技术领域
[0001] 本
发明属于分子
生物学领域，涉及一种采用分子生物学手段检测致病菌的方法，具体为一种用于检测草莓黄萎病菌的分子标记及其应用。
背景技术
[0002] 草莓，蔷薇科、草莓属多年生草木，一种红色的花果，外观呈心形，鲜美红嫩，果肉多汁，含有特殊的浓郁
水果芳香，中国各地栽培。草莓富含
氨基酸、果糖、
蔗糖、
葡萄糖、
柠檬酸、苹果酸、果胶、胡萝卜素、维生素B1、B2、烟酸及矿物质
钙、镁、磷、
钾、
铁等，这些营养素对生长发育有很好的促进作用，对老人、儿童大有裨益。每百克草莓含维生素C50～100毫克，比苹果、葡萄高10倍以上。并且维生素C能消除细胞间的松弛与紧张状态，使脑细胞结构坚固，
皮肤细腻有弹性，对脑和智
力发育有重要影响。
[0003] 草莓黄萎病是草莓的主要病害之一，初侵染外围
叶片、叶柄产生黑褐色长条形病斑，叶片失去生气和光泽，从叶缘和叶脉间变成黄褐色萎焉，干燥时枯死。新嫩叶片感病表现无生气，变灰绿或淡褐色下垂，继而从下部叶片开始变成黄枯状萎焉直至整株枯死。被害株叶柄、果梗和根茎横切面可见维
管束的部分或全部变褐，根在发病初期无异常。目前常用防治方法是喷施多菌灵、代森锰锌或苯菌灵液，长期使用后易产生耐药性，需要加大剂量和配合其他药剂使用才能达到防治效果，增大了投入成本，并且在喷施后需要过一段时间才能进行草莓的采摘，否则食用后人体易出现不良反应。因此，根本的解决方案是能够在发病初期或
土壤中进行早期快速检测的技术，以便及时采用针对性的有效防治措施来控制病害的发生和传播。
[0004] 传统的病害诊断方法，大多根据植株的明显症状和病原菌形态特征。近年来，有研究通过观察病原菌分生孢子和附着胞的大小及形状、确定宿主范围和致病性，以及采用斑点杂交法和血清学等方法进行这3种草莓病原菌的检测，但由于这些检测方法操作难度大、实用性不足、灵敏度低且耗时耗了等缺点逐步被分子检测技术所取代。目前已有许多关于草莓病原菌分子检测技术的报道。但是均是采用一对引物对致病菌进行检测，导致检测结果不稳定，结果重复性不好。
发明内容
[0005] 本发明的目的是：为了克服
现有技术的
缺陷，获得一种能够特异性检测草莓黄萎病菌的方法，且在具有检测灵敏度的同时保证检测结果的
稳定性，本发明提供了一种用于检测草莓黄萎病菌的分子标记及其应用。
[0006] 技术方案：一种用于检测草莓黄萎病菌的分子标记，所述分子标记及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
[0007] 优选的，所述分子标记P1、P2和P3的上游引物5，端进行氨基化修饰。
[0008] 表1分子标记序列
[0009]名称 序列(5，-3，) SEQ ID NO.
P1-F NH2-GGCCTCCAAACTCCGGGCGG 1
P1-R TCCTCCACTTAGATATGC 2
P2-F NH2-GGTTACACTAGTAGCCATA 3
P2-R CCATACGACACTGACGTCA 4
P3-F NH2-GGAGAAGAGAACTTCAGAA 5
P3-R GGTACCAACCTGCCATCCTGAA 6
[0010] 所述的分子标记在制备检测草莓黄梅病菌的
试剂盒中的应用。
[0011] 优选的，所述试剂盒的组分包括：分子标记、dNTP、LATaq、PCR反应缓冲液、MgCl2、双蒸水。
[0012] 优选的，所述试剂盒检测草莓黄萎病菌的步骤包括：
[0013] (1)取样：提取草莓叶片样品的基因组DNA；
[0014] (2)以步骤(1)提取的DNA作为PCR模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
[0015] (3)取步骤(2)的扩增产物，稀释100～500倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
[0016] (4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释10～50倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
[0017] (5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶
电泳检测。
[0018] 优选的，所述
甘蔗叶片样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
[0019] 优选的，所述PCR扩增的体系为25μL：模板2μL、PCR反应缓冲液2.5μL、dNTP 2μL、LATaq 2μL、分子标记1μL、双蒸水15.5μL。
[0020] 优选的，所述第一轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
[0021] 优选的，所述第二轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。
[0022] 优选的，所述第三轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。
[0023] 有益效果：(1)本发明所述分子标记具有特异性好、灵敏度高的优点；(2)本发明所述分子标记检测结果的稳定性好。
附图说明
[0025] 其中，M为分子量为2000bp的Maker；1为实施例1PCR产物电泳结果；2为实施例2PCR产物电泳结果；3为实施例3PCR产物电泳结果。
具体实施方式
[0026] 实施例1
[0027] 一种用于检测草莓黄萎病菌的分子标记，所述分子标记及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
[0028] 所述分子标记P1、P2和P3的上游引物5，端进行氨基化修饰。
[0029] 所述的分子标记在制备检测草莓黄梅病菌的试剂盒中的应用。
[0030] 所述试剂盒的组分包括：分子标记、dNTP、LATaq、PCR反应缓冲液、MgCl2、双蒸水。
[0031] 所述试剂盒检测草莓黄萎病菌的步骤包括：
[0032] (1)取样：提取草莓叶片样品的基因组DNA；
[0033] (2)以步骤(1)提取的DNA作为PCR模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
[0034] (3)取步骤(2)的扩增产物，稀释100倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
[0035] (4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释50倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
[0036] (5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
[0037] 所述甘蔗叶片样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
[0038] 所述PCR扩增的体系为25μL：模板2μL、PCR反应缓冲液2.5μL、dNTP 2μL、LATaq 2μL、分子标记1μL、双蒸水15.5μL。
[0039] 所述第一轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
[0040] 所述第二轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。
[0041] 所述第三轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。
[0042] 实施例2
[0043] 一种用于检测草莓黄萎病菌的分子标记，所述分子标记及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
[0044] 所述分子标记P1、P2和P3的上游引物5，端进行氨基化修饰。
[0045] 所述的分子标记在制备检测草莓黄梅病菌的试剂盒中的应用。
[0046] 所述试剂盒的组分包括：分子标记、dNTP、LATaq、PCR反应缓冲液、MgCl2、双蒸水。
[0047] 所述试剂盒检测草莓黄萎病菌的步骤包括：
[0048] (1)取样：提取草莓叶片样品的基因组DNA；
[0049] (2)以步骤(1)提取的DNA作为PCR模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
[0050] (3)取步骤(2)的扩增产物，稀释300倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
[0051] (4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释30倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
[0052] (5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
[0053] 所述甘蔗叶片样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
[0054] 所述PCR扩增的体系为25μL：模板2μL、PCR反应缓冲液2.5μL、dNTP 2μL、LATaq 2μL、分子标记1μL、双蒸水15.5μL。
[0055] 所述第一轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
[0056] 所述第二轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。
[0057] 所述第三轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。
[0058] 实施例3
[0059] 一种用于检测草莓黄萎病菌的分子标记，所述分子标记及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
[0060] 所述分子标记P1、P2和P3的上游引物5，端进行氨基化修饰。
[0061] 所述的分子标记在制备检测草莓黄梅病菌的试剂盒中的应用。
[0062] 所述试剂盒的组分包括：分子标记、dNTP、LATaq、PCR反应缓冲液、MgCl2、双蒸水。
[0063] 所述试剂盒检测草莓黄萎病菌的步骤包括：
[0064] (1)取样：提取草莓叶片样品的基因组DNA；
[0065] (2)以步骤(1)提取的DNA作为PCR模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
[0066] (3)取步骤(2)的扩增产物，稀释500倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
[0067] (4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释10倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
[0068] (5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
[0069] 所述甘蔗叶片样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
[0070] 所述PCR扩增的体系为25μL：模板2μL、PCR反应缓冲液2.5μL、dNTP 2μL、LATaq 2μL、分子标记1μL、双蒸水15.5μL。
[0071] 所述第一轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
[0072] 所述第二轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。
[0073] 所述第三轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。
