技术领域
[0001] 本
发明属于分子
生物学领域，涉及一种采用分子生物学手段鉴定中药的方法，具体为一种用于鉴定中药当归的引物对及其应用。
背景技术
[0002] 当归为伞形科当归属
植物当归的干燥根，性温，味甘、辛。有和血之效，具有补血、活血、调经止痛、润燥滑肠的功能。由于临床上对当归的使用较多，使得当归需求量极大，因此，市场上当归的混伪品层出不穷。市场上常见的当归混伪品有欧当归、日本当归、阿坝当归、重齿毛当归等，这些植物在根茎形态上与正品当归十分类似，但在药效方面相差甚远，严重影响用药安全。
[0003] 目前市售药材多为加工品，当归与其混伪品的表面性状、
纤维特征甚至化学成分都及其相似，在实际应用中药进行准确
鉴别难度极大，且存在主观性大，通用性差，且对观察者经验要求高等
缺陷，不利于标准化、规范化方法的建立及普及。DNA分子遗传标记具有快速、微量、准确且特异性强等特征，为解决药材的鉴别问题提供了客观而有效的手段。前人对当归的分子鉴别主要采用nrDNA-ITS序列。
[0004]
现有技术中对于当归鉴定多是基于当归的核基因
片段或叶绿体基因片段。其中叶绿体基因片段多为单拷贝，在大多数被子植物中是母系遗传，与核基因序列相比，不受网状进化的影响。但是在中药材鉴别中，通常用到药材加工品或饮片，其基因组DNA已遭到不同程度的破坏，而叶绿体基因组则相对于核基因组易于保留，其基因片段更容易扩增。
发明内容
[0005] 本发明的目的是：为了克服现有技术的缺陷，获得一种
稳定性好，能够以痕迹量或
破碎片段为检材的引物对，本发明提供了一种用于鉴定中药当归的引物对及其应用。
[0006] 技术方案：一种用于鉴定中药当归的引物对，所述引物对及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
[0007] 优选的，所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5’端加上特异性的GC发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为SEQ ID NO.7。
[0008] 表1引物对及发卡结构序列
[0009]名称 序列(5’-3’) SEQ ID NO.
P1-F GCATGCGATACTTGGTGTGAAT 1
P1-R CGACGCTTCTCCAGACTACAAT 2
P2-F GGCGAAATCGGTAGACGCTACG 3
P2-R GGATTTGAACTGGTGACACGAG 4
P3-F GGCAAAGAGGGAAGATTTCG 5
P3-R GCCATAAGCATATCTTGAGTTG 6
发卡结构 CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG 7
[0010] 所述引物对在制备鉴定中药当归
试剂盒中的应用。
[0011] 优选的，所述试剂盒的组分包括：引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
[0012] 优选的，所述试剂盒鉴定中药当归的步骤包括：
[0013] (1)提取当归样品的基因组DNA；
[0014] (2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
[0015] (3)取步骤(2)的扩增产物，稀释20～200倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
[0016] (4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释10～100倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
[0017] (5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶
电泳检测。
[0018] 优选的，所述当归样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
[0019] 优选的，所述PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
[0020] 有益效果：(1)本发明所述引物对稳定性好，能够以痕迹量或破碎片段为检材；(2)本发明所述引物对特异性好，灵敏度高。
附图说明
[0021] 图1是
实施例1～3PCR鉴定结果电泳图；
[0022] 其中M为分子量为2000的Maker；1为实施例1PCR产物鉴定结果；2为实施例2PCR产物鉴定结果；3为实施例3PCR产物鉴定结果。
具体实施方式
[0023] 实施例1
[0024] 一种用于鉴定中药当归的引物对，所述引物对及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
[0025] 所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5’端加上特异性的GC发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为SEQ ID NO.7。
[0026] 所述引物对在制备鉴定中药当归试剂盒中的应用。
[0027] 所述试剂盒的组分包括：引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
[0028] 所述试剂盒鉴定中药当归的步骤包括：
[0029] (1)提取当归样品的基因组DNA；
[0030] (2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
[0031] (3)取步骤(2)的扩增产物，稀释20倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
[0032] (4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释100倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
[0033] (5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
[0034] 所述当归样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
[0035] 所述PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
[0036] 实施例2
[0037] 一种用于鉴定中药当归的引物对，所述引物对及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
[0038] 所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5，端加上特异性的GC发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为SEQ ID NO.7。
[0039] 所述引物对在制备鉴定中药当归试剂盒中的应用。
[0040] 所述试剂盒的组分包括：引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
[0041] 所述试剂盒鉴定中药当归的步骤包括：
[0042] (1)提取当归样品的基因组DNA；
[0043] (2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
[0044] (3)取步骤(2)的扩增产物，稀释200倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
[0045] (4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释10倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
[0046] (5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
[0047] 所述当归样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
[0048] 所述PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
[0049] 实施例3
[0050] 一种用于鉴定中药当归的引物对，所述引物对及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
[0051] 所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5’端加上特异性的GC发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为SEQ ID NO.7。
[0052] 所述引物对在制备鉴定中药当归试剂盒中的应用。
[0053] 所述试剂盒的组分包括：引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
[0054] 所述试剂盒鉴定中药当归的步骤包括：
[0055] (1)提取当归样品的基因组DNA；
[0056] (2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
[0057] (3)取步骤(2)的扩增产物，稀释180倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
[0058] (4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释30倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
[0059] (5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
[0060] 所述当归样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
[0061] 所述PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
[0062] 如图1所示，将实施例1～3的扩增产物进行电泳检测，条带清晰可见，产物单一。
