费的问题。附图说明

[0019] 图1为实施例1中透明质酸纳米凝胶的尺寸及分布图；

[0020] 图2是实施例2中纳米凝胶的基本性质表征；

[0021] 图3是实施例3中纳米凝胶体外控制释放蛋白质药物的行为，以及释放出的蛋白质药物的生物活性表征图；

[0022] 图4是实施例4中纳米凝胶和载蛋白质药物的纳米凝胶的细胞实验表征图；

[0023] 图5是实施例5中纳米凝胶的体外基因及蛋白沉默表征图；

[0024] 图6是实施例6中纳米凝胶血液循环与生物分布对比图；

[0025] 图7是实施例7中纳米凝胶离题肿瘤穿透行为对比图。

具体实施方式

[0026] 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

[0027] 实施例1：通过微流控制备透明质酸纳米凝胶

[0028] 首先将HA-Lys-Tet或HA-Lys-Tet/GALA和HA-Cys-MA以四唑与双键摩尔比1：1溶解在去离子水中，制得指定浓度的溶液。将溶液装入1mL玻璃进样器中并排尽气泡，注入微流控芯片中的水相管道。同时将丙酮溶液装入10mL玻璃进样器中，排尽气泡后注入芯片的有机相管道。两相流速以1:5的速度比进行，管道出口收集12mL纳米液滴的混合溶液。然后将收集的纳米液滴溶液倒入直径150mm的玻璃皿中，放置在紫外固化箱(320-390nm，50mW/cm2)中光照1分钟，使纳米凝胶充分交联。随后，加入少量去离子水使其更好的分散，旋蒸除去丙酮并透析，制得纳米凝胶溶液。参见附图1，纳米凝胶的粒径用动态光散射粒度仪(DLS)检测。通过此种方法获得的纳米凝胶粒径可控(80-170nm)，尺寸分布均一，同时纳米凝胶的形貌可以用透射电镜观察得到，该法制备的纳米凝胶为球形；通过调控聚合物链长、浓度及微流控通道内总流速，可以得到粒径均一，尺寸可控的纳米凝胶。从图1中可以看到当流速较低时(60μL/min)，纳米凝胶的粒径随聚合物浓度的增大而增大。当流速较高时(600μL/min和6000μL/min)，纳米凝胶的粒径在80nm-110nm内波动。相比于反向纳米沉淀法，通过微流控制得的纳米凝胶在三个浓度下都有较小的粒径。

[0029] 实施例2：锌-二甲基吡啶胺修饰的纳米凝胶的制备及对siRNA的包载

[0030] 锌-二甲基吡啶胺修饰的纳米凝胶(NG/Zn-DPA)的制备方式参照实施例1。将HA-Lys-Tet/Zn-DPA和HA-Cys-MA以四唑与双键摩尔比1：1溶解在去离子水中，制得浓度为3.5mg/mL的溶液，微流控流速设为6000μL/min，其余步骤与实施例1相同。载siRNA纳米凝胶(NG/Zn-DPA-siRNA)的制备与上述方法类似，只需将siRNA溶于DEPC水中，与聚合物在4℃共同孵育12小时后，再注入微流控管道中，其余步骤与上述方法相同。如图2，锌-二甲基吡啶胺修饰的纳米凝胶(NG/Zn-DPA)粒径约为125nm，尺寸分布较窄，透射电镜图显示NG/Zn-DPA粒径均一。NG/Zn-DPA具有较好的胶体稳定性，在1mg/mL的初始浓度下稀释100倍及4度放置一周尺寸与尺寸分布基本不变。然而，在10mM GSH条件下，NG/Zn-DPA明显溶胀变大，表明NG/Zn-DPA具有还原响应性。

[0031] 实施例3：透明质酸纳米凝胶用于蛋白药物的包载及释放

[0032] 载蛋白纳米凝胶的制备与实施例1方法类似，只需将蛋白与聚合物提前混合好，再注入微流控芯片，后续步骤与上述一致。由于透明质酸纳米凝胶带负电，而蛋白药物皂草素(saporin)在中性条件下带正电(等电点为10)，因此纳米凝胶可以通过静电相互作用将saporin高效包载。当理论载药量为5wt.％时，纳米凝胶对蛋白有着70-73％的包载效率。此外，我们还尝试包载了细胞色素C(CC)、牛血清白蛋白(BSA)、曲妥珠单抗(Herceptin)、免疫球蛋白(IgG)4种蛋白药物，结果见表1。表1结果显示，纳米凝胶对这几种蛋白都有比较高的包载效率，其中CC、Herceptin、IgG在中性条件下带正电，纳米凝胶的载药效率为87.9％-97.1％；而载10％中性条件下带负电的BSA时，依然可以包载73.3％。

[0033] 表1

[0034]

[0035] a Determined by DLS at 25℃in water.

[0036] b Determined by Zetasizer Nano-ZS equipped with an electrophoresis cell at 25℃in water.

[0037] 体外释放实验表明纳米凝胶在PB缓冲液中有着较好的胶体稳定性，在24小时内的蛋白释放量不超过15％(图3)。而在含有10mM谷胱甘肽的PB介质中，纳米凝胶迅速胀大、裂解，在6小时后蛋白已经释放近60％。结果显示不同尺寸的纳米凝胶的释放行为相似，但通过调节聚合物取代度可以明显调控其释放行为。高取代度聚合物制备的纳米凝胶(NG-80/High DS)拥有更多的交联基团，因此会比低取代度聚合物制备的纳米凝胶(NG-80)稳定性更好，在24小时内蛋白释放量不超过10％。NG-80/High DS拥有更多的硫硫键，虽然比NG-80在10mM谷光甘肽条件下蛋白的释放速度慢，但依然在6小时释放了近50％的蛋白。通过圆二色谱可以看到纳米凝胶包载并释放蛋白并不会影响saporin的二级结构，保证了蛋白活性。

[0038] 实施例4：空纳米凝胶和包载有蛋白质药物的纳米凝胶的细胞实验

[0039] 以实施例1制备的空纳米凝胶及实施例3中的制备的载蛋白纳米凝胶为例，测试其细胞毒性。我们选用CD44高表达的4T1、MDA-MB-231、SMMC-7721、A549细胞测试载saporin纳米凝胶的细胞毒性。将80μL细胞悬液加入到96孔板中(4T1细胞为1×103个细胞/孔，MDA-MB-231细胞为2.5×103个细胞/孔，SMMC-7721细胞为2×103个细胞/孔，A549细胞为2×103个细胞/孔)，置于37℃，5％二氧化碳培养箱孵育24小时。加入20μL指定浓度的载saporin纳米凝胶，孵育4小时，吸走上层培养液，继续孵育92小时。随后每孔加入10μL MTT溶液(5mg/mL)孵育4小时，移除含有MTT的培养液，再加入150μL DMSO用于溶解紫色甲瓒晶体。15分钟后，用酶标仪(Bio Tek)测定每孔在492nm处的紫外吸收。细胞相对存活率的计算通过样品组与PBS组在492nm的吸收比值得到。每组有4个平行样，最终结果为平均值。空载体毒性测试方法与上述方法类似。

[0040] 从图4A-D中可以看出，在测试的四种细胞中，相比于大尺寸纳米凝胶(NG-150)，小尺寸纳米凝胶(NG-80)在同样浓度下具有更优异的杀伤效果。在四种测试的细胞内，NG-150的半抑制浓度(IC50)均为NG-80的1.5倍左右。其中，NG-80对4T1细胞杀伤效果最好，IC50低至13.1nM。这是由于小尺寸的纳米凝胶会被细胞更多的摄取，导致NG-80拥有更好的抗肿瘤效果。此外，通过引入融合肽GALA，NG/GALA组展现出更强的抗癌作用，并且NG-80/GALA-1.0显示出最小的IC50值，其在测试的癌细胞中约为无GALA修饰NG-80组的一半。NG/GALA的抗癌作用升高主要是由于GALA从无规卷曲到α-螺旋的二级结构变化，这有利于载蛋白质的纳米凝胶从内涵体中逃逸出来进入细胞质。图4E表明空载体浓度在800μg/mL时，细胞存活率依然接近100％，显示出空载体具有良好的生物相容性。

[0041] 实施例5：体外基因沉默与蛋白沉默实验

[0042] 我们用qRT-PCR来研究实施例2中载siRNA纳米凝胶(NG/Zn-DPA-siPLK1)对MDA-MB-231细胞PLK1基因的沉默能力。将800μLMDA-MB-231细胞按照3×105个/孔置于6孔板孵育24小时，随后加入200μLNG/Zn-DPA-siRNA共孵育48小时，收集转染过后的MDA-MB-231细胞，使用细胞裂解液裂解。之后提取RNA，步骤参照PCR 试剂盒(GenePharma,中国)操作手册，通过qRT-PCR(Bio-Rad，美国)进行定量测定。定量结果表示为PLK1表达相对于PBS组细胞的倍数变化，并用对照基因甘油醛磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内源参考进行标准化处理。用2-ΔΔCT法计算NG/Zn-DPA-siPLK1对PLK1沉默水平，每组3个平行样，最终结果采用平均值。

[0043] Western blot步骤：将MDA-MB-231细胞铺到6孔板中(4.5×105个细胞/孔)，培养24小时后加入样品继续孵育48小时。处理细胞时先用冰PBS洗一遍，消化离心，加入80微升含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲溶液4℃下裂解20分钟，转移至1.5mL EP管，4℃，
12000rpm离心15分钟。取上清液，用BCA试剂盒检测溶液蛋白浓度，加入相应体积的溴芬蓝溶液，95℃煮5分钟，置于冰箱过夜。然后将相同蛋白量的样品加入到SDS-PAGE胶中，跑电泳分离，之后转到PVDF膜上。室温下用5％脱脂奶粉封闭3小时，再用相应的一抗4℃孵育过夜，GAPDH作为内源性对照。用含吐温20的TBS溶于洗涤3次后，再用二抗在25℃摇床下孵育1小时。TBS再次洗涤三次后在生物化学镀膜系统上用超敏化学发光电泳凝胶成像仪对荧光信号进行检测。

[0044] 从图5中可以看到，在与细胞共孵育48小时后，包载100nM siPLK1的NG/Zn-DPA组PLK1 mRNA量与NG/Zn-DPA-siScramble组相比显著降低，且当包载量达到200nM时，NG/Zn-DPA组PLK1 mRNA表达量只有PBS组的27％。以上结果充分证明了纳米凝胶的靶向性及序列特异性基因沉默能力。蛋白印记实验进一步表明NG/Zn-DPA-siPLK1可特异性下调PLK1蛋白的表达，且当NG/Zn-DPA包载200nM siPLK1时比载100nM沉默效果更好。

[0045] 实施例6：载蛋白纳米凝胶在体内循环时间及生物分布

[0046] 我们选用BALB/c小鼠研究实施例3制备的包载saporin的纳米凝胶及自由saporin125
在体内循环时间及生物分布上的差异。我们用 I标记被纳米凝胶包载的saporin(saporin(125I))。通过尾静脉将四组样品(n＝3)注射到小鼠体内，在0.05、0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、
24小时分别通过眼眶取30μL血液。每次采血前将采血管及4mL EP管称重，去皮，采血后再次称重为血液重量。

[0047] 我们选用裸鼠来研究纳米凝胶包载的saporin(125I)及游离的saporin(125I)在肿瘤及各主要脏器的分布情况。荷4T1肿瘤裸鼠模型经皮下注射4T1细胞(5×105个细胞/只)来建立。当肿瘤体积达到150～200mm3时，分别尾静脉注射各组样品，每组3只。6小时后断颈处死，取出肿瘤及心、肝、脾、肺、肾，通过伽马计数器测量其放射性元素的量，除以该组总放射性量，再除以器官或肿瘤重量，即为％ID/g。此外，我们还选用荷4T1肿瘤的裸鼠通过荧光成像研究纳米凝胶在肿瘤的富集情况。待肿瘤体积达到150～200mm3时，将Cy5标记的纳米凝胶经尾静脉注射到小鼠体内，并在2、6、12、24小时用近红外成像系统(IVIS Lumina II，Caliper，MA)对小鼠进行成像。

[0048] 图6A显示，注射后纳米凝胶中125I标记的saporin含量快速下降(t1/2α＝0.12小时)，这是由于它会从血液循环到肝脏，脾脏和其他组织，但其分布半衰期是仍显著长于游125 125
离saporin( I)(t1/2α＝0.007小时)。对比包载saporin( I)的NG-80(t1/2β＝3.80小时)与NG-150(t1/2β＝4.65小时)发现，被大尺寸的纳米凝胶包载的蛋白质具有更长的循环时间。
此外，NG-80和NG-80/GALA中的saporin(125I)具有相似的消除半衰期(t1/2β＝～3.80h)，这表明GALA修饰的纳米凝胶对其药代动力学几乎没有影响。然而，游离saporin(125I)在体内循环过程中会很快的被清除，t1/2β仅为0.69小时。相比之下，被纳米凝胶包载后的saporin在体内循环时间显著延长。

[0049] 从图6B可以看到，NG-80中的saporin(125I)(8.5％ID/g)在肿瘤中的积累(*p<0.05)显著高于NG-150中的saporin(125I)(5.9％ID/g)。显然，较小的颗粒可以增加在肿瘤部位的积聚，因为它可以通过EPR效应更容易穿透血管及肿瘤组织。GALA对肿瘤部位富集的影响量基本没有影响。然而，由于其在血浆中不稳定和难以被细胞摄取的特性，游离saporin(125I)组仅在肿瘤部位显示少量蛋白质积累(1.94％ID/g)。此外，四组被纳米凝胶包载的saporin(125I)在心、肝、脾、肺、肾中的积累没有统计学差异。体内成像与生物分布结果相同。图6C显示，在注射6小时在后，相比于NG-150组，NG-80组可以在肿瘤处观察到更强的荧光。这表明粒径对于纳米凝胶在肿瘤内渗透和富集都具有显著影响。以上结果表明，相比NG-150组，NG-80组在肿瘤部位的有更多的富集，可以向肿瘤组织递送更大量的蛋白质并且拥有更高的效率。

[0050] 实施例7：离体肿瘤穿透实验

[0051] 用实施例1制备的相同浓度的NG-80和NG-150处理的MDA-MB-231肿瘤用于离体肿瘤穿透的研究。我们首先通过细胞接种(1×106个细胞)建立MDA-MB-231肿瘤模型。当肿瘤体积到达150～200mm3时，断颈处死小鼠并剥出肿瘤。将肿瘤放到含DMEM培养基及纳米凝胶(1mg/mL)的24孔板中置于37℃，5％二氧化碳培养箱孵育48小时，然后用4％多聚甲醛固定，做冷冻切片(厚度为20μm)，最后通过激光共聚焦显微镜拍摄明场及荧光图片。

[0052] 如图7所示，纳米凝胶在肿瘤组织中穿透的深度与其尺寸相关。在与纳米凝胶孵育48小时后，NG-150组穿透深度主要富集在150-220μm左右，但大于250μm后荧光强度明显变弱，趋近于零。而NG-80组的不仅在150-220μm处有富集，并且一直到接近450μm时依然有非常强的荧光。NG-80组的穿透深度大约是NG-150组的2倍，表明小尺寸组可以更好的穿透肿瘤组织，接触并杀死更多的肿瘤细胞。

[0053] 以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

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