技术领域
[0001] 本
发明涉及
生物防治技术领域，特别是涉及产脲节杆菌在防治玉米病害中的应用。
背景技术
[0002] 玉米是我国重要的粮食作物，在玉米种植过程中，玉米茎基腐病、玉米纹枯病和玉米叶斑病是危害玉米
质量和产量的典型病害。其中，玉米茎基腐病又称玉米茎腐病、玉米青枯病，是一种典型的土传性病害，该病在植株的整个生育期均可发生，主要危害植株的根部和茎基部，使茎基部发褐变软、果穗下垂，最终整株萎蔫死亡。引起玉米茎基腐病的致病菌为腐霉属(Pythium spp.)和镰刀菌属(Fusarium spp.)，两者单独或配合致病。玉米纹枯病主要发生在玉米生长后期，危害玉米近地面几节的叶鞘和茎秆，引起茎基腐败，易造成较大损失。玉米纹枯病的病原菌为丝核菌属(Rhizoctonia spp.)。玉米叶斑病主要危害
叶片，也危害叶鞘和苞叶，影响光合作用从而降低玉米产量。玉米叶斑病的病原菌为弯孢菌属(Curvularia spp.)等。针对玉米茎基腐病、纹枯病和叶斑病，常用的药剂防治手段为大量喷施多菌灵、百菌清等化学
农药，或制成化学种衣剂，带来了粮食安全
风险和
水土环境污染隐患。为了缓解
化学农药的对玉米病害的
生物防治技术正在不断创新和突破，目前研发的生防菌包括芽孢杆菌、假单胞菌、木霉、放线菌等，未见利用节杆菌防治上述玉米病害的
现有技术。
发明内容
[0003] 本发明要解决的技术问题是针对玉米典型病害，提供产脲节杆菌在防治玉米病害中的应用，具体为利用节杆菌防治玉米茎基腐病、玉米纹枯病和玉米叶斑病。
[0004] 本发明的产脲节杆菌在防治玉米病害中的应用技术方案为，
[0005] 本发明所述的产脲节杆菌(Arthrobacter ureafaciens)Fp64，该菌株已于2018年04月26日保藏于中国普通
微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.15644。
[0006] 上述菌株在公开日为2018.11.13，公开号为CN 108795799A，
发明名称为一株用于控制
土壤磷素流失的多功能节杆菌Fp64及其应用的
专利申请中公开。
[0007] 所述产脲节杆菌可耐受100g/L的NaCl盐浓度，因此采用该节杆菌制备的生防产品在盐
碱地里也可以使用。
[0008] 所述产脲节杆菌对玉米茎基腐病病原菌畸雌腐霉(Pythium irregulare)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的抑菌率为93.82％和54.76％，对玉米纹枯病病原菌立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)(AG1-IA融合群)的抑菌率为88.02％，对玉米叶斑病病原菌新月弯孢菌(Curvularia lunata)的抑菌率为78.85％。本发明还提供一种用于防治玉米茎基腐病、玉米纹枯病和玉米叶斑病的喷施菌剂、种衣剂或活性育苗基质，所述的防治玉米茎基腐病和玉米纹枯病的喷施菌剂、种衣剂或活性育苗基质都是采用产脲节杆菌(Arthrobacter ureafaciens)Fp64制备而成。
[0009] 所述喷施菌剂为水剂，各组分按重量份含量如下：活性成分50～99，分散剂0.2～15，促渗剂0.2～15，
表面活性剂0.2～20，
防腐剂0.1～0.5，pH6.5～8.0；
[0010] 其中活性成分为产脲节杆菌Fp64
发酵物；分散剂为分散剂NNO；促渗剂为氮
酮、噻酮中的至少一种；表面活性剂为十二
烷基磺酸钠、木质素磺酸钠、皂
角粉中的至少一种；防腐剂为山梨酸
钾、丙酸
钙中的至少一种；
[0011] 所述喷施菌剂的制备步骤包括：
[0012] (1)将产脲节杆菌(Arthrobacter ureafaciens)Fp64活化，作为产脲节杆菌Fp64
种子液；
[0013] (2)将产脲节杆菌Fp64种子液扩大培养，作为Fp64发酵物；
[0014] (3)将产脲节杆菌Fp64发酵物作为活性成分与其他添加剂组合成Fp64喷施菌剂。
[0015] 所述的一种防治玉米茎基腐病、玉米纹枯病和玉米叶斑病的喷施菌剂使用方法，将喷施菌剂稀释100倍，在大喇叭口期、灌浆期和乳熟期，或田间发现零星病株时，喷茎根或灌根；隔7～15d喷一次，连喷2～3次。
[0016] 所述种衣剂各组分按重量份含量如下：活性成分10～40，填料40～60，分散剂0.1～0.2，防腐剂0.1～0.5，成膜剂4～20；
[0017] 其中活性成分为产脲节杆菌Fp64母粉；填料为
硅藻土；分散剂为分散剂NNO；防腐剂为山梨酸钾、丙酸钙中的至少一种；成膜剂为市售成膜剂；
[0018] 所述种衣剂的制备步骤包括：
[0019] (1)将产脲节杆菌(Arthrobacter ureafaciens)Fp64活化，作为产脲节杆菌Fp64种子液；
[0020] (2)将产脲节杆菌Fp64种子液扩大培养，作为产脲节杆菌Fp64发酵液；
[0021] (3)将产脲节杆菌Fp64发酵液进行干燥处理成干粉，作为产脲节杆菌Fp64母粉；
[0022] (4)将产脲节杆菌Fp64母粉作为活性成分与其他添加剂组合成产脲节杆菌Fp64种衣剂。
[0023] 所述的一种防治玉米茎基腐病、玉米纹枯病和玉米叶斑病的种衣剂使用方法，包衣质量百分比为20％～25％。包衣玉米种子按照常规方式
播种。
[0024] 所述活性育苗基质中各成分按重量份含量如下:活性成分20～40；腐熟麦秸10～15，蛭石20～30，珍珠岩5～10，腐植酸5～10，草木灰3～5，无机盐0.1～0.2；
[0025] 其中活性成分为产脲节杆菌Fp64发酵物；无机盐包括
磷酸二氢铵、
氯化钙、氯化镁和微量元素；
[0026] 所述活性育苗基质的制备步骤包括：
[0027] (1)将产脲节杆菌Fp64活化，作为产脲节杆菌Fp64种子液；
[0028] (2)将产脲节杆菌Fp64种子液扩大培养，作为产脲节杆菌Fp64发酵物；
[0029] (3)将产脲节杆菌Fp64发酵物作为活性成分与其他基质成分组合成产脲节杆菌Fp64活性育苗基质。
[0030] 一种防治玉米茎基腐病、玉米纹枯病和玉米叶斑病的活性育苗基质使用方法为，将活性育苗基质放入常规育苗穴盘，现将玉米种子以常规方法催苗，再将种子播入育苗盘中，每个孔穴播种一粒。育苗后可按照常规方式移栽。
[0031] 本发明的有益效果为：本发明的节杆菌菌株对玉米的腐霉菌、镰刀菌、丝核菌和弯孢菌均有拮抗作用，可单独或同时防治玉米茎基腐病、玉米纹枯病和玉米叶斑病，减少多种菌株配伍成本，可实现减施增效；
[0032] 本发明利用的节杆菌菌株是在健康农田土壤分离筛选获得，对环境友好；该菌株还具有调节土壤磷素的特性，在玉米农田长期施用可有效缓解磷素向毗邻
水体的流失，减少化肥的施用量；该菌株还具有高耐盐的特性，对盐碱、盐渍地的玉米农田适应性强。故而利用该菌株制成的喷施菌剂、包衣剂和育苗基质均具有环境友好、降低土壤磷素流失和盐地适应强的优势；
[0033] 本发明对于播种的玉米品种提供喷施菌剂和种衣剂(种子包衣剂)，对于不宜播种的玉米品种(如水果玉米)提供防病的活性育苗基质，应用范围广，实用性强。
附图说明：
[0034] 图1所示为Fp64对畸雌腐霉的拮抗作用处理和对照照片；
[0035] 图2所示为Fp64对尖孢镰刀菌的拮抗作用处理和对照照片；
[0036] 图3所示为Fp64对立枯丝核菌的拮抗作用处理和对照照片；
[0037] 图4所示为Fp64对新月弯孢菌的拮抗作用处理和对照照片。具体实施方式：
[0038] 为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。
[0040] 产脲节杆菌Fp64对玉米茎基腐病、纹枯病和叶斑病病原菌的拮抗作用[0041] (1)病原菌来源
[0042] 病原菌均采集自玉米植株的发病部位，采集地为山东省泰安市满庄镇玉米田。其中玉米茎基腐病的病原菌鉴定为畸雌腐霉(Pythium irregulare)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，玉米纹枯病的病原菌鉴定为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)的AG1-IA融合群，玉米叶斑病的病原菌鉴定为新月弯孢菌(Curvularia lunata)。
[0043] (2)对峙试验
[0044] 将产脲节杆菌Fp64和上述四种病原菌分别在细菌和
真菌通用的培养基上活化，将活化好的Fp64与无菌蒸馏水混匀制成浓度为1×109的菌悬液。配制PDA培养基并冷却至50℃以下，每100mL PDA中混入2mL菌悬液晃动均匀，倒8.5cm平板静置
凝固，为对峙平板。在活化好的四种病原菌菌落上用5mm打孔器打菌饼，将每种病原菌菌饼分别接种至对峙平板中央
位置，在25℃暗培养5～9天，测量菌株生长直径。试验以无菌的PDA平板接入各病原菌菌饼为对照，设三个实验重复。
[0045] 1L PDA培养基配方：
马铃薯200g，
葡萄糖20g，琼脂10g，补足1L水。培养基在115℃下高压灭菌30min。
[0046] 结果显示，产脲节杆菌Fp64对畸雌腐霉的抑菌率为93.82％(图1)，对尖孢镰刀菌的抑菌率为54.76％(图2)，对立枯丝核菌的抑菌率为88.02％(图3)，对新月弯孢菌的抑菌率为78.85％(图4)。结果表明，Fp64对玉米茎基腐病、玉米纹枯病和玉米叶斑病的病原菌均有显著的拮抗作用。
[0047] 实施例2
[0048] 产脲节杆菌Fp64喷施菌剂的制备
[0049] (1)产脲节杆菌Fp64种子液的获得；
[0050] 将产脲节杆菌Fp64在LB培养基上进行活化，然后移至100mL LB培养液中，于30℃、180rpm振荡培养16hr，得到种子液。
[0051] 1L LB培养基配方：蛋白胨10g，
酵母提取物5g，NaCl 10g，蒸馏水补足至1L，琼脂粉15g(液体培养基不添加)，pH 7.0。培养基在120℃0.1MPa下高压灭菌20min。
[0052] (2)产脲节杆菌Fp64发酵物的获得
[0053] 将产脲节杆菌Fp64种子液，按照1:1000的比例移至扩大培养基中扩大培养，条件为30℃、搅拌转速200rpm，通气量1:2，发酵周期为24hr，得到Fp64发酵液。
[0054] 1L扩大培养基配方：黄豆粉10g，玉米浆22g，酵母膏10g，
硫酸铵2g，
氯化钠4g，蒸馏水补足1L，pH 7.0。培养基在120℃0.1MPa下高压灭菌20min。
[0055] (3)产脲节杆菌Fp64喷施菌剂的获得
[0056] 将产脲节杆菌Fp64发酵物与其他添加剂组合成Fp64喷施菌剂。菌剂各组分含量为：产脲节杆菌Fp64发酵物80重量份、分散剂NNO 5重量份、氮酮5重量份、十二烷基磺酸钠10重量份和山梨酸钾0.4重量份。所得喷施菌剂的活菌数为(5～10)×108cfu/mL。
[0057] 实施例3
[0058] 产脲节杆菌Fp64喷施菌剂的田间防效测定
[0059] 试验品种为夏玉米品种郑单958。
[0060] 试验药剂和对照药剂：产脲节杆菌Fp64喷施菌剂由实施例1提供。对照药剂为50％多菌灵，购自当地农资市场，是生产上防治玉米茎基腐病、玉米纹枯病和玉米叶斑病的常用化学药剂，按商品田间推荐剂量使用。
[0061] 本试验共设3个处理3个重复，产脲节杆菌Fp64喷施菌剂100倍稀释液、50％多菌灵500倍稀释液和清水对照。在玉米大喇叭口期、灌浆期和乳熟期分别喷茎根部位，使均匀
覆盖即可，隔7～15d喷一次，连喷2～3次。小区设置、调查方法、发病率、病情分级按照农业部标准《玉米抗病虫性鉴定技术规范》NY/T1248.6-2016、1248.9-2016和1248.10-2016进行设置。
[0062] 玉米茎基腐病发病株率计算公式： 其中X表示发病株率(％)，Y表示发病株数(株)，N表示调查总株数(株)。
[0063] 玉米纹枯病和玉米叶斑病病情指数计算公式： 其中X表示病情指数，Si表示病情级别，j表示对应Si的该级别植株数，单位为株；N表示调查总株数，单位为株。
[0064] 防效计算公式：
[0065] 试验结果见表1。
[0066] 本发明提供的产脲节杆菌Fp64喷施菌剂在田间对玉米茎基腐病、玉米纹枯病和玉米叶斑病的防效分别为75.07％、80.54％和68.45％，对照药剂的相应防效分别为61.25％、62.58％和64.36％，如表1所示。结果表明，Fp64喷施菌剂对玉米茎基腐病、纹枯病和叶斑病的防效显著故而利用该喷施菌剂可用于单独或同时防治三种病害，具有很好的田间应用价值。
[0067] 表1 Fp64喷施菌剂对玉米茎基腐病和玉米纹枯病田间防效测定
[0068]
[0069] 实施例4
[0070] 产脲节杆菌Fp64种衣剂的制备
[0071] (1)产脲节杆菌Fp64种子液的获得；
[0072] 同实施例1
[0073] (2)产脲节杆菌Fp64发酵物的获得
[0074] 同实施例1
[0075] (3)产脲节杆菌Fp64菌粉的获得
[0076] 取产脲节杆菌Fp64发酵物，加入3％重量百分比的明胶作为热保护剂。采用微生物菌剂
喷雾干燥机进行干燥，得到的干粉即为节杆菌Fp64母粉。所得菌粉的活菌数为(100～500)×108cfu/g。
[0077] (4)产脲节杆菌Fp64种衣剂的获得
[0078] 将产脲节杆菌Fp64菌粉与其他添加剂组合成产脲节杆菌Fp64种衣剂。种衣剂各组分含量为：产脲节杆菌Fp64母粉20重量份、
硅藻土50重量份、分散剂NNO 0.2重量份、山梨酸钾0.2重量份和0.4重量份成膜剂(德国拜
耳)。
[0079] 实施例5
[0080] 产脲节杆菌Fp64种衣剂的田间防效测定
[0081] 试验品种为夏玉米品种郑单958。
[0082] 试验药剂和对照药剂：Fp64种衣剂由实施例3提供。对照药剂按照重量份，将50％浓度的多菌灵5重量份、硅藻土50重量份、NNO 0.2重量份、山梨酸钾0.2重量份和0.4重量份成膜剂(德国拜耳)混合成多菌灵种衣剂。
[0083] 用种子包衣机(南京农牧机械厂)按照23％的包衣质量百分比对玉米种子进行包衣处理。
[0084] 本试验共设3个处理3个重复，Fp64种衣剂、多菌灵种衣剂和清水对照。播种方式为常规方式。小区设置、调查方法、发病率、病情分级按照农业部标准《玉米抗病虫性鉴定技术规范》NY/T 1248.6-2016、1248.9-2016和1248.10-2016进行设置。
[0085] 玉米茎基腐病发病株率计算公式： 其中X表示发病株率(％)，Y表示发病株数(株)，N表示调查总株数(株)。
[0086] 玉米纹枯病和玉米叶斑病病情指数计算公式： 其中X表示病情指数，Si表示病情级别，j表示对应Si的该级别植株数，单位为株；N表示调查总株数，单位为株。
[0087] 防效计算公式：
[0088] 试验结果见表2。
[0089] 本发明提供的产脲节杆菌Fp64种衣剂在田间对玉米茎基腐病和玉米纹枯病的防效分别为68.11％、71.55％和58.63％，对照药剂的相应防效分别为56.15％、59.90％和52.00％。结果表明，Fp64种衣剂对玉米茎基腐病、纹枯病和叶斑病的防效显著，该包衣剂可用于单独或同时防治三种病害，具有很好的田间应用价值。
[0090] 表2 Fp64种衣剂对玉米茎基腐病和玉米纹枯病田间防效测定
[0091]
[0092]
[0093] 实施例6
[0094] 产脲节杆菌Fp64活性育苗基质的制备
[0095] (1)产脲节杆菌Fp64种子液的获得；
[0096] 同实施例1
[0097] (2)产脲节杆菌Fp64发酵物的获得
[0098] 同实施例1
[0099] (3)产脲节杆菌Fp64活性基质的获得
[0100] 将产脲节杆菌Fp64发酵物与其他添加剂组合成Fp64活性基质。
[0101] 活性育苗基质中各成分按重量份含量如下:产脲节杆菌Fp64发酵物40重量份腐熟麦秸12重量份，蛭石25重量份，珍珠岩8重量份，腐植酸8重量份，草木灰4重量份，无机盐(磷酸二氢铵、氯化钙、氯化镁、微量元素肥)0.2重量份。
[0102] 实施例7
[0103] 产脲节杆Fp64活性育苗基质的田间防效测定
[0104] 试验品种为水果玉米。
[0105] 试验基质和对照基质：产脲节杆Fp64活性基质由实施例5提供。将浓度为50％的多菌灵3重量份、腐熟麦秸12重量份、蛭石25重量份、珍珠岩8重量份、腐植酸8重量份、草木灰4重量份和无机盐(磷酸二氢铵、氯化钙、氯化镁、微量元素肥)0.2重量份，混合成多菌灵基质为对照基质。
[0106] 本试验共设3个处理3个重复，产脲节杆Fp64活性基质、多菌灵基质和清水对照。玉米育苗方式为常规方式。小区设置、调查方法、发病率、病情分级按照农业部标准《玉米抗病虫性鉴定技术规范》NY/T 1248.6-2016、1248.9-2016和1248.10-2016进行设置。
[0107] 玉米茎基腐病发病株率计算公式： 其中X表示发病株率(％)，Y表示发病株数(株)，N表示调查总株数(株)。
[0108] 玉米纹枯病和玉米叶斑病病情指数计算公式： 其中X表示病情指数，Si表示病情级别，j表示对应Si的该级别植株数，单位为株；N表示调查总株数，单位为株。
[0109] 防效计算公式：
[0110] 试验结果见表3。
[0111] 本发明提供的产脲节杆Fp64活性基质在田间对玉米茎基腐病、玉米纹枯病和玉米叶斑病的防效分别为64.36％、69.94％和63.28，对照药剂的相应防效分别为52.81％、51.82％和65.25％。结果表明，Fp64活性基质对玉米茎基腐病、纹枯病和叶斑病的防效显著，利用该活性基质可单独或同时防治三种病害，具有很好的田间应用价值。
[0112] 表3 Fp64活性基质对玉米茎基腐病和玉米纹枯病田间防效测定
[0113]
[0114] 最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行
修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
