技术领域
[0001] 本
发明属于分子
生物学领域，涉及一种采用分子生物学手段检测致病菌的方法，具体为一种用于检测黄瓜棒褒叶斑病菌的分子标记及其应用。
背景技术
[0002] 多主棒孢是引起黄瓜棒孢叶斑病的病原菌。多主棒孢寄主范围广泛，传播方式多样。近几年经调查发现，由多主棒孢引起的黄瓜、番茄等蔬菜的叶斑病在中国山东、河北、辽宁、内蒙古等11个省市区大面积发生，造成了严重的经济损失。20世纪末，黄瓜棒孢叶斑病在辽宁省瓦房店市爆发，严重危害黄瓜的生产。目前，该病已成为保护地黄瓜的重要叶部病害之一。
[0003] 黄瓜棒孢叶斑病病斑初期为小黄斑，逐渐扩大至近圆形，浅棕色，边缘较薄呈棕色，条件适宜时病斑迅速扩展，边缘呈现
水浸状，严重时多个病斑连成片，并可蔓延至叶柄、茎蔓，造成果实流胶，干燥时造成穿孔。黄瓜棒孢叶斑病发生初期症状极易与黄瓜细菌性
角斑病和霜霉病混淆，后期不易与
炭疽病区分，现阶段缺乏对黄瓜棒孢叶斑病菌的快速检测技术，给田间及时防控造成困难。
[0004] 多主棒孢检测方法包括PCR检测、免疫检测以及彩色图像检测等，并已成功应用于其遗传多样性等方面的研究。现有的免疫检测方法一般以多主棒孢寄主选择性毒素蛋白为
抗原制备单克隆
抗体，操作较为复杂，实验成本较高。基于计算机彩色图像的检测方法由于拍摄状态和光照等环境因素、发病程度及病斑的典型性不同，均可能对检测准确率产生影响。多主棒孢的PCR检测方法报道较少，现有方法所选用的对照菌株仅3～4株，引物特异性需进一步验证，检测技术尚不完善。同时，已有的黄瓜棒孢叶斑病菌PCR检测方法未能直接将黄瓜棒孢叶斑病菌与黄瓜霜霉病菌、炭疽病菌、细菌性角斑病菌加以区分。因此建立准确、快速、灵敏、实用的黄瓜棒孢叶斑病菌检测方法非常必要。
发明内容
[0005] 本发明的目的是：为了克服
现有技术的
缺陷，建立准确、快速、灵敏、实用的黄瓜棒孢叶斑病菌检测方法，本发明提供了一种用于检测黄瓜棒褒叶斑病菌的分子标记及其应用。
[0006] 技术方案：一种用于检测黄瓜棒褒叶斑病菌的分子标记，所述分子标记及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
[0007] 优选的，所述分子标记P1、P2和P3的上游引物5，端进行
氨基化修饰。
[0008] 表1分子标记序列
[0009]名称 序列(5，-3，) SEQ ID NO.
P1-F NH2-GCGTGCAAGGCCGGTTTCGC 1
P1-R GGCGAGTCCTTCTGGCCCAT 2
P2-F NH2-CGAAGGTGAACATCATAGA 3
P2-R GAGATTTCCAAAAGGGCAT 4
P3-F NH2-CGTGCAAGCAGATTACGGT 5
P3-R GCAGCCCTCATGGATTT 6
[0010] 所述的分子标记在制备检测黄瓜棒褒叶斑病菌
试剂盒中的应用。
[0011] 优选的，所述试剂盒的组分包括：分子标记、dNTP、LATaq、PCR反应缓冲液、MgCl2、双蒸水。
[0012] 优选的，所述试剂盒检测黄瓜棒褒叶斑病菌的步骤包括：
[0013] (1)取样：提取黄瓜
叶片样品的基因组DNA；
[0014] (2)以步骤(1)提取的DNA作为PCR模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
[0015] (3)取步骤(2)的扩增产物，稀释200～500倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
[0016] (4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释20～100倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
[0017] (5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶
电泳检测。
[0018] 优选的，所述
甘蔗叶片样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
[0019] 优选的，所述PCR扩增的体系为25μL：模板2μL、PCR反应缓冲液2.5μL、dNTP2μL、LATaq2μL、分子标记1μL、双蒸水15.5μL。
[0020] 优选的，所述第一轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
[0021] 优选的，所述第二轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。
[0022] 优选的，所述第三轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。
[0023] 有益效果：(1)本发明所述分子标记能够准确、快速、灵敏、实用的检测黄瓜棒孢叶斑病菌；(2)本发明所述分子标记对病原菌的检测具有灵敏度高的优点，可同时应用于发病植株中黄瓜棒孢叶斑病菌的快速检测。
附图说明
[0025] 其中，M为分子量为1200bp的Maker；1为实施例1PCR产物电泳结果；2为实施例2PCR产物电泳结果；3为实施例3PCR产物电泳结果。
具体实施方式
[0026] 实施例1
[0027] 一种用于检测黄瓜棒褒叶斑病菌的分子标记，所述分子标记及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
[0028] 所述分子标记P1、P2和P3的上游引物5，端进行氨基化修饰。
[0029] 所述的分子标记在制备检测黄瓜棒褒叶斑病菌试剂盒中的应用。
[0030] 所述试剂盒的组分包括：分子标记、dNTP、LATaq、PCR反应缓冲液、MgCl2、双蒸水。
[0031] 所述试剂盒检测黄瓜棒褒叶斑病菌的步骤包括：
[0032] (1)取样：提取黄瓜叶片样品的基因组DNA；
[0033] (2)以步骤(1)提取的DNA作为PCR模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
[0034] (3)取步骤(2)的扩增产物，稀释200倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
[0035] (4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释100倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
[0036] (5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
[0037] 所述甘蔗叶片样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
[0038] 所述PCR扩增的体系为25μL：模板2μL、PCR反应缓冲液2.5μL、dNTP2μL、LATaq2μL、分子标记1μL、双蒸水15.5μL。
[0039] 所述第一轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
[0040] 所述第二轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。
[0041] 所述第三轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。
[0042] 实施例2
[0043] 一种用于检测黄瓜棒褒叶斑病菌的分子标记，所述分子标记及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
[0044] 所述分子标记P1、P2和P3的上游引物5，端进行氨基化修饰。
[0045] 所述的分子标记在制备检测黄瓜棒褒叶斑病菌试剂盒中的应用。
[0046] 所述试剂盒的组分包括：分子标记、dNTP、LATaq、PCR反应缓冲液、MgCl2、双蒸水。
[0047] 所述试剂盒检测黄瓜棒褒叶斑病菌的步骤包括：
[0048] (1)取样：提取黄瓜叶片样品的基因组DNA；
[0049] (2)以步骤(1)提取的DNA作为PCR模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
[0050] (3)取步骤(2)的扩增产物，稀释400倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
[0051] (4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释80倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
[0052] (5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
[0053] 所述甘蔗叶片样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
[0054] 所述PCR扩增的体系为25μL：模板2μL、PCR反应缓冲液2.5μL、dNTP2μL、LATaq2μL、分子标记1μL、双蒸水15.5μL。
[0055] 所述第一轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
[0056] 所述第二轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。
[0057] 所述第三轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。
[0058] 实施例3
[0059] 一种用于检测黄瓜棒褒叶斑病菌的分子标记，所述分子标记及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
[0060] 所述分子标记P1、P2和P3的上游引物5，端进行氨基化修饰。
[0061] 所述的分子标记在制备检测黄瓜棒褒叶斑病菌试剂盒中的应用。
[0062] 所述试剂盒的组分包括：分子标记、dNTP、LATaq、PCR反应缓冲液、MgCl2、双蒸水。
[0063] 所述试剂盒检测黄瓜棒褒叶斑病菌的步骤包括：
[0064] (1)取样：提取黄瓜叶片样品的基因组DNA；
[0065] (2)以步骤(1)提取的DNA作为PCR模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
[0066] (3)取步骤(2)的扩增产物，稀释500倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
[0067] (4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释20倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
[0068] (5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
[0069] 所述甘蔗叶片样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
[0070] 所述PCR扩增的体系为25μL：模板2μL、PCR反应缓冲液2.5μL、dNTP2μL、LATaq2μL、分子标记1μL、双蒸水15.5μL。
[0071] 所述第一轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
[0072] 所述第二轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。
[0073] 所述第三轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。
