技术领域
[0001] 本
发明属于分子
生物学领域，涉及一种采用分子生物学手段鉴定中药的方法，具体为一种用于鉴定中药龙葵的引物对及其应用。
背景技术
[0002]
结直肠癌是最常见的消化道
肿瘤之一，具有高发病率、高死亡率、低治愈率等特点。目前临床上主要
治疗模式是以手术为主，结合化疗、放疗、靶向治疗、中医药治疗的综合治疗方法。全国名老中医药专家运用中药灌肠方治疗肠癌，疗效显著，龙葵作为灌肠方的主要组成药物之一，具有清
热解毒、利
水消肿的功效，其活性
单体澳洲茄胺亦是灌肠方的主要有效成分，发挥了重要的抗肿瘤作用。澳洲茄胺是来源于茄属
植物的一种甾体生物
碱，在我国主要存在于龙葵的全草中，具有多种药理活性，其抗肿瘤活性是目前研究的热点之一。前期实验发现，澳洲茄胺对肠癌细胞，肝癌细胞，
乳腺癌细胞，
宫颈癌细胞，胶质瘤
细胞增殖均有抑制作用，但其作用机制尚未明确。
[0003] 不同研究学者分别采用高效液相色谱法、
近红外光谱法、紫外光谱法等对不同来源的龙葵进行鉴定，但这些方法比较繁琐，不利于推广。近年来发展的以分子生物学为
基础的检测方法如位点特异性PCR等克服了药材传统
鉴别方法克服了药材传统鉴别方法准确度不高、主观性大等缺点。对龙葵之间的分子特异性鉴别还尚未见报道。
发明内容
[0004] 本发明解决的技术问题是：为了克服
现有技术的
缺陷，获得一种能够特异性鉴别龙葵的方法，本发明提供了一种用于鉴定中药龙葵的引物对及其应用。
[0005] 技术方案：一种用于鉴定中药龙葵的引物对，所述引物对及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
[0006] 优选的，所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5，端加上特异性的GC发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为SEQ ID NO.7。
[0007] 表1引物对及发卡结构序列
[0008]
[0009]
[0010] 所述引物对在制备鉴定中药龙葵
试剂盒中的应用。
[0011] 优选的，所述试剂盒的组分包括：引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
[0012] 优选的，所述试剂盒鉴定中药龙葵的步骤包括：
[0013] (1)提取龙葵样品的基因组DNA；
[0014] (2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
[0015] (3)取步骤(2)的扩增产物，稀释100～1000倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
[0016] (4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释10～100倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
[0017] (5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶
电泳检测。
[0018] 优选的，所述龙葵样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
[0019] 优选的，所述PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
[0020] 有益效果：(1)本发明对引物对进行修饰后能够快速、准确鉴别龙葵，为实现药材分子鉴别的现场运用提供技术
支撑；(2)本发明所述引物对特异性好，灵敏度高。
附图说明
[0021] 图1是
实施例1～3PCR鉴定结果电泳图；
[0022] 其中M为分子量为2000的Maker；B1为实施例1PCR产物鉴定结果；B2为实施例2PCR产物鉴定结果；B3为实施例3PCR产物鉴定结果。
具体实施方式
[0023] 实施例1
[0024] 一种用于鉴定中药龙葵的引物对，所述引物对及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
[0025] 所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5，端加上特异性的GC发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为SEQ ID NO.7。
[0026] 所述引物对在制备鉴定中药龙葵试剂盒中的应用。
[0027] 所述试剂盒的组分包括：引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
[0028] 所述试剂盒鉴定中药龙葵的步骤包括：
[0029] (1)提取龙葵样品的基因组DNA；
[0030] (2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
[0031] (3)取步骤(2)的扩增产物，稀释100倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
[0032] (4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释100倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
[0033] (5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
[0034] 所述龙葵样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法。
[0035] 所述PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
[0036] 实施例2
[0037] 一种用于鉴定中药龙葵的引物对，所述引物对及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
[0038] 所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5，端加上特异性的GC发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为SEQ ID NO.7。
[0039] 所述引物对在制备鉴定中药龙葵试剂盒中的应用。
[0040] 所述试剂盒的组分包括：引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
[0041] 所述试剂盒鉴定中药龙葵的步骤包括：
[0042] (1)提取龙葵样品的基因组DNA；
[0043] (2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
[0044] (3)取步骤(2)的扩增产物，稀释500倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
[0045] (4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释50倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
[0046] (5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
[0047] 所述龙葵样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法。
[0048] 所述PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
[0049] 实施例3
[0050] 一种用于鉴定中药龙葵的引物对，所述引物对及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
[0051] 所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5，端加上特异性的GC发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为SEQ ID NO.7。
[0052] 所述引物对在制备鉴定中药龙葵试剂盒中的应用。
[0053] 所述试剂盒的组分包括：引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
[0054] 所述试剂盒鉴定中药龙葵的步骤包括：
[0055] (1)提取龙葵样品的基因组DNA；
[0056] (2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
[0057] (3)取步骤(2)的扩增产物，稀释1000倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
[0058] (4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释10倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
[0059] (5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
[0060] 所述龙葵样品的基因组DNA的提取方法是CTAB法。
[0061] 所述PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
[0062] 如图1所示，将实施例1～3的扩增产物进行电泳检测，条带清晰可见，产物单一。
