技术领域
[0001] 本
发明属于分子
生物学领域，涉及一种采用分子生物学手段鉴定中药的方法，具体为一种用于鉴定中药材合欢花的引物对及其应用。
背景技术
[0002] 合欢皮和合欢花为常用的解郁安神药，其基原
植物均为豆科合欢属，植物合欢分别以皮和花入药，树皮入药为“合欢皮”，花序或花蕾入药为“合欢花”或“合欢米”。现代药理学研究表明合欢皮有
镇静安神、抗生育、抗
肿瘤等活性。合欢花有镇静
催眠、抗抑郁、抗菌、抗
氧化等作用。合欢药材市场需求量大，在商品药材中发现合欢皮、合欢花均存在一定的混伪现有。合欢皮主要的混伪品是山合欢皮，从各地药材市场及部分省市药店中收集的样品中存在以山合欢皮代替合欢皮的现象。二者亲缘关系较近，药材性状极为相似，但2010版《中国药典》只把合欢皮作为正品收载，山合欢皮属于混伪品，古代本草中也没有山合欢代替合欢用药的记载。同时，秦皮、海桐皮与合欢皮药材性状相似，也容易混淆。合欢花的主要混伪品为山合欢花做合欢花出售的现象，在广东等地区以广东合欢花做合欢花药用，北合欢花、广东合欢花与合欢花药材性状差异大，因药材名混乱，而造成误用，需加以纠正。
[0003] 因此，为规范合欢药材的使用，保证临床用药安全准确，迫切需要准确有效的鉴定方法。目前，合欢药材的鉴定大多采用性状、显微、理化等传统鉴定方法。
发明内容
[0004] 本发明的目的是：为了克服
现有技术的
缺陷，保证合欢药材用药的安全有效，获得一种
稳定性好，特异性高的分子鉴定
试剂盒，本发明提供了一种用于鉴定中药材合欢花的引物对及其应用。
[0005] 技术方案：一种用于鉴定中药材合欢花的引物对，所述引物对及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
[0006] 优选的，所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5’端加上特异性的GC发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为SEQ ID NO.7。
[0007] 表1引物对及发卡结构序列
[0008]
[0009]
[0010] 所述引物对在制备鉴定中药材合欢花试剂盒中的应用。
[0011] 优选的，所述试剂盒的组分包括：引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
[0012] 优选的，所述试剂盒鉴定中药材合欢花的步骤包括：
[0013] (1)提取合欢花样品的基因组DNA；
[0014] (2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
[0015] (3)取步骤(2)的扩增产物，稀释50～500倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
[0016] (4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释10～100倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
[0017] (5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶
电泳检测。
[0018] 优选的，所述合欢花样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
[0019] 优选的，所述PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
[0020] 有益效果：(1)本发明所述引物对克服了传统合欢药材采用性状、显微、理化等鉴定方法的弊端，提供了一种准确、操作简便的鉴定方法；(2)本发明所述引物对具有特异性高、灵敏度好，稳定性强的优点。
附图说明
[0021] 图1是
实施例1～3PCR鉴定结果电泳图；
[0022] 其中M为分子量为2000的Maker；1为实施例1PCR产物鉴定结果；2为实施例2PCR产物鉴定结果；3为实施例3PCR产物鉴定结果。
具体实施方式
[0023] 实施例1
[0024] 一种用于鉴定中药材合欢花的引物对，所述引物对及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
[0025] 所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5’端加上特异性的GC发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为SEQ ID NO.7。
[0026] 所述引物对在制备鉴定中药材合欢花试剂盒中的应用。
[0027] 所述试剂盒的组分包括：引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
[0028] 所述试剂盒鉴定中药材合欢花的步骤包括：
[0029] (1)提取合欢花样品的基因组DNA；
[0030] (2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
[0031] (3)取步骤(2)的扩增产物，稀释50倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
[0032] (4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释100倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
[0033] (5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
[0034] 所述合欢花样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
[0035] 所述PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
[0036] 实施例2
[0037] 一种用于鉴定中药材合欢花的引物对，所述引物对及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
[0038] 所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5’端加上特异性的GC发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为SEQ ID NO.7。
[0039] 所述引物对在制备鉴定中药材合欢花试剂盒中的应用。
[0040] 所述试剂盒的组分包括：引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
[0041] 所述试剂盒鉴定中药材合欢花的步骤包括：
[0042] (1)提取合欢花样品的基因组DNA；
[0043] (2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
[0044] (3)取步骤(2)的扩增产物，稀释500倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
[0045] (4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释10倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
[0046] (5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
[0047] 所述合欢花样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
[0048] 所述PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
[0049] 实施例3
[0050] 一种用于鉴定中药材合欢花的引物对，所述引物对及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
[0051] 所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5’端加上特异性的GC发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为SEQ ID NO.7。
[0052] 所述引物对在制备鉴定中药材合欢花试剂盒中的应用。
[0053] 所述试剂盒的组分包括：引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
[0054] 所述试剂盒鉴定中药材合欢花的步骤包括：
[0055] (1)提取合欢花样品的基因组DNA；
[0056] (2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
[0057] (3)取步骤(2)的扩增产物，稀释300倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
[0058] (4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释35倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
[0059] (5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
[0060] 所述合欢花样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
[0061] 所述PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
[0062] 如图1所示，将实施例1～3的扩增产物进行电泳检测，条带清晰可见，产物单一。
