技术领域
[0001] 本
发明属于分子
生物学领域，涉及一种采用分子生物学手段检测转基因
植物，具体为一种用于检测抗草甘膦转基因大豆的分子标记及其应用。
背景技术
[0002] 抗草甘膦转基因大豆是通过基因工程技术将抗
除草剂外源基因导入到大豆基因组中的新型转基因品种，因获得对除草剂草甘膦的抗性，目前已经成为全球种植面积最为广泛的转基因作物，其加工产品转基因
豆粕主要应用于
饲料工业。
[0003] 我国还未商业化种植转基因大豆，抗草甘膦转基因大豆作为动物饲料在动物生产上应用价值的研究也非常有限。与此同时，转基因产品的农艺学特性、营养学特性是否发生了改变，进行导入外源基因的转基因操作过程是否影响受体遗传学特性，转基因产品在动物
机体组织器官中无残留、以及对动物和人类健康是否造成潜在危害等一系列安全问题备受世人关注。虽然对转基因大豆的营养学等价性和急性毒性展开了一系列研究，但是仍需要亚长期和长期的安全性评价试验数据。此外，随着各国对生物技术产品管理措施的加强以及欧盟、中国等诸多国家有关转基因标识条例的颁布，建立饲料等各种产品中转基因成分的检测方法尤为迫切。建立转基因大豆饲料原料的进口与生产，建立贸易壁垒，确保转基因标识制度的实施，并为指导今后转基因饲料在动物生产中的应用和完善安全性评价体系都具有重要的理论和现实意义。
[0004] 随着转基因产品的不断涌现，许多国家纷纷对转基因产品进行标识管理。欧盟(EC)49/2000号条例规定食品中含有超过1％的转基因成分时必须标签，这就要求有相适应的检测方法能够定性和定量检测转基因产品。基于核酸的多聚酶链式反应检测、基于
蛋白质的免疫学和酶学检测是已被普遍接纳和广泛应用的两大主要技术。最近，质谱技术、色谱技术、
近红外光谱技术、生物
传感器、生物芯片技术有望发展为检测转基因成分的新途径。
发明内容
[0005] 本发明的目的是：为了克服
现有技术中的
缺陷，获得一种快速、准确检测抗草甘膦转基因大豆的方法，本发明提供了一种用于检测抗草甘膦转基因大豆的分子标记及其应用。
[0006] 技术方案：一种用于检测抗草甘膦转基因大豆的分子标记，所述分子标记及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
[0007] 优选的，所述分子标记P1、P2和P3的上游引物5，端进行
氨基化修饰。
[0008] 表1分子标记序列
[0009]名称 序列(5，-3，) SEQ ID NO.
P1-F NH2-GGAGCAACCACACATGATCCTC 1
P1-R GGATCTGATAGACCTGACGTTA 2
P2-F NH2-GCTCCTACAAATGCCATCA 3
P2-R GATAGTGGGATTGTGCGTCA 4
P3-F NH2-GGATCCTGTTGCCGGTCTTG 5
P3-R GGCTCCTAGTTTGCAACGCTA 6
[0010] 所述的分子标记在制备检测抗草甘膦转基因大豆
试剂盒中的应用。
[0011] 优选的，所述试剂盒的组分包括：分子标记、dNTP、LATaq、PCR反应缓冲液、MgCl2、双蒸
水。
[0012] 优选的，所述试剂盒检测抗草甘膦转基因大豆的步骤包括：
[0013] (1)取样：提取大豆样品的基因组DNA；
[0014] (2)以步骤(1)提取的DNA作为PCR模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
[0015] (3)取步骤(2)的扩增产物，稀释100～500倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
[0016] (4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释20～100倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
[0017] (5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶
电泳检测。
[0018] 优选的，所述
甘蔗叶片样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
[0019] 优选的，所述PCR扩增的体系为25μL：模板2μL、PCR反应缓冲液2.5μL、dNTP 2μL、LATaq 2μL、分子标记1μL、双蒸水15.5μL。
[0020] 优选的，所述第一轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
[0021] 优选的，所述第二轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。
[0022] 优选的，所述第三轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。
[0023] 有益效果：(1)本发明所述分子标记适用于定性检测抗草甘膦转基因大豆中转基因成分；(2)本发明所述分子标记具有快速、准确、
稳定性好的优点。
附图说明
[0025] 其中，M为分子量为2000bp的Maker；1为实施例1PCR产物电泳结果；2为实施例2PCR产物电泳结果；3为实施例3PCR产物电泳结果。
具体实施方式
[0026] 实施例1
[0027] 一种用于检测抗草甘膦转基因大豆的分子标记，所述分子标记及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
[0028] 所述分子标记P1、P2和P3的上游引物5，端进行氨基化修饰。
[0029] 所述的分子标记在制备检测抗草甘膦转基因大豆试剂盒中的应用。
[0030] 所述试剂盒的组分包括：分子标记、dNTP、LATaq、PCR反应缓冲液、MgCl2、双蒸水。
[0031] 所述试剂盒检测抗草甘膦转基因大豆的步骤包括：
[0032] (1)取样：提取大豆样品的基因组DNA；
[0033] (2)以步骤(1)提取的DNA作为PCR模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
[0034] (3)取步骤(2)的扩增产物，稀释100倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
[0035] (4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释100倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
[0036] (5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
[0037] 所述甘蔗叶片样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
[0038] 所述PCR扩增的体系为25μL：模板2μL、PCR反应缓冲液2.5μL、dNTP 2μL、LATaq 2μL、分子标记1μL、双蒸水15.5μL。
[0039] 所述第一轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
[0040] 所述第二轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。
[0041] 所述第三轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。
[0042] 实施例2
[0043] 一种用于检测抗草甘膦转基因大豆的分子标记，所述分子标记及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
[0044] 所述分子标记P1、P2和P3的上游引物5，端进行氨基化修饰。
[0045] 所述的分子标记在制备检测抗草甘膦转基因大豆试剂盒中的应用。
[0046] 所述试剂盒的组分包括：分子标记、dNTP、LATaq、PCR反应缓冲液、MgCl2、双蒸水。
[0047] 所述试剂盒检测抗草甘膦转基因大豆的步骤包括：
[0048] (1)取样：提取大豆样品的基因组DNA；
[0049] (2)以步骤(1)提取的DNA作为PCR模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
[0050] (3)取步骤(2)的扩增产物，稀释300倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
[0051] (4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释50倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
[0052] (5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
[0053] 所述甘蔗叶片样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
[0054] 所述PCR扩增的体系为25μL：模板2μL、PCR反应缓冲液2.5μL、dNTP 2μL、LATaq 2μL、分子标记1μL、双蒸水15.5μL。
[0055] 所述第一轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
[0056] 所述第二轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。
[0057] 所述第三轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。
[0058] 实施例3
[0059] 一种用于检测抗草甘膦转基因大豆的分子标记，所述分子标记及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
[0060] 所述分子标记P1、P2和P3的上游引物5，端进行氨基化修饰。
[0061] 所述的分子标记在制备检测抗草甘膦转基因大豆试剂盒中的应用。
[0062] 所述试剂盒的组分包括：分子标记、dNTP、LATaq、PCR反应缓冲液、MgCl2、双蒸水。
[0063] 所述试剂盒检测抗草甘膦转基因大豆的步骤包括：
[0064] (1)取样：提取大豆样品的基因组DNA；
[0065] (2)以步骤(1)提取的DNA作为PCR模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
[0066] (3)取步骤(2)的扩增产物，稀释500倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
[0067] (4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释20倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
[0068] (5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
[0069] 所述甘蔗叶片样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
[0070] 所述PCR扩增的体系为25μL：模板2μL、PCR反应缓冲液2.5μL、dNTP 2μL、LATaq 2μL、分子标记1μL、双蒸水15.5μL。
[0071] 所述第一轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
[0072] 所述第二轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。
[0073] 所述第三轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。
