改进的妊娠测试设备和方法
阅读：336发布：2024-01-19
专利汇可以提供改进的妊娠测试设备和方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且在此披露一种用于检测人女性受试者的妊娠的测试设备，该测试设备包括：用于测量来自该受试者的一种样品中的hCG的绝对或相对量的一个测定装置；用于测量来自该受试者的一种样品中的FSH的绝对或相对量的一个测定装置；以及用于测量来自该受试者的一种样品中的一种或多种孕 酮 代谢物 的绝对或相对量的一个测定装置。，下面是改进的妊娠测试设备和方法专利的具体信息内容。
1.一种用于检测人女性受试者的妊娠的测试设备，该测试设备包括：用于测量来自该受试者的一种样品中的hCG的绝对或相对量的一个测定装置；
用于测量来自该受试者的一种样品中的FSH的绝对或相对量的一个测定装置；
以及用于测量来自该受试者的一种样品中的一种孕酮代谢物的绝对或相对量的一个测定装置。
2.根据权利要求1所述的测试设备，包括基于一个或多个侧流测试条带和/或微流体的测定。
3.根据权利要求1或2所述的测试设备，包括测定结果读取装置。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的测试设备，进一步包括：一个微处理器、ASIC或其他计算机化的控制装置；以及用于将该测定的结果或结局显示给一个使用者的一个测定结果显示器。
5.根据以上权利要求中任一项所述的测试设备，包括一个数字存储器设备，该数字存储器设备被编程有针对每种分析物的至少一个预定信号值阈值。
6.根据权利要求5所述的测试设备，其中该设备包括被编程有一种算法的一个微处理器、ASIC或其他可编程的计算机控制装置以便通过将这些分析物测定信号值与其对应的预定阈值进行比较来确定测试结果。
7.根据以上权利要求中任一项所述的测试设备，该测试设备是一种定点照护或“自测试”设备。
8.根据以上权利要求中任一项所述的测试设备，该测试设备在单次使用之后被丢弃。
9.根据以上权利要求中任一项所述的数字测试设备，该测试设备解释这些测定测试结果并且将一个测试结局显示给该使用者。
10.根据以上权利要求中任一项所述的测试设备，包括一个或多个光源以便照明一个或多个微流体或侧流测定检测区；以及一个或多个光检测器以便检测由所述检测区反射或透射的光。
11.根据以上权利要求中任一项所述的测试设备，包括针对hCG的至少两个测定，这些测定中的一个是一个相对高灵敏度测定，并且这些测定中的一个是一个相对低灵敏度测定，这样使得该测试设备能够测量一个延伸范围内的hCG浓度。
12.根据权利要求11所述的测试设备，其中该相对高灵敏度测定和该相对低灵敏度测定是在单独的侧流测试条带上或单独的微流体测定流动路径上。
13.根据权利要求11所述的测试设备，其中该相对高灵敏度测定和该相对低灵敏度测定是在同一侧流测试条带上或同一微流体测定流动路径上。
14.根据以上权利要求中任一项所述的测试设备，其中通过孕酮代谢物测定检测到的该孕酮代谢物包含孕二醇或其一种衍生物。
15.根据以上权利要求中任一项所述的测试设备，其中通过该孕酮代谢物测定检测到的该孕酮代谢物包含一种葡糖苷酸。
16.根据以上权利要求中任一项所述的测试设备，其中通过该孕酮代谢物测定检测到的该孕酮代谢物包含孕二醇-3-葡糖苷酸。
17.根据以上权利要求中任一项所述的测试设备，其中该测试设备被编程有一个下限hCG阈值和一个上限hCG阈值，这样使得低于该下限hCG阈值的一个hCG测定结果被解释为意味着该受试者未怀孕；并且高于该上限阈值的一个hCG测定结果被解释为意味着该受试者怀孕，而不管针对另外两种分析物的测定的这些结果；并且在该下限阈值与该上限阈值之间的一个hCG测定结果取决于该FSH测定结果和该孕酮代谢物测定结果而被解释为怀孕或未怀孕。
18.根据权利要求1至16中任一项所述的测试设备，其中该测试设备被编程有一个下限hCG阈值和一个上限hCG阈值，这样使得低于该下限hCG阈值的一个hCG测定结果被解释为意味着该受试者未怀孕；并且高于该上限阈值的一个hCG测定结果被解释为意味着该受试者怀孕，经受针对该另外两种分析物的该测定的这些结果的确认。
19.根据权利要求17或18所述的测试设备，进一步包括至少一个另外的hCG阈值。
20.根据以上权利要求中任一项所述的测试设备，该测试设备被适配且配置成显示一名怀孕受试者的妊娠的一个近似胎龄。
21.根据权利要求20所述的测试设备，其中对于一名怀孕受试者，该设备视情况将胎龄显示为1-2周、2-3周或3+周的时间间隔。
22.根据以上权利要求中任一项所述的测试设备，进一步包括一种控制功能以便指示该设备是否正确地运行。
23.根据以上权利要求中任一项所述的测试设备，包括一个不透湿气的壳体，该壳体容纳该测试设备的这些部件中的大多数或全部；以及在一个样品施加构件上的一个样品施加区，该样品施加区突出超出该壳体以便允许施加一种样品。
24.根据以上权利要求中任一项所述的测试设备，包括一个共同样品施加区，这样使得施加到该共同样品施加区上的一种样品进入两个或更多个不同的流动路径，其中至少一种不同的分析物测定位于该两个或更多个不同流动路径中的对应一个上。
25.根据权利要求1-23中任一项所述的测试设备，其中针对hCG、FSH和一种孕酮代谢物中的每种的测定全部设置在一个单个、共同的流动路径上。
26.根据以上权利要求中任一项所述的测试设备，另外包括用于测量黄体生成激素的绝对或相对量的一个测定装置和/或用于测量人胎盘催乳素的绝对或相对量的一个测定装置。
27.根据权利要求1或2或从属于权利要求1或2的权利要求7-8、11-16或22-25中任一项所述的测试设备，其中该测试设备是一个一次性可视读取设备与一个单独持久性测定读取设备的组合。
28.根据权利要求27所述的与一个单独持久性测定读取设备组合的测试设备，其中该单独测定读取设备包括一个照相机。
29.根据权利要求27或权利要求28所述的与一个单独测定读取设备组合的测试设备，其中该单独测定读取设备包括一个智能手机或其他数字手持式读取设备。
30.一种检测人女性受试者的妊娠的方法，该方法包括以下步骤：使来自该受试者的一种样品与根据以上权利要求中任一项所述的测试设备相接触。
31.一种电子可编程设备，该电子可编程设备被编程为分析对来自人女性的一种样品进行的hCG、FSH和一种孕酮代谢物的测定的结果，并且用于从这些测定中的一个或多个的分析确定该受试者是否怀孕和/或妊娠的胎龄。
32.根据权利要求31所述的设备，其中该分析包括将一种特定分析物的一个测定信号值与至少一个对应存储的阈值信号值进行比较。
33.根据权利要求1-29中任一项所述的测试设备或根据权利要求30所述的方法，该测试设备或方法提供如以下列出的特征(i)-(vii)中的至少一个、优选地两个或更多个、更优选地三个或更多个且最优选地全部：
(i)99％或更高的灵敏度；
(ii)99％或更高的特异性；
(iii)即使测试当天在妊娠早期(在预期的月经期当天之前)也能够实现(i)和(ii)；
(iv)即使当在一个单一时间点(即在单一天)进行一次测试/使用一次测定设备时也能够实现(i)和(ii)；
(v)测定设备/方法不需要任何外部信息(例如女性的年龄或受试者的任何病史，如hCG、FSH或孕酮的先前测量)；以及
(vi)即使当这些受试者包括围绝经期和/或绝经后女性时也能够实现(i)和(ii)。
34.根据权利要求31或32且进一步根据权利要求1-25中任一项所述的电子可编程设备。
35.根据权利要求1-29中任一项所述的测试设备，基本上如上文所描述且参考附图。
改进的妊娠测试设备和方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种妊娠测试设备，且涉及一种进行妊娠测试的方法，并且涉及一种制造该设备的方法。
[0002] 发明背景
[0003] 简单的侧流免疫测定设备已进行了开发和商业化以用于检测流体样品中的分析物，参见例如EP291194。这类设备典型地包括一种多孔载体，该多孔载体包括一种干燥的可移动的标记结合试剂，该标记结合试剂能够与所讨论的分析物结合；以及一种固定的结合试剂，该结合试剂也能够与在该标记结合试剂下游的一个检测区处提供的分析物结合。检测在该检测区处的固定的标记结合试剂提供样品中分析物的存在的指示。
[0004] 可替代地，当所感兴趣的分析物是一种半抗原时，免疫测定设备可以采用一种竞争反应，其中一种标记分析物或分析物类似物与存在于样品中的分析物竞争与一个检测区处的一种固定的结合试剂结合。可替代地，测定设备可以采用一种抑制反应，其中一种固定的分析物或分析物类似物提供在一个检测区处，该测定设备包括针对该分析物的一种可移动的标记结合试剂。
[0005] 一个测定设备可能能够检测多于一种分析物的存在和/或量。例如，在检测药物滥用的存在的测定的情况下，该设备可能能够测定一整组药物。这类侧流免疫测定设备通常设置有多个检测区，这类区被提供在测定设备内的一个单个或多个侧流载体上。
[0006] 确定测定的结果一直传统地通过眼睛进行。然而，这类设备需要由使用者对结果进行解释，这引入不希望程度的主观性，特别是在检测区的强度微弱时的较低分析物水平下。
[0007] 因此，已经开发了数字设备，这些数字设备包括一个光学检测装置，该光学检测装置被安排成确定测定的结果；以及一个显示装置，该显示装置用于显示该测定的结果。用于与测定测试条带组合用于测定一种流体样品中的分析物的浓度和/或量的数字测定读取器是已知的，包括一个集成数字测定读取器的测定设备也是已知的。这种设备的一个实例在EP 1484601中披露。
[0008] 来自一个光源，如一个发光二极管(LED)的光照射到多孔载体的一部分上并且通过一个光检测器检测反射光抑或透射光。典型地，读取器将具有超过一个LED以便照明载体的不同区，并且一个相应光检测器被提供用于该多个LED中的每一个。EP1484601披露了一种用于侧流测试条带数字读取设备的光学安排，该光学安排包括一种挡板安排，从而允许减少该设备中的光检测器的数目的可能性。
[0009] 以上类型的测定技术已经实施到“自测试”妊娠测试设备中。这些典型地是，由怀疑她们可能怀孕的女性使用的设备。因此，它们必须被如此设计，其方式为使得它们易于使用(不需要任何医学或技术训练)，并且典型地可在单次使用之后丢弃。该设备通常是一种侧流免疫测定设备，并且通常通过使一个侧流测定棒的一个取样部分与一种尿样品相接触来开始测试。该测定棒的取样部分可以被浸没到一个容器中的一种尿样品中，活着更典型地，使用者可以直接撒尿到该取样部分上。该测定然后在无需女性进行任何进一步步骤的情况下运行，并且指示结果且通过眼睛读取，或者在一种数字设备中，通过一个测定结果读取装置确定结果并且通过一个显示器，例如像一个液晶显示器(LCD)将结果显示给使用者。
[0011] 对于一种改进的妊娠测试，特别是一种改进的自测试妊娠测试存在需要：许多女性希望尽可能快地知道她们是否怀孕，并且因此对于一种非常灵敏的测试存在需要，该测试能够检测样品(如尿)中在非常低浓度下的hCG。然而，这产生了一个问题，因为hCG有时可能出于除妊娠之外的原因以相对低的浓度存在于尿中，这样使得一个非常灵敏的妊娠测试可能给出一个假阳性结果(即，测定的特异性被减弱)。
[0012] 作为这一点的一个例证，非妊娠相关的hCG可以存在于一种尿样品中。更特别的是，hCG可以存在于来自围绝经期和绝经后女性的尿中，并且来源于垂体而不是发育中的胚胎。在一个妊娠测试中，这种脑下垂体来源的hCG或其他非妊娠相关的hCG的检测将引起针对妊娠的一个假阳性结果。在许多国家，女性例如由于工作或其他责任推迟成家直到生命后期，并且因此针对“家用”或自测试妊娠测试设备的较小但显著的市场是由大龄女性构成的，这些女性可能落入围绝经期或绝经后年龄段中，并且因此在使用一种灵敏hCG测定的情况下易于出现假阳性结果。根据一项研究，达10％的OTC妊娠测试的销售一直是针对＞40岁的女性(莱维特(Leavitt)SA 2006，“私人小革命：美国文化中的家用妊娠试验(A private little revolution：the home pregnancy test in American Culture)”医学史的公告(Bull.Hist.Med.)2006；80：317-45)。
[0013] 根据世界卫生组织(World Health Organization)，“绝经期”和“围绝经期”的公认定义是如下：
[0014] 绝经期(自然绝经)－－被定义为由卵巢卵泡活性的损失引起的月经期的永久停止。自然绝经被认为在连续12个月闭经之后发生，对于该闭经不存在其他明显的病理或生理原因。绝经期伴随最后月经期(FMP)发生，其仅在该事件后回顾一年或更长时确切已知。
[0015] 围绝经期——术语围绝经期包括就在绝经期之前的时期(当内分泌、生物学和临床特征接近绝经期开始时)和绝经期之后的第一年。
[0016] 因此，出于本发明的目的，围绝经期女性被定义为根据上述WHO定义也在围绝经期的那些女性，并且绝经后女性被定义为根据上述WHO定义已经经历绝经期的那些。
[0017] 自测试或“家用”妊娠测试需要是可靠的，以便确保女性对接受她们的测试结果采取适当的措施。一种令人希望的可靠性目标是≥99％准确度(即，1％或更低的组合假阳性和假阴性率)。当前可用的自测试或家用测试设备能够以≥99％的灵敏度检测在25mIU/ml或更高浓度下的尿hCG。这类设备能够实现所希望的≥99％准确度目标，但只有在受试者预期其月经期开始当天(即预期的月经出血的第一天)或之后使用，因为从该时间点，几乎所有怀孕的女性将具有25mIU/ml或更大的尿hCG浓度，并且非妊娠相关hCG的水平通常不会达到这一水平。然而，由此断定如果一名女性在其预期月经期当天之前使用一种自测试设备，一种假阴性结果是可能的，因为尿hCG浓度尚未达到可由测试检测到的一个水平。因此，当在预期月经期当天之前使用时，当前可用的常规自测试妊娠测试设备不是99％准确的。实际上，在排卵后10天尿中hCG的中值水平是约8.4mIU/ml，并且从该天仅约10％的样品将具有＞25mIU/ml的hCG浓度。因此，在妊娠早期，使用具有25mIU/ml灵敏度的一种常规自测试设备，将观察到非常低的妊娠检测率。在排卵后11天时，中值水平上升至19.8mIU/ml，因此在这个阶段少于50％的女性将可能得到阳性结果。基于25mIU/ml测试灵敏度，针对随后测试的检测率将是大约70％(第12天)、80％(第13天)和几乎100％(第14天)。仅仅使用一种更灵敏的测试不是一个解决方案，因为这会增加一个假阳性结果的风险，这是由于检测到非妊娠相关hCG的可能性增加，所以该测试仍然不是≥99％准确。
[0018] 因此，对于一种妊娠测试设备，尤其是一种自测试或家用测试设备存在需要，该设备能够以≥99％准确度检测妊娠，即使在妊娠中比预期的月经期当天更早的一个时间点处使用时。
[0019] 在不同的背景下，在许多国家，在进行可能伤害一个发育中胎儿的任何医学干预之前对几乎所有生育年龄的女性患者常规地进行针对血清hCG的测试。在围绝经期和绝经后女性中，由于“垂体”hCG所致的血清hCG水平升高的问题得以识别。斯奈德(Snyder)等人，(临床化学(Clinical Chemistry)2005 51，1830-1835)检查了非怀孕女性的血清hCG浓度随年龄的变化，并且调查了使用血清卵泡刺激激素(FSH)测量作为一种帮助来解释高于预期的hCG结果。他们建议血清hCG测量、受试者的年龄的了解以及血清FSH测量的组合可以用于减少或避免“假阳性”妊娠结果。然而，这些工作者未关注自测试妊娠测试，且具体地，未关注在非常早期阶段检测妊娠。
[0020] 发明概述
[0021] 在一个第一方面，本发明提供一种用于检测人女性受试者的妊娠的测试设备，该测试设备包括：
[0022] 用于测量来自该受试者的一种样品中的hCG的绝对或相对量一个测定装置；
[0023] 用于测量来自该受试者的一种样品中的FSH的绝对或相对量的一个测定装置；
[0026] 在此背景下，存在于一种样品中的一种分析物的量可以在绝对意义上(例如，就每单位体积的数值而言)或在相对意义上(例如，通过参考一个预定阈值)测定。具体地说，“一种或多种孕酮代谢物的相对量”并非旨在意指将一种样品中的不同孕酮代谢物的浓度彼此进行比较，而是可以将一种或多种这类分析物的浓度与一个预定阈值进行比较。这些测定装置将被适配和配置成测量它们的对应分析物，但是如下文所解释，一个测定装置可以被适配和配置成测量两种或更多种不同分析物的量。
[0027] 作为解释，在受孕后，进一步排卵周期是不必要的，因为女性已经怀孕。因此，在受孕后，卵泡生成(folliculargenesis)通过FSH产生的遏制而受到抑制。因此，在一个怀孕的女性中，将预期观察到升高的hCG水平和低FSH水平。因此，FSH的测量可以用于帮助解释稍微升高的hCG水平的检测的显著性，尤其是在怀疑这可能是由于一种非妊娠相关来源的情况下。
[0028] 作为进一步解释，在妊娠的前10-12周过程中，由黄体产生的孕酮支持子宫内膜，从而允许妊娠继续。孕酮水平在月经周期的黄体期的部分升高，但是，如果未发生妊娠(即，如果受试者月经来潮)，该水平将回落到基线水平。然而，如果发生妊娠，孕酮(以及它的尿代谢物)的水平将保持升高并且将在妊娠中继续上升，这样使得孕酮(以及它的尿代谢物)可以用作hCG的一种辅助物来作为妊娠的一种附加确认。
[0029] 测试设备将优选地进一步包括用于解释测定结果以便确定妊娠测试的结局的装置，并且优选地包括用于显示该测试的结局的一个显示装置。
[0030] 在一个第二方面，本发明提供一种检测人女性受试者的妊娠的方法，该方法包括以下步骤：使来自该受试者的一种样品与根据上述定义的第一方面的一种测试设备相接触。如上所述，样品优选地是一种尿样品。
[0031] 本发明的优选特征将在下文进一步详细地描述。应当清楚的是，除非上下文另外指示，否则当这些优选特征关于第一方面的测试设备进行描述时，它们将同样适用于第二方面的方法(反之亦然)。
[0032] 测试设备可以包括一种基于微流体的测定，该测定具有一个或多个制成的毛细通道(典型地具有限定的孔)，一种液体样品可以沿着该一个或多个制成的毛细通道流动；但更优选的测试设备包括一种侧流测定。测试设备可以包括一种微流体测定和一种侧流测定两者。在一个实施例中，测试设备将包括三个侧流测定，其中每一测定针对三种分析物(即，hCG；FSH；以及一种孕酮代谢物)中的每种的对应一个。
[0033] 在一些实施例中，可能希望具有针对一种具体分析物的多于一种测定。例如，一种测定可能是一个微流体测定并且另一种测定可能是一个侧流测定。可替代地，针对该分析物的两种测定可能是微流体测定或者可能是侧流测定。在针对一种分析物的两种测定均是侧流测定的情况下，它们可能在一个单个侧流测试条带上或在各自的侧流测试条带上。
[0034] 例如，hCG水平在早期妊娠过程中呈指数地增加，并且因此来自一名怀孕受试者的尿样品中的hCG的浓度可能显著变化，这取决于受试者已经怀孕了多长时间。因此可能希望提供对于hCG来说是一种相对高灵敏度测定的一种测定以及对于hCG来说是一种相对低灵敏度测定的一种测定，这样使得可以在一个延伸的浓度范围内测定样品中的hCG的浓度。(作为解释，高水平的分析物可能引起被称为钩状效应的复杂化。这可能导致由于有限的测定范围所致的高灵敏度测定的不准确度，并且因此提供具有降低的灵敏度的一种测定可以是有益的，从而允许在非常高的分析物水平下进行准确测量)。
[0035] 通常，孕酮不以可检测的量存在于尿中。相反，它被代谢并且各种孕酮代谢物在尿中排泄。本发明的测定因此适于测量尿中的一种或多种孕酮代谢物。孕酮代谢物可以被分成4组：孕二醇、孕烯醇酮(pregnanolone)、孕二酮、以及含有比孕二醇极性更高的化合物的一个最后组。在理论上，来自这四个组中的任何一个的一种或多种代谢物可以适合用于本发明中的测量。优选的实例包括孕烯醇酮(3α-羟基-5β-孕-20-酮)和孕二醇(5β-孕-3α-20α-二醇)。后者化合物对于测试来说是特别优选的，因为它是通常以最高浓度存在于尿中的孕酮代谢物(库克(Cooke)，I.D.1976，孕酮及其代谢物(Progesterone and its metabolites).于：洛兰(Lorraine)，J.A.和贝尔(Bell)，E.T.(编辑)“激素测定以及它们的应用(Hormone Assays and their Application)”第447-508页中)。对于本领域的技术人员将清楚的是，除非上下文另外指示，否则提及例如孕二醇和孕烯醇酮涵盖它们的通常存在的衍生物。具体地说，孕酮代谢物通常作为葡糖苷酸或偶尔作为硫酸盐存在于尿中。因此在此提及例如孕二醇具体地涵盖孕二醇-3-葡糖苷酸(“P-3-G”)，有时还被称为PdG。此外，除非上下文另外指示，否则在此提及“孕酮”或“孕酮测定”旨在分别具体地涵盖孕酮代谢物和用于孕酮代谢物的测定。
[0036] 应当理解，孕酮的各种代谢物之间的结构同源性且因此抗原相似性的程度可以非常高。因此，在一种基于免疫学的测定中，以一个第一结合亲和力结合一种特定孕酮代谢物的一种抗体可以一个第二结合亲和力结合一种不同的孕酮代谢物，该第二结合亲和力可能不显著低于该第一结合亲和力，这样使得该抗体可以在一定程度上交叉反应。可替代地，可以采用一种高特异性抗体，该抗体对于一种特定孕酮代谢物具有比对于存在于人尿中的其他孕酮代谢物高得多(例如，至少10倍或更高)的结合亲和力。因此，针对“一种孕酮代谢物”的一种测定可以频繁地检测到多种不同的孕酮代谢物。针对不同孕酮代谢物的任何试剂的交叉反应性的程度对本发明来说不是关键的，但本领域的技术人员应当理解，这一点连同其他特征可能需要反映在试剂的选择和选择的一个适当的“阈值”的选择中，如下文所解释。
[0037] 类似地，在人中存在FSH的几种变体(例如，片段，如分离的β链)和不同的同种型(参见沃尔顿W.J.(Walton W.J.)等人，临床内分泌与代谢杂志(J Clin Endocrinol Metab.)，86，3675-85，2001；达尔K.D.(Dahl， K.D.)和斯托内M.P.(Stone M.P.)男性学杂志(J Andrology)，13，11，1992；以及贝兹格J.U.(Baenziger， J.U.)和格林E.D(Green E.D)生物化学与生物物理学报(Biochem.et Biophys.Acta)，947，287-306，1988)(例如具有不同程度的糖基化)，并且一种基于免疫学的测定可以利用相对特异性地结合FSH的一种单一变体、片段或同种型的一种抗体，或可以利用一种更低特异性的抗体，该抗体以可接受的高亲和力结合几种不同的人FSH变体。再次，这可能对试剂的选择和/或在测定中选定的一个阈值的选择具有影响，但对于本发明的操作来说通常不是关键的。类似的评论适用于hCG以及其变体。
[0038] 概括地说，本发明的基础概念是实现一种非常高灵敏度的hCG测定可以用于检测非常早期的妊娠，并且通过FSH和孕酮代谢物的附加测量，可以将测试的特异性维持在一个可接受的高水平下(即避免由于检测到来自非妊娠相关来源的hCG所致的大量假阳性结果)而无需了解受试者的年龄。该测定设备尤其适合作为一个简单的PoC或更具体地自测试设备，而无需针对其使用的任何医学或技术培训。具体地说，该测定设备优选地可在单次使用之后丢弃。此外，该设备令人希望地是一种简单的基于侧流或微流体的设备，其中一旦已使该设备与足够体积的尿样品相接触，就可以自动地进行各种测定，而无需任何进一步使用者干预。进一步优选的是，该设备是一种数字设备，即读取测定的结局且将该结局显示给使用者。
[0039] 具体地说，本发明的测定设备优选地是一种自测试或家用测试设备。在优选的实施例中，该测定设备具有≥99％的准确度，即使在预期的月经期当天之前使用。更特别的，本发明的测定设备可以实现≥99％的准确度，即使早在预期的月经期当天之前2天使用，优选地即使早在预期的月经期当天之前3天使用，优选地即使早在预期的月经期当天之前4天使用，并且优选地即使早在预期的月经期当天之前5天使用且更优选地即使早在预期的月经期当天之前6天使用(例如，如参考LH峰值或LH激增所计算)。
[0040] 针对hCG的测试可能指示阳性(怀孕)结果(即，尿hCG高于一个预定阈值的那些样品)，这些结果可以通过FSH和孕酮代谢物测定的结果来确认(或否定)。因此，例如，正好高于预定阈值的一个hCG水平(伴有升高的FSH水平和较低的孕酮代谢物水平)指示受试者未怀孕(并且暗示升高的hCG水平具有一个非妊娠相关的来源)。
[0041] 以这种方式，本发明提供一种妊娠测试，该妊娠测试能够以高灵敏度(即检测99％或更多的怀孕受试者)、以高特异性(即1％或更低的假阳性率)检测妊娠，并且此外即使在这些受试者包括围绝经期和绝经后女性时也能够实现这些结果；且甚至更出人意料地，在妊娠的非常早期阶段的单个时间点(天)(即，甚至在预期的月经期当天之前)且无需任何其他外部信息(例如像受试者的年龄)也能够实现这些结果。
[0042] 本发明的另一个优点是，它能够避免假阴性结果，这些假阴性结果可以在定点照护基于hCG的妊娠测试设备的情况下在受试者具有非常高的hCGβ核心片段水平时发生。该问题已在本领域中认识到并且例如由格隆诺维斯基(Gronowski)等人描述(2009临床化学(Clinical Chemistry)55，1389-1394)。这是因为由过量β核心片段的抑制作用引起的hCG的人为低信号将通过FSH和孕酮代谢物的测定结果进行补偿，该FSH和孕酮代谢物将不受过量β核心片段影响。
[0043] 有利地，一种单一尿样品将用来提供用于由本发明的测定设备/方法进行的(至少)三种分析物测定中的每种的测试样品。适宜地，所有三种分析物测定将基本上同时进行，优选地使用施加到测定设备上的一种单一尿样品。这可以方便地通过使用(尤其)以下描述的实施例来实现。
[0044] 出于本发明的目的，当使用源自同一排尿事件的尿样品进行这三个分析物测试时，这些测试将“基本上同时地”进行，并且这些测定的结果在彼此10分钟的一段时期内、优选在彼此5分钟内、更优选在彼此3分钟内、且最优选在彼此60秒内读取。令人希望地，在基本上相同的时间(即彼此60秒内)由使用者将一种尿样品施加到测试设备的一个样品接触部分上来开始所有三种分析物测试。
[0045] 在一个优选的实施例中，本发明的不同方面具有以下特征中的一个或多个(令人希望地全部)：
[0046] (i)99％或更高的灵敏度；
[0047] (ii)99％或更高的特异性；
[0048] (iii)即使测试当天在妊娠早期(即在预期的月经期当天之前，如在此所定义)也能够实现(i)和(ii)；
[0049] (iv)即使当在一个单一时间点(即在单一天)进行一次测试/使用一次测定设备时也能够实现(i)和(ii)；
[0050] (v)测定设备/方法不需要任何外部信息(例如女性的年龄或受试者的任何病史，如hCG、FSH或孕酮的先前测量)；以及
[0051] (vi)即使当受试者包括围绝经期和/或绝经后女性(如在此所定义)时也能够实现(i)和(ii)。
[0052] 出于本说明书的目的，妊娠“早期”意指在预期的月经期当天之前，如通过参考在处于或接近排卵时间的女性中检测的黄体生成激素的峰值水平[“LH峰值”]所计算。作为解释，预期的月经期当天通常被认为是在LH峰值之后15天。
[0053] 本发明人已经计算，使用本发明的设备和方法，即使在围绝经期和绝经后女性中，应该也有可能以99％或更大的灵敏度和99％或更大的特异性从在一个单一时间点的一个测定建立真实妊娠状态。
[0054] 预期的月经期当天可以通过参考某些时间点来计算。具体地说，预期的月经期当天可以通过参考LH激增当天(即在一个周期中首次检测到LH水平的明显显著增加的当天)来计算，该事件通常在LH峰值之前约12-24小时发生。预期的月经期当天还可以通过将通常的周期长度(天)添加至末次月经期的日期来计算。计算预期月经期的其他方式包括将28天添加至末次月经期的日期。
[0055] 一般来说，分析物测定的结果将在一个特定时间已经过去之后确定(通常但不一定，通过参考该样品与该测定设备的一个取样区域相接触的时间来确定)。确定分析物测定结果的时间可以被称为tE。测定结果读取设备可以包括某种集成定时装置以便确定达到tE的时间。定时装置可以通过使样品与测定设备相接触(例如通过允许电流流动的液体样品)来自动地致动，或者可以通过使用者(例如按压一个开关等)或通过任何其他方便的方式触发。测定反应可以适宜地在tE达到平衡，但这不是必需的。对于同时进行的所有分析物测定，tE可以在同一时间达到，或者tE可以是针对不同分析物不同的。
[0056] 在一些实施例中，如果一个分析物测定信号在tE时仍然低于一个上限阈值，则该测定的结果是阴性的(在其中正是所感兴趣的分析物的存在导致信号的形成的那些形式中)。测定的终点可能不一定是在反应完成时。确实，终点tE通常将被认为已在反应完成之前达到。
[0057] tE终点可以方便地参考特定时间点(即tE可被认为在测定开始之后特定量的时间发生，例如在读取器激活和/或一个测定棒插入到读取器中和/或将样品施加到测试棒上之后的一个特定时间间隔)由读取器确定。出于说明的目的，tE将典型地在测定开始之后1与10分钟之间、优选1与5分钟之间发生。
[0058] 令人希望地，测定结果读取器将被编程以便在获得一个中度信号的情况下重复测试测量。在一个简单的实施例中，在tE重复测量。然而，优选地在终点之前重复测量一次或多次。最优选地，读取器设备被编程为以规律时间间隔(例如1秒或5秒时间间隔)重复测量直到信号超过上限阈值或直到达到tE，无论哪个首先发生。
[0059] 将一个时钟或其他定时设备包括在测定结果读取器中是令人希望的，这样使得该读取器能够在预定时间点自动地进行测量而无需进一步使用者输入。
[0060] 因此，例如，读取器可以被编程为在一个初始时间点t。进行测量，并且如果需要在其后的任何所希望的时间间隔进行重复测量，直到信号超过上限阈值或达到tE，如上所述。
[0061] 此外，一个时钟或其他定时设备有助于读取设备测定信号积累的速率。如果信号的量的测量是在两个或更多个时间点(具有一个已知的时间分离)进行的，则可以容易地计算信号积累的速率。
[0062] 应当注意，信号积累的速率或量可以在绝对意义上抑或作为相对值(例如相较于一个对照或其他比较值，任选地从一个基本上同时发生的反应获得)进行测量。
[0063] 具体地说，在一些实施例中，如果一个或多个分析物测定读数都远高于或低于(在适当时)一个特定相关的阈值水平，则测定结果读取器可以在达到tE之前确定测定结果(即怀孕或未怀孕)。以这种方式进行的测定结果的“早期”确定在EP 1484613中进行了描述。在本实例中，例如，如果一种样品中的FSH的量高于一个预定上限阈值(在从未观察到妊娠的一个水平下)，则FSH测定信号将非常快速地形成，并且这可以允许测定结果读取器(或一个人观察者)在tE之前将测定的结局确定为一个“未怀孕”结果，可能无需等待分析hCG和/或孕酮代谢物测定的结果。类似地，如果该样品中的孕酮代谢物的水平非常低(例如低于1μg/ml)，一个强孕酮代谢物测定信号将在达到孕酮代谢物测定的tE之前非常迅速地形成，从而允许测定结果早期确定为“未怀孕”，再次可能无需读取hCG测定和/或FSH测定。
[0064] “早期”确定测定结果可以在达到三种分析物(即hCG、孕酮代谢物和FSH)中的任一种的tE之前进行；或者可以在达到这三种分析物中的两种的任何组合(即hCG和孕酮；hCG和FSH；或孕酮代谢物和FSH)的tE之前；或者在达到这三种分析物中的仅一种的tE之前(即，在这三种分析物中的其他两种的tE或在该tE之后)进行。
[0065] 类似地，对于所有三种分析物测定或这三种分析物测定中的任一种或对于这三种分析物测定中的两种的任何组合，可能存在下限阈值、中间阈值和上限阈值。
[0066] 测试设备将包括至少一个流动路径，优选地至少两个流动路径，并且典型地三个或甚至四个流动路径。
[0067] 出于本发明的目的，术语“流动路径”是指能够将一种液体从一个第一位置传送到一个第二位置并且可以是例如一个毛细通道、一个微流体路径或一种多孔载体如一种侧流多孔载体的一种衬底。多孔载体可以包括一种或多种多孔载体材料，该一种或多种多孔载体材料可以按一种直线或堆叠安排重叠或是流体地连接的。这些多孔载体材料可以是相同的或不同的。测试设备的各种测定可以被设置在分离的衬底上，或者它们可以被设置一个共同的衬底上，这样使得沿着一种测定的一个流动路径传送的液体不能越过到一个不同测定的流动路径上。例如，第一测定和第二测定可以被设置在同一多孔载体上，这样使得第一流动路径和第二流动路径是彼此分离的。这可以例如通过以下方式来实现：激光切割多孔载体的多个部分以便使该多孔载体为无孔的，从而分离第一测定和第二测定。可替代地，可以沿着一个条带施加一种无孔阻挡材料以便在同一多孔载体上提供两个或更多个(典型地基本上平行的)的流动路径。在其他实施例中，一个单个流动路径可以适应针对两种或甚至三种不同分析物的测试。例如，一个单个流动路径可以包括用于测试hCG的试剂，并且还可以包括用于测试一种孕酮代谢物的试剂。可替代地，一个单个流动路径可以包括用于测试hCG和FSH的试剂；或者一个单个流动路径可以包括用于测试FSH和一种孕酮代谢物的试剂。具体地说，一个流动路径可以包括两个检测区，一个用于每种分析物，其中一种标记试剂可能倾向于以与样品中的对应分析物的浓度总体上成比例(成正比或成反比)的方式积聚。
[0068] 测试设备中的一个或多个流动路径可以包括一种侧流多孔载体。可以用作一种多孔载体的适合的材料包括硝酸纤维素、乙酸纤维、纤维素或纤维素衍生物、聚酯、聚酰胺、聚烯烃或玻璃纤维。多孔载体可以包括硝酸纤维素。这具有以下优点：一种结合试剂可以在无需事先化学处理的情况下牢固地固定。例如，如果多孔固相材料包括纸，则一种抗体的固定可以通过使用例如CNBr、羰基二咪唑或三氟乙烷磺酰氯化学偶联来进行。
[0069] 本发明的测定设备/方法典型地利用一种或多种结合试剂。典型地，hCG测定利用结合hCG的一种结合试剂，FSH测定利用结合FSH的一种结合试剂，并且孕酮代谢物测定利用结合一种孕酮代谢物的又另一种结合试剂。具体地说，该测定可以包括使用一种标记结合试剂。如在其他地方所解释，可以使用结合hCG和FSH两者的一种标记结合试剂，因为这两种分子具有一些共同的结构。
[0070] 出于本发明的目的，术语“结合试剂”是指一个结合对的一个成员，即两种不同的分子，其中这些分子中的一种通过化学和/或物理方式与第二分子结合。这两种分子在以下意义上相关：它们的彼此结合是这样的，使得它们能够区别它们的结合配偶体与具有类似特征的其他测定成分。结合对的成员被称为配体和受体(抗配体)、结合对成员和结合对配偶体等。一种分子也可以是多种分子的一种聚集体的一个结合对成员；例如针对一种第二抗体与其相应抗原的一种免疫复合物的一种抗体可以被认为是该免疫复合物的一个结合对成员。
[0071] 除了抗原和抗体结合对成员，其他结合对包括(作为实例如但不限于)，生物素和抗生物素蛋白、碳水化合物和凝集素、互补的核苷酸序列、互补的肽序列、效应分子和受体分子、酶辅因子和酶、酶抑制剂和酶、一个肽序列和对于该序列或整个蛋白质具有特异性的一种抗体、聚合的酸和碱、染料和蛋白质结合剂、肽和特异性蛋白质结合剂(例如，核糖核酸酶、S-肽和核糖核酸酶S-蛋白)等。此外，特异性结合对可以包括为原始特异性结合成员的类似物的成员。
[0072] 当在一种标记结合试剂的背景下使用时，“标记”是指能够产生通过视觉或仪器方式可检测的信号的任何物质。适合于在本发明中使用的各种标记包括通过化学抑或物理方式产生信号的标记，如光学可检测的标记。这类标记包括酶和底物、色原体、催化剂、荧光化合物、化学发光化合物、电活性物质、染料分子、放射性标记、以及颗粒标记。颗粒标记可以包括磁性或带电荷的标记，这些标记可以通过磁或电化学方式进行检测。标记可以被共价附接至结合试剂。具体地说，标记可以来自光学可检测的一种标记。优选的光学可检测标记包括胶态金属颗粒标记和带有染料的颗粒，如下文。
[0073] 标记可以包括一种胶态金属颗粒，如金、银、铂、银增强的金溶胶、碳溶胶或碳纳米颗粒；胶态类金属或非金属颗粒，如碲和硒；或染色颗粒或着色颗粒，如并入一种染料或一种染料溶胶的一种聚合物颗粒。染料可以具有任何适合的颜色，例如蓝色。染料可以是荧光的，或包括一个量子点。适合的荧光材料是本领域的技术人员所熟知的。染料溶胶可以从可商购的疏水性染料如Foron Blue SRP(山德士(Sandoz))和Resolin Blue BBLS(拜耳(Bayer))制备。适合的聚合物标记可以选自一系列合成聚合物，如聚苯乙烯、聚乙烯基甲苯、聚苯乙烯-丙烯酸、以及聚丙烯醛。所使用的单体通常是非水溶性的，并且在水性表面活性剂中乳化以使得形成单体胶束，然后通过将引发剂添加至乳剂来诱导这些单体胶束聚合。产生基本上球形的聚合物颗粒。这类聚合物颗粒的一个理想大小范围是从约0.05μm至约0.5μm。根据一个示例性实施例，标记是一种金胶体，该金胶体具有在0.02μm至0.25μm范围内的优选颗粒平均直径。
[0074] 干燥的结合试剂可以被设置在一种微流体设备的流动路径中或在一种侧流型设备中在包括一个检测区的一种多孔载体材料的上游提供的一种多孔载体材料上。上游多孔载体材料可以是大孔的。大孔载体材料应该是低或非蛋白质结合的，或者应该是可通过试剂如BSA或PVA容易地阻断的以便使非特异性结合减至最少并且在大孔载体已变得被液体样品润湿之后有助于标记试剂的自由移动。大孔载体材料可以用一种表面活性剂或溶剂预先处理(如果需要)以便使该大孔载体材料更加亲水并且促进液体样品的快速吸收。此外，一种或多种糖(例如蔗糖、海藻糖)可以用于稳定和帮助动员标记试剂。这些可以方便地作为一种溶液的一部分施加到流动路径和/或多孔载体材料上，其中标记试剂被施加到该多孔载体上。用于一种大孔载体的适合材料包括塑料材料，如聚乙烯和聚丙烯；或其他材料，如纸或玻璃纤维。在标记的结合试剂是用一种可检测的颗粒标记的情况下，大孔载体可以具有比颗粒标记的最大粒度大至少十倍的孔径。更大的孔径得到标记试剂的更好释放。
[0075] 测试设备将适宜地包括三个或更多个流动路径：针对每种分析物测定的一个对应流动路径。然而，有可能两种或更多种分析物测定可以共享一个共同的流动路径(可能除了一个任选的共同样品施加区外，如下所述)。流动路径将典型地包括一种水性液体(如一种尿样品)可以沿其输送的一个毛细或其他微流体流动通道，或者一个或多个多孔构件。
[0076] 在一个实施例中，测试设备包括三个单独的侧流测定条带，每个用于每种分析物测定。在另一个实施例中，测试设备可以包括两个侧流测定条带；这些条带中的一个用于进行针对这些分析物中的一种(例如hCG)的一个测定并且另一个条带用于进行针对另两种分析物中的每种的一个对应测定。还可以设想一个实施例，其中一个流动路径或侧流测试条带用于测试所有三种分析物。
[0077] 具体地说，测试设备可以包括一个样品施加区。该样品施加区是多孔(典型地吸水)材料的一个区，一种水性样品如尿可以被施加到该区上。样品施加区可以是一个共同的区。即，施加到共同样品施加区上的一种液体样品可以被输送至两个或更多个不同的测定流动路径。
[0078] 典型地，通过使用者直接排尿到样品施加区上来将样品施加到该样品施加区上。
[0079] 在一个优选的实施例中，测定设备包括一个壳体，该壳体容纳这些测定的功能性部件中的大多数或全部以及这些测定试剂。该壳体是由一种防水合成塑料材料方便地形成的并且优选地是基本上是不透明的。可以将一种遮光剂添加至塑料材料中以便实现所希望的不透明度水平。具体地说，用于形成壳体的适合的合成塑料材料包括，聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚苯乙烯的共聚物、聚烯烃、聚丙烯、聚乙烯、以及丙烯腈。壳体可能令人希望地以两个或多个部分形成，这些部分与容纳在该壳体的组装部分之内或之间的测定设备部件的其余部分的大部分(或全部)连结在一起。壳体的这些部分可以通过常规的紧固方式连结且紧固，如卡扣配合作用或者通过塑料焊接等。
[0080] 在一个优选的实施例中，测定设备包括一个壳体，(典型地具有上述特征)，并且其中一个样品施加部分或区延伸超出该壳体，以便有助于一种尿样品施加到该样品施加部分或区上。延伸超出壳体的样品施加部分或区可以在使用前由一个可移除的盖帽覆盖。该盖帽还可以优选地由一种合成塑料材料形成，该材料可以是不透明的或透明的或半透明的。典型地，一旦样品已被施加到样品施加区上，盖帽就被放回原处。
[0081] 一个吸收“槽”可以设置在测定流动路径的一个远端下游端处。可以设置一个共同的槽，或者一个槽可以设置在每种测定的远端。吸收槽可以优选地包括一种高吸收性材料，例如像CF7沃特曼(Whatman)纸，并且应当提供足够的吸收能力以便从检测区的附近除去任何未结合的标记。作为这种槽的一种替代方案，可能足够的是具有延伸超出检测区的一定长度的多孔固相材料。提供一种高吸收性槽的一个优点是，它从这些对应测定的流动路径除去或基本上除去过量标记结合试剂。这具有使在对应区附近的未结合的标记结合试剂的程度最小化的作用，并且因此使测定流动路径能够用于可以具有不同量的标记结合试剂的设备中。
[0082] 测试设备将方便地包括本领域的技术人员已知的和常规自测试或家用测试妊娠测试设备中普遍的其他特征，包括(但不限于)，样品足量指示器(例如，如在PCT/EP2013/061178中所描述)、一个“防洪”衬垫(例如，如在WO2012/069610中所披露)、使用样品流作为一种测定对照(例如，如在EP1,484,611；US 6,194,222中所披露)；阳性或阴性结果的“早期”确定(例如，如在EP 1,484,613；US 5,679,584中所披露)；电子设备的自动“唤醒”(例如，在由样品润湿设备时自动致动，这形成一个电路)；以及使用一个数字测定进度表(例如，如在欧洲共同体设计(European Community Design)登记号1367304中)或一个“颜色变化芯”等，该数字测定进度表或“颜色变化芯”在已将样品施加到测试设备上时向使用者给出一个视觉指示和/或给出测定已经开始的一个视觉指示(例如WO 2003/058245)。测试设备将有利地在防水包装中呈现给消费者，该包装任选地进一步包括一种干燥剂，如一小袋硅胶。
[0083] 这些测定将方便地支撑在某种支持体或背衬层上以便提供机械强度和一个适合的刚性程度。该一种或多种测定加支持体可以方便地被称为且提供为一个测试棒。所有三种测定可以在一个单个棒上，或在两个、三个或甚至四个(即，对于一种分析物多于一个棒)测试棒上。该一个或多个测试棒可以被适配且配置成由使用者插入到测试设备中，或该一个或多个测试棒可以更优选地形成由消费者购买的测试设备的一个整体部分，其中该一个或多个测试棒预先插入或负载在测试设备中。
[0084] 这些测定的结果可以通过一个外部测定结果读取装置读取，或者由一个使用者直接读取，但更优选地测试设备将包括一个整体测定结果读取器以用于读取一种测定的结果。测定结果读取器优选地读取所有三种分析物测定的结果。测定结果读取器将有利地包括一个电子部件，特别是一个数字电子部件，如一个微处理器。典型地(但不一定)，这些测定通过光学装置进行读取，即测量由一个检测区反射和/或透射的光的量，其中一种光学标记试剂倾向于以与样品中的分析物的浓度成比例(成正比或成反比)的方式积聚。可替代地，这些测定可以通过例如，磁性或电化学测量来读取。明显地，读取测定的方式可以取决于用于标记一种或多种测定试剂的一种或多种标记的特性。
[0085] 一个外部测定结果读取装置可以包括一个专用结果读取设备(例如，与在EP 1066530中所描述的类似)。可替代地，该外部测定结果读取器可以是“非专用的”，如一个移动电话或其他便携式电子设备(例如，一个平板计算机)，优选地设置有一个照相机，其中通过测量由一个可见标记产生的信号强度来读取测定结果。
[0086] 测定结果读取器(无论是外部的还是形成一个成整体的测定设备/测定结果读取器的一部分)可以读取并解释测定结果，或者可以将测定结果数据传输至用于解释测定数据的一个远程定位设备。测定数据可以被实时传输至远程定位设备。数据可以经由一种因特网连接传输，或者可以被存储在一个存储器设备(如一个“闪存”驱动器等)上，该数据被物理地传送至远程设备，或者该数据可以通过无线通信装置(例如，蓝牙、近场通信[NFC]等)进行传输。
[0087] 一个微处理器可以控制光学读取或其他测定读取部件的操作，并且将方便地编程有或者能够访问针对每种分析物的相关测定信号阈值，将实际测定信号值与预定阈值进行比较并且解释测定结果以便确定妊娠测试的结局。
[0088] 测定结果读取器因此包括用于读取这些测定的结果的必要部件。测试设备还将有利地包括一个测定结果显示器，以用于将妊娠测试的结局显示给使用者。典型地，显示器将包括一个LCD，但其他类型的显示器也是可能的(例如，使用“电子墨水”)。在测定设备(或者更确切地说，其一个部件)需要一个电源来操作的那些实施例中，则测定设备将优选地设置有一个集成电源，如一个电池。非常小且廉价的电池是可容易地商购的。该设备还可以设置有一个开关以便连接该集成电源且激活该设备。
[0089] 在替代实施例中，这些测定的结果可以由使用者以从常规“自测试”妊娠测试已知的方式直接读取，例如，由使用者检查上覆这些测定检测区的一个或多个窗口以便确定在一个或多个(或所有)检测区处一个可检测信号的存在或不存在。每个检测区可以设置有在一个不透明壳体中的一个单独窗口以便允许使用者检查该检测区。可替代地，一个大窗口可以容纳两个或更多个(或所有)检测区。典型地，在这类使用者读取设备中，使用者将直接检查侧流或微流体测定的检测区。在其他形式中，使用者可以通过参考一个比色图表或指示器来确定结果。方便地，测试设备将与用于读取测定结果的说明书或指导一起提供(如果该设备不为使用者解释测定结果)。例如，可以向使用者提供一个印刷的比色图表以便有助于这类直接读取视觉测试的解释。
[0090] 一种组合的妊娠测试棒/具有显示器的测定结果读取器设备可以被称为一个“数字妊娠测试”，并且这类数字测试设备是可商购的且可以被适配为具有本披露的益处以便提供根据本发明的一种测试设备。
[0091] 微处理器将令人希望地进行编程以便使测定结果读取部件读取一种或多种测定的结果；解释这些测定结果；并且将结论显示给使用者。
[0092] 用于读取这些测定的结果的部件将优选地包括至少一个光源和至少一个光检测器。该至少一个光源优选地是一个发光二极管(LED)。该至少一个光检测器优选地是一个光电二极管或一个光电晶体管。光源照明测定上的一个检测区，该区倾向于在进行测定的过程中以取决于施加到测定上的样品中所感兴趣的分析物的浓度的方式积聚一种标记物质。该标记物质可以按与分析物的浓度正相关的方式积聚(即，分析物的浓度越高，积聚在检测区中的标记的量越大)。典型地，采用一种夹心测定形式，该夹心测定形式是本领域的技术人员所熟知的。可替代地，标记物质的积聚可以与分析物的浓度负相关(即，分析物的浓度越高，积聚在检测区中的标记的量越小)。这种负相关是一种竞争或抑制型测定的典型特征，该类型的测定通常在所感兴趣的分析物是一种半抗原和/或太小时采用以便适应两种不同抗体的同时结合(例如，如在孕酮代谢物的情况下)。
[0093] FSH和hCG两者均是异二聚体分子，包括α和β亚基。FSH和hCG的α亚基是基本上相同的，这样使得针对该α亚基的抗体可以结合FSH和hCG两者。用于这两种分子的一种测定因此可以潜在利用一种共同试剂，该试剂可以是例如一种可移动的直接标记的(即，光学可检测的)抗体。对应检测区可以包括一种固定的捕获抗体，该抗体对β亚基(其在FSH与hCG之间不同)具有特异性。显然，这涉及一种夹心式免疫学测定，但是其他测定形式也是熟知的并且可以替代使用。
[0094] 有可能，如果一种样品含有高水平的hCG(例如，因为该样品是由妊娠相对超前的受试者提供的)，则对共同α亚基抗体具有特异性的一种抗体可能被高水平的hCG“吞没”，从而有效地减少了可供用于结合FSH的抗体的量且可能由此引起存在于样品中的FSH的量的低估。在实践中，这或许不太可能引起任何问题，因为这类高水平的hCG将几乎总是(＞99.9％)由于怀孕，这将由测试设备正确地检测到并解释，而不管任何FSH测定结果。还有可能使用针对hCG测定的一种双重β亚基特异性抗体对以及针对FSH测定的一种双重β特异性抗体对。这种形式将否定在高分析物水平下观察到的上述作用。
[0095] 鉴于使成本最小化的需要，(尤其是在设备在单次使用后被丢弃的那些实施例中)，优选的是使用一个单个光检测器来检测从至少两种、优选三种不同测定的检测区发出的光。应当理解，光并非真正来源于检测区－－它来源于光源——但光由这些检测区反射和/或透射穿过这些检测区(视情况而定)，这样使得它看起来是从这些检测区发出的。典型地但不一定，每个检测区由一个对应光源(如一个LED)照明。
[0096] 一个单个光源(如一个LED)可以用来照明至少两种不同测定并且如果可能的话三种不同测定的检测区。然而，也有可能提供多个LED。例如，一个LED可以被提供用于照明每个对应检测区。在提供多个LED的情况下，这些可以产生相同颜色的照明，或者可以产生不同波长的照明。可以存在实施例，其中LED(或其他光源)的数目等于或甚至超过检测区的数目。可替代地，可以使用不同的几何形状，其中一个LED照明两个检测区，这样使得LED的数目少于检测区的数目。
[0097] 该设备可以典型地利用一个参考区－－该参考区是用于参考从一个检测区获得的一个读数的一个微流体或侧流测定流动路径的一部分。使用一个参考区是本领域的技术人员所熟知的。具体地说，该设备可以利用一个“共享”参考区(如在EP 2,031,376中所披露)，其中一个参考区用作两个或更多个检测区的参考，该两个或更多个检测区中的至少一个位于一个不同的流动路径上。
[0098] 微处理器或计算机化的控制可以引起一个或多个光源顺序地照明一个或多个检测区，以便区分由对应检测区反射的光和/或透射穿过对应检测区的光。在一个实施例中，光源在不同时间发射不同波长的光，并且一个或多个光检测器区分不同的波长。此外或可替代地，光学挡板(固定的或可调整的)可以用于控制由一个特定光源照明的区域。可以使用的光学安排的种类的更多细节在例如EP 1,484,601、US 6,055,060和US 5,889,585中进行了披露。为避免疑问，如在此所用的术语“光”不旨在仅指在电磁谱的对一个人观察者可见的那一部分中的辐射，并且还涵盖例如紫外线和红外线辐射。然而，操作光谱的可见部分中的部件和对光谱的可见部分的灵敏度可以是优选的。
[0099] 微处理器或计算机化控制装置将优选地包括多个存储的分析物阈值(测定结果与这些阈值相比较)以便允许测定结果读取设备解释这些结果，并且向使用者显示一个适当的结论(例如怀孕或未怀孕)。微处理器或控制装置将有利地用一种算法进行编程以便测量测试结果，将这些测试结果与预定阈值进行比较并且显示结论。
[0100] 在一个实施例中，微处理器或控制装置将首先测定hCG测定结果，并且将该测定结果与一个预定的下限hCG阈值进行比较。如果所测定的hCG测定结果低于该预定下限hCG阈值，则能够立即确定受试者未怀孕，并且通过显示器向使用者指示这一结果(例如，通过形成词语未怀孕(NOTPREGNANT)，或用任何语言的其等效物；或通过一个直观符号，例如一个减号或一个零)。
[0101] 然而，如果所测量的hCG测定结果高于该预定下限阈值，则测定结果读取器可以继续测量FSH测定的结果。如果FSH测定结果指示样品中的FSH浓度大于它的预定阈值，则能够确定受试者未怀孕并且如上所述将该结果显示给使用者。
[0102] 然而，如果样品中所测量的FSH水平低于它的对应预定阈值，则测定结果读取器随后可以测量孕酮代谢物测定(在该实例中，针对P3G的一种测定)的结果。如果该测定结果指示样品中的P3G的浓度低于其对应预定阈值，则能够确定受试者未怀孕。如果样品中的P3G浓度高于预定阈值，则受试者怀孕，并且测定结果读取器将经由显示器将适当的结论显示给使用者。
[0103] 阈值可以作为绝对分析物浓度(即，就每单位体积的质量或IU而言)和/或作为吸光度值或以任何其他方便的方式存储在本发明的设备中。
[0104] 在一个实施例中，该设备可以设置有针对hCG/FSH/孕酮分析物中的一种、两种或所有三种的一个上限阈值和一个下限阈值。例如，在一个实施例中，该设备可以具有一个上限hCG阈值和一个下限hCG阈值。如果所测量的hCG浓度超过上限hCG阈值，则该设备可以宣布受试者怀孕，而无需分析FSH/孕酮测定的结果。如果显而易见，hCG分析物测定结果将超过上限阈值，则这种宣布可以由该装设备“早期”(例如，在测定已达到平衡之前)进行。在其他实施例中，“怀孕”结果仍然通过检查FSH和孕酮测定的结果来确认。
[0105] 如果hCG测定结果低于下限hCG阈值，则该设备宣布受试者未怀孕(有或无通过FSH和孕酮测定结果确认)。如果hCG测定结果高于下限hCG阈值，但不超过上限hCG阈值，则该设备将需要FSH和孕酮测定结果以便得到妊娠或非妊娠的确定。该设备可以顺序地(例如，首先一种分析物，随后另一种分析物，按任何顺序)或并行地检查那些FSH和孕酮测定结果。
[0106] 具体地说，该设备可以具有针对FSH和/或孕酮测定的一个上限或下限阈值。可能是，在一个具体实例中选择多个阈值中的哪一个来施加将取决于在其他两种测定中检测到的分析物的绝对或相对浓度，这样使得可以采用一种“加权”或“补偿”方案。例如，被确定为在上限hCG阈值与下限hCG阈值之间的中间范围的较高端处的一个hCG浓度可以通过引起设备在得到一个怀孕/未怀孕确定中施加一个下限孕酮阈值来“补偿”一个相对低的孕酮浓度。相反地，低FSH和/或高孕酮例如可以补偿样品中相对低的hCG浓度。
[0107] 测定的测量和/或测定结果的解释可以包括一个或多个数据处理步骤，其中使测定数据经受一个或多个计算或其他类型的处理。这种处理将方便地通过一个数字电子设备(如一个微处理器等)进行，该数字电子设备将典型地形成一个外部或一个整体测定结果读取器的一部分。例如，数据处理可以包括比率的计算。具体地说，处理步骤可以包括计算FSH：孕酮代谢物的比率，或反之亦然。该比率可以基于相对信号强度或者基于从所测量的信号强度或其他适合的相关参数导出的对应分析物的浓度的计算。更特别地，一个“边界”hCG信号强度或导出的hCG浓度可以通过计算FSH：孕酮代谢物(或反之亦然)比率来进行验证或检查。
[0108] 此外，除了hCG、FSH和孕酮外，该设备还可以测定其他分析物。这些其他分析物可以包括，具体地说，激素，例如像LH、hPL(人胎盘催乳素)和/或松弛素和/或雌激素或其代谢物。这种激素的另一个实例是促甲状腺激素(TSH)。TSH与hCG、FSH(和LH)有关，在于所有这些激素包含一个α亚基，该α亚基非常密切地类似于其他激素的α亚基。TSH还包含TSH所特有的一个β亚基。先前已测量了尿中的TSH水平(参见例如吉田(Yoshida)等人，1988日本内分泌杂志(Endocrinol.Jpn.)35，733-739)，但是浓度相当低。这样一种或多种另外分析物的浓度也可以由设备在得到一个怀孕/未怀孕确定中考虑在内，可能地通过影响用于hCG/FSH/孕酮分析物中的一者或多者的可施加阈值的选择。可以测量该一种或多种另外分析物与hCG、FSH和孕酮中的一者或多者的比率。具体地说，可以测量TSH与hCG(或反之亦然)的比率。其他分析物的测量可以尤其适用于以下描述的本发明的改进。
[0109] 在以上描述的基本原理的改进中，可能希望不仅向使用者指示受试者是否怀孕，而且(如果怀孕)指示就自受孕以来经过的时间量而言的妊娠程度(即胎龄)。这可以通过显示几天或更优选地几周来指示。方便地，可以显示三种时间间隔中的一种：1-2周；2-3周；以及＞3周。为了便于这一点，测试设备可以有利地设置有多个不同的hCG浓度阈值(或者，更准确地说，hCG测定测试结果阈值)，这些阈值对应于自受孕以来的对应周数。实现这一点的方法在WO 2009/147437中进行了披露。再次，为了便于该实施例，可能希望测试设备能够测试一个延伸范围内的hCG浓度(例如，通过包括针对hCG的一个相对高灵敏度测试和一个相对低灵敏度测试两者)，并且实现这一点的适合的方法在WO 2008/122796中进行了描述。可以通过测量除hCG之外的其他分析物(例如hPL)(参见WO2012/055355)和/或一种或多种孕酮代谢物的浓度来促进妊娠的胎龄的估计。
[0110] 在一些实施例中，将令人希望的是测试设备还包括某种控制功能。这是在自测试设备中常见的，以便提供测试已经正确运行的一些指示。
[0111] 典型地，一种控制功能将包括使用一个控制区，在该控制区中一种标记试剂将倾向于在足够的样品已被施加到测试设备的样品施加区上的情况下积聚。常规地，该标记试剂将是一种标记抗体或其他试剂，该标记抗体或试剂以干燥形式可释放地沉积在一个测试条带的一个上游或近端部分处且在通过样品再水合之后动员，并且由固定在控制区中的一种特异性捕获剂捕获。该控制指示是否已施加足够的样品到测试设备上，并且指示测试试剂是否在合理范围内保留了其结合性质，且指示标记试剂是否已被动员至足够的程度。
[0113] 图1是根据本发明的一种设备的一个实施例的分解视图；
[0114] 图2-5示出用于在根据本发明的一种设备的不同实施例中使用的测定测试条带的不同形式；并且
[0115] 图6示意性地示出在根据本发明的一种设备中使用的一种算法/逻辑树的一个实施例。
[0116] 实例
[0117] 实例1
[0118] 在初始实验中，测量了一个围绝经期和绝经后(PP，年龄41-90)组中的119名非怀孕志愿者中的尿hCG、尿FSH和尿P3G(其中总计50个样品具有[hCG]≥2.5mIU/ml)，并且测量了来自成功怀孕的从第-7天EMP(预期错过的月经期)至第+3天EMP的72名怀孕志愿者(年龄21-40)的尿hCG、尿FSH和尿P3G。对可获得的样品进行了测试，从而产生总计589个早期妊娠样品(“EPS”)，其中434个具有[hCG]≥2.5mIU/ml，如通过一个 测定所
测量。
测量。
[0119] 对这些结果的分析显示，使用至少2.5mIU/ml的尿hCG阈值水平与10mIU/ml或更低的FSH阈值和至少4μg/ml的P3G阈值两者的组合来定义妊娠，真实妊娠可以被称为100％阳性预测(在非怀孕组中无假阳性)。用于定义妊娠的这三种分析物的阈值水平(如在本研究中所建立)可能在一个更大数据集情况下变化，但这些结果显示通过使用hCG与FSH和P3G的组合，可以将妊娠来源的hCG与垂体来源的围绝经期和绝经后hCG区别开来。
[0120] 使用这些阈值的结果呈现于以下表1中。
[0121]
[0122]
[0123] 表1中的结果是非常显著的。这些结果显示，在A组中，当与针对FSH和一种孕酮代谢物(P3G)的测试组合时，一个非常灵敏的hCG测试(检测到低至2.5mIU/ml的hCG)在统计上显著的女性样品中得到零假阳性率，同时在B组中成功地鉴别所有怀孕受试者。
[0124] 实例2
[0125] 在本发明的一个实施例中，一种妊娠测试设备将包括以一种两条带硝酸纤维素(NC)形式构造的一种侧流免疫测定，其中一个hCG夹心测定设置到一个第一条带上。一个FSH夹心测定和一个竞争性P3G测定将被设置在具有两个不同捕获区的一个第二单独条带上。两个条带将经由接触一种多孔介质的一个共同样品施加区同时运行，该多孔介质将接触两个硝酸纤维素条带。该设备将响应于所感兴趣的分析物的量数字地测量这些NC捕获区上的信号响应(结合的标记)。一种内置算法将取决于分析物的水平在屏幕上向终端使用者给出一个数字显示的响应(怀孕/未怀孕和/或胎龄)。
[0126] 一种可能的算法的一个实例在图6中示意性地示出。应当指出的是图6中呈现的算法仅是一个实施例，并且可以使用许多其他实施例。还应指出的是图6中呈现的绝对分析物浓度仅是说明性的，并且可以采用其他分析物阈值。实例3
[0127] 参考图1，其示出一个实施例的分解视图，根据本申请的一种设备包括由合成塑料材料形成的一个两部分壳体。该壳体具有一个顶部部分2和一个底部部分4。该壳体是由一种不透明的塑料材料如聚碳酸酯或聚丙烯形成的。如果需要，可以包括一种遮光剂。
[0128] 一个电源在该壳体内，如小纽扣电池6，该纽扣电池将电力递送至安装在一个印刷电路板组件(PCBA)8上的这些部件。这些部件包括，具体地说，一个或多个LED和光电二极管、以及一个液晶显示器10。安装在PCBA 8上的这些部件包括对于读取在该壳体内安装的两个侧流测定条带上进行的测定的结果来说必要的那些。这些条带中的一个12是用于进行一个hCG测定，并且另一个条带14是用于进行一个FSH测定和一个孕二醇-3-葡糖苷酸(P3G)测定两者。
[0129] 该壳体的顶部部分2和底部部分4配合以便形成围绕上述部件的一个基本上不透湿气的密封件。一种尿样品通过一个取样芯16到达侧流测定条带12、14。取样芯16的一个末端区域与测定条带12、14中的每个的一个邻近末端区域处于液体流动联通(这样使得该取样芯充当一个共同样品施加区)。
[0130] 取样芯16的一个相反末端区域突出穿过且超出该壳体的一端中的一个孔口，从而允许样品被施加到该取样芯上。该取样芯的突出部分通过一个可移除的盖帽18保护，该盖帽被成形且定尺寸以便与该壳体的一端配合以便由此接收且与该端形成一种适贴的紧密配合接合。
[0131] 在所示的实施例中，为了将一种尿样品施加到取样芯16上，使用者移除盖帽18且直接撒尿到该芯上。该芯是由吸收性材料制成的并且因此该样品被吸收到该芯中且沿着该芯通过被动方式流动且到测定条带12、14中。使用者随后任选地将盖帽18放回原处。为了有助于样品流动到这些测定条带中且沿着这些测定条带流动，这些测定条带在其远端(即离取样芯16更远的端)与高吸收性材料的一个“槽”衬垫20处于液体流动联通。
[0132] 这些侧流测定以常规方式进行，从而产生一种标记结合试剂以一种分析物浓度依赖性方式(成比例地或成反比地，视情况而定)积聚在测试条带12、14上的一个或多个检测区处，该标记结合试剂通过安装在PCBA 8上的测定读取部件检测且读取。一个微处理器、ASIC等分析且解释这些读数并且将测定结果显示在LCD 10上，该测定结果经由在该壳体的顶端部分2中的一个适合位置处形成的一个窗口或孔口21对使用者可见。
[0133] 重要的是，在使用之前，将侧流测试条带12、14保持干燥，并且出于该原因，该PCBA设置有用于一种干燥剂22的一个容器，该干燥剂吸收来自该壳体的内部的湿气。
[0134] 实例4
[0135] 参考图2，该实例涉及一个实施例，在该实施例中两个不同侧流测定条带与根据本发明的一种设备组合使用或形成该设备的一个整体部分。
[0136] 在图2中，这些条带中的一个30用于进行针对hCG的一个高灵敏度测定。另一个条带32用于进行针对FSH和针对P3G的一个测定。尿样品从一个共同取样构件(为清楚起见省略)进入测定条带30、32两者并且在由箭头34指示的方向上沿着这些条带流动。在其近端(即，由一种尿样品首先遇到的那端)，两个条带均具有一个玻璃纤维缀合物衬垫36，并且朝向远端，两个条带与一个高吸收性“槽”38处于液体流动联通，该槽促进样品沿着这些测定条带流动。两个条带还包括在“槽”38之外的一对对准孔40。这些有助于条带在该设备内的正确定位，具体地说，这样使得这些测定条带能够由该设备的测定读取部件正确地读取。注意这些对对准孔40不是对称的，因此这些条带不能不慎地彼此替换。
[0137] 参考条带30，缀合物衬垫36负载有一种可移动的抗αhCG亚基单克隆抗体，该抗体缀合至一种金溶胶(42)。该缀合物在该缀合物衬垫上干燥并且在通过样品润湿之后释放。
[0138] 检测区44包括对hCG的β亚基具有特异性的一种固定的单克隆抗体。因此，存在于样品中的任何hCG结合标记的缀合物并且以本领域的技术人员将熟悉的一种方式与检测区处的“捕获”抗hCGβ抗体形成一种夹心。
[0139] 由虚线限定的区46指示一个参考区，测定结果读取装置使用该参考区来校准测定读数。同一参考区46可以用于校准hCG测定读数以及还有针对条带32上的FSH和P3G测定所获得的读数两者(即，可以使用一个共同参考区)。
[0140] 参考条带32，玻璃纤维缀合物衬垫具有两种不同的缀合物48：一种是缀合至一种抗FSHα亚基单克隆抗体的金溶胶，并且另一种是缀合至一种抗P3G单克隆抗体的金溶胶。(在该实例中，抗hCGα和抗FSHα是相同的抗体克隆)。
[0141] 一种固定的抗FSHβ亚基单克隆抗体用作FSH检测区50处的捕获抗体，同时一种固定的P3G-卵白蛋白缀合物用作P3G检测区52处的捕获分子。
[0142] 每个测定条带30、32的主体是由硝酸纤维素形成的，如由参考数字54所指示。
[0143] 虽然在该实施例中，P3G检测区52被示出在FSH检测区50的下游，但可以设想着两个检测区的相对位置可以反转。
[0144] 另一种变型是一种形式，其中hCG和P3G测定在一个条带上进行并且一个单独条带用于FSH测定。
[0145] 实例4A
[0146] 可以设想另一种测定形式。该测定形式与在图2中描绘且在实例4中描述的形式是基本上相同的，除了在该变型中，沉积在缀合物衬垫36上的可移动缀合物中的一种是用P3G-卵白蛋白缀合物(而不是抗P3G mAb)标记的一种金溶胶，并且在P3G检测区52处的固定的捕获分子是固定的抗P3G mAb。在该安排中，样品中的P3G与该标记的缀合物竞争结合在检测区52处的捕获抗体。
[0147] 实例5
[0148] 参考图3(其中相同的部件共享在图2中使用的参考数字)，在该实施例中，所有3种测定是使用一个单个测定条带进行的。玻璃纤维缀合物衬垫36负载有一种共同抗hCGα和抗FSHα金溶胶缀合物以及一种抗P3G mAb金溶胶缀合物(分别42、48)。
[0149] hCG检测区44包括一种固定的抗hCG βmAb。FSH检测区50包括一种固定的抗FSHβmAb，并且P3G检测区52包括一种固定的P3G-卵白蛋白缀合物。
[0150] 如之前，可以改变这些检测区的相对位置。此外，如在实例4A中，可移动的P3G试剂可以是用一种P3G-卵白蛋白缀合物标记的一种金溶胶，并且P3G检测区52可以包括一种固定的抗P3G抗体。
[0151] 可以容易地设想又另一种变型，其中可移动的缀合物可以包含缀合至针对hCG的一种β亚基特异性单克隆抗体的一种第一金溶胶和缀合至针对FSH的一种β亚基特异性单克隆抗体的一种第二金溶胶。这些对应的检测区包括固定的抗hCGα抗体和抗FSHα抗体。另一种潜在变型是一种抗hCGβ亚基抗体既用于可移动的缀合物中又用作固定的捕获抗体，条件是这两种抗体结合不同的表位并且因此不会干扰或彼此竞争结合hCG。也可以按类似的方式测定FSH，抗FSHβ亚基特异性抗体既用于可移动的缀合物上又用作固定的捕获抗体。
[0152] 实例6
[0153] 在图4中示意性地示出的该实例中，提供一个单独的侧流测定条带用于每种分析物。hCG在条带100上测定，FSH在条带102上测定，并且P3G在条带104上测定。相同的部件共享与图2中相同的参考数字。
[0154] 将样品经由一个共同样品施加构件(为清楚起见被省略)施加到所有三个测定条带上。一个共同“槽”衬垫38朝向每个测定条带的远端处于液体流动接触。与图2相反，在该实施例中，每个测定条带100、102、104具有其自己的参考区46。此外，每个测定条带具有一个程序控制区60，该控制区指示在这些结合试剂保留它们的结合特性的意义上，测定是否一直正确地进行。
[0155] 实例7
[0156] 又另一个实施例在图5中示出。该实施例也利用三个测定条带。然而，这三个测定条带中的两个是用于测量hCG水平，因此这些条带中的一个110是一个高灵敏度hCG测定(用于检测低水平的hCG)，这些条带中的一个112是一个低灵敏度hCG测定(用于检测高水平的hCG)，并且第三个条带114是用于测定FSH和P3G两者。相同的部件由与图2共同的参考数字指示。
[0157] 为了降低条带112上的hCG测定的灵敏度，缀合物衬垫36不仅负载(42’)有缀合至一种抗hCGαmAb的一种可移动的金溶胶，而且负载有一种游离的(未标记的)抗hCG βmAb，该抗hCG βmAb结合存在于样品中的hCG并且因此与位于检测区44处的固定的抗hCG β捕获抗体竞争。因此，在样品中的hCG分析物的高水平下，测定系统不被吞没。在该实例中，未标记的抗hCG β单克隆抗体充当一种“清除剂”。该清除剂不需要是一种抗体，但可以是结合hCG并且防止hCG(间接地)沉积检测区处的标记试剂的任何未标记的试剂。该清除剂可以例如被固定在流动路径上/中，或可以(以可移动的形式)与标记的缀合物混合。
[0158] 使用高灵敏度hCG测定和低灵敏度hCG测定两者允许该设备在延伸的浓度范围内准确地测量hCG，并且这种安排适用于该设备能够显示一种结果的那些实施例中，该结果不仅显示受试者怀孕，而且能够向使用者指示该受试者已经怀孕多久的定量估计(例如，就自受孕以来的周数而言)。
[0159] 虽然以上实例说明了不同侧流测定形式的用途，但将清楚的是一种类似的测定安排可以利用一种基于微流体的测定，或基于侧流和微流体两者的一种测定。
[0160] 实例8
[0161] 该实例描述在产生适用于在根据本发明的一种设备中使用的侧流测定条带(如图4中所示)中的步骤。
[0162] 测定试剂的产生：
[0163] A.金溶胶标记抗体的制备：
[0164] 1.P3G测定：
[0165] 方法：
[0166] 将硼酸盐缓冲液(20ml，20mM，pH 8.5)添加至80nm金溶胶溶液(20ml，A550nm＝OD 6.85，BBI国际公司(BBI Intemational))以便得到最终溶液，该最终溶液含有在10mM硼酸盐缓冲液中的在OD 3.425下的金溶胶。
[0167] 将抗P3G抗体(克隆#5806：2，艾利尔圣地亚哥公司(Alere San Diego)，40ml，160μg/ml于10mM硼酸盐缓冲液中)的溶液与该金溶胶溶液在一个磁力搅拌器上在室温下快速地混合30分钟。
[0168] 在30分钟混合之后，将610μl的65.6mg/ml β酪蛋白溶液添加至该反应混合物并且继续在室温下混合另外30分钟。
[0169] 反应混合物中的β酪蛋白的最终浓度是0.5mg/ml。
[0170] 将溶胶溶液倒入离心管(50ml)中且将溶液离心(4,000g，10分钟，15℃)。
[0171] 将澄清的上清液倾析且将沉淀的溶胶涡旋且超声处理。
[0172] 将溶胶溶液转移至埃彭道夫管并且离心(4,000g，7分钟，15℃)。
[0173] 将上清液小心地去除并且将沉淀的溶胶涡旋且超声处理，将洗涤缓冲液添加(1ml，0.5mg/ml β酪蛋白于10mM硼酸盐缓冲液中)至重新悬浮的溶胶。在重新悬浮之后，将溶液离心(4,000g，7分钟，15℃)。
[0174] 将上清液小心地去除并且将沉淀的溶胶涡旋且超声处理，将洗涤缓冲液添加(1ml，0.5mg/ml β酪蛋白于10mM硼酸盐缓冲液中)至重新悬浮的溶胶。在重新悬浮之后，将溶液离心(4,000g，7分钟，15℃)。
[0175] 将上清液去除并且将沉淀的溶胶涡旋且超声处理，将该溶胶重新悬浮于小体积的储存缓冲液(0.5mg/ml BSA于PBS+叠氮化物[PBSA]中)中并且将最终体积调整至2ml。虽然初始实验在储存缓冲液中使用了0.5mg/ml BSA，但据发现BSA的存在干扰P3G测定。因此，随后0.5mg/ml酪蛋白替代BSA用于储存缓冲液中。在P3G测定部件可能与其他测定的部件相接触(例如，其中一个P3G测定和一个hCG和/或FSH测定在一个单个测定流动路径或侧流条带上进行)的本发明的实施例中，则将需要这些其他测定也避免使用BSA，以便防止P3G测定受影响。
[0176] 溶胶制剂的最终OD通过在550nm下测量吸光度来测定。
[0177] 2.hCG测定和FSH测定：
[0178] 方法：
[0179] 将硼酸盐缓冲液(20ml，20mM，pH 8.5)添加至80nm金溶胶溶液(20ml，A550nm＝OD 6.85，BBI国际公司)以便得到最终溶液，该最终溶液含有在10mM硼酸盐缓冲液中的在OD
3.425下的金溶胶。
3.425下的金溶胶。
[0180] 将抗α-hCG抗体(克隆#3299：4，艾利尔圣地亚哥公司，40ml，20μg/ml于10mM硼酸盐缓冲液中)的溶液与该金溶胶溶液在一个磁力搅拌器上在室温下快速地混合30分钟。
[0181] 在30分钟混合之后，将610μl的65.6mg/ml β酪蛋白溶液添加至该反应混合物并且继续在室温下混合另外30分钟。反应混合物中的β酪蛋白的最终浓度是0.5mg/ml。
[0182] 将溶胶溶液倒入离心管(50ml)中且将溶液离心(4,000g，10分钟，15℃)。
[0183] 将上清液倾析且将沉淀的溶胶涡旋且超声处理。
[0184] 将溶胶溶液转移至埃彭道夫管并且离心(4,000g，7分钟，15℃)。
[0185] 将上清液小心地去除并且将沉淀的溶胶涡旋且超声处理，将洗涤缓冲液添加(1ml，0.5mg/mlβ酪蛋白于10mM硼酸盐缓冲液中)至重新悬浮的溶胶。在重新悬浮之后，将溶液离心(4,000g，7分钟，15℃)。
[0186] 将上清液小心地去除并且将沉淀的溶胶涡旋且超声处理，将洗涤缓冲液添加(1ml，0.5mg/mlβ酪蛋白于10mM硼酸盐缓冲液中)至重新悬浮的溶胶。在重新悬浮之后，将溶液离心(4,000g，7分钟，15℃)。
[0187] 将上清液去除并且将沉淀的溶胶涡旋且超声处理，将该溶胶重新悬浮于小体积的储存缓冲液(0.5mg/ml BSA于PBSA中)中并且将最终体积调整至2ml。
[0188] 溶胶制剂的最终OD通过在550nm下测量吸光度来测定。
[0189] B.待固定到硝酸纤维素上的试剂的制备：
[0190] 虽然以下实例描述卵白蛋白的P3G缀合物的制备和用途，但可以设想，可以采用P3G的其他蛋白质和合成聚合物缀合物。P3G的蛋白质缀合物包括但不限于牛血清白蛋白、免疫球蛋白G、明胶、以及β酪蛋白。聚合物载体的代表性实例包括聚烯丙基胺、聚乙烯醇、聚赖氨酸、以及聚乙烯亚胺。
[0191] P3G测定：
[0192] 卵白蛋白的P3G缀合物(10∶1摩尔比的P3G与卵白蛋白)的制备
[0193] 方法
[0194] NHS活化的P3G酯(10mg P3G，10％DMSO比例)的制备
[0195] 水溶性碳二亚胺、EDC用于制备NHS活化的P3G酯。用相较于P3G(2.0136×10-5摩尔P3G)摩尔过量的EDC(1.1x)和NHS(1.5x)进行反应。
[0196] 用于进行该反应的总体积是600μl。
[0197] 通过将48mg的EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐，赛默科技公司(Thermo Scientific)，目录号77149，分子量＝191.7)溶解于3.39ml的DMSO(99.7％特干，阿克罗斯公司(Acros)，目录号3484400)中来制备EDC的14.153mg/ml溶液。
[0198] 通过将29mg的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺，西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich)，目录号130672，分子量＝115.09)溶解于2.5ml的DMSO中来制备NHS的11.6mg/ml溶液。
[0199] 在一个玻璃小瓶中称取10mg的P3G(5β-孕烷-3α，20α-二醇葡糖苷酸，P3G，西格玛公司(Sigma)，目录号P3635，分子量＝496.63)，并且添加以上制备的300μl的EDC溶液和300μl的NHS溶液以便得到含有相较于P3G1.1x更多的EDC和1.5x更多的NHS。将反应混合物在室温下在黑暗中搅拌4小时并且使反应在20℃下继续进行过夜(大约16小时)。
[0200] 将干燥DMSO(400μl)添加至上述溶液以便溶液的总体积补足至1000μl。
[0201] 假定P3G 100％转化成P3G-NHS酯，则将存在1000μl中的2.0136×10-5摩尔的活化酯。因此，100μl的该溶液将含有2.0136×10-6摩尔。
[0202] P3G-卵白蛋白缀合物的制备
[0203] 使用100μl的活性酯(2.0136×10-6摩尔)。
[0204] 通过将92.4mg卵白蛋白(西格玛公司，目录号A5503＞98％，分子量＝44，000)溶解于20.858ml PBS中来制备卵白蛋白于PBS缓冲液(PBS片剂，西格玛公司，目录号P4417)中的4.43mg/ml溶液，并且2ml的该溶液用于10倍制备。
[0205] 就在添加NHS活化的P3G溶液(100μl)之前将DMSO(100μl)添加至卵白蛋白溶液。因此，反应混合物中的DMSO的最终浓度被维持在10％(v/v)。
[0206] 将反应溶液在室温下搅拌3.5小时。在3.5小时反应之后，通过将1M Tris缓冲液(pH 7.4)(100μl)添加至该溶液来淬灭反应。
[0207] 随后将P3G-卵白蛋白离心，并且将澄清的上清液除去且在用PBSA预先平衡的一个PD-10柱(通用电气医疗集团(GE Healthcare)，目录号17-0851-01)上纯化。
[0208] -将缀合物溶液(2.5ml)施加至该平衡柱的顶部，并且使所有溶液流入凝胶床。
[0209] -随后将洗脱缓冲液(PBSA，3ml)施加至该柱并且将流出物收集到一个清洁的玻璃容器中。该流出物含有纯化的P3G-卵白蛋白缀合物。
[0210] 0.7的消光系数(A2800.1％)用于测定蛋白质浓度。随后将P3G-卵白蛋白缀合物浓缩至3mg/ml以用于固定在硝酸纤维素上。
[0211] 1.hCG测定：
[0212] 将抗β-hCG抗体(克隆#3468：2，艾利尔圣地亚哥公司)在固定到硝酸纤维素上之前在PBSA中稀释至3mg/ml。
[0213] 2.FSH测定：
[0214] 将抗β-FSH抗体(克隆#5948：2，艾利尔圣地亚哥公司)在固定到硝酸纤维素上之前在PBSA中稀释至3mg/ml。
[0215] C.用于定位和固定特异性结合物质的制剂和装置：
[0216] 方法
[0217] 1.P3G测定：
[0218] 1.1制备一种PVA封闭缓冲液(pH 9)(Tris碱20mM(西格玛公司)、PVA 1％w/v(PVA 80％水解的，9-10K MW(西格玛公司)、吐温200.05％w/v(西格玛公司)、以及NaCl 150mM(西格玛公司))。
[0219] 1.2通过将2％w/v的蔗糖(西格玛公司)添加至47.5ml的PVA封闭缓冲液、添加2.5ml的乙醇(西格玛公司)来制备一种PVA封闭溶液。
[0220] 1.3使用一个压力切割器将白色背衬的硝酸纤维素(沃特曼)片切割成35cm*40mm带并且在该带的一端冲孔至6mm的孔距(可以使用许多不同的孔距尺寸，然而对于在此呈现的这些实例，使用一个6mm孔距)。
[0221] 1.4设置一个biodot标绘器来以3mg/ml的浓度和1μl/cm的标绘速率将P3G-卵白蛋白缀合物标绘在硝酸纤维素带上的所希望的位置处。
[0223] 2.hCG测定：
[0224] 按照章节C.1，包括步骤1.1至1.3。
[0225] 设置一个biodot标绘器来以3mg/ml的浓度和1μl/cm的标绘速率将3468抗体标绘在硝酸纤维素带上的所希望的位置处。
[0226] 在标绘之后，将这些带在55℃下干燥且使用PVA封闭溶液封闭，并且随后在65℃下干燥且在密封的铝箔袋中与干燥剂一起在室温下储存过夜。
[0227] 3.FSH测定：
[0228] 按照章节C.1，包括步骤1.1至1.3。
[0229] 设置一个biodot标绘器来以3mg/ml的浓度和1μl/cm的标绘速率将5948抗体标绘在硝酸纤维素带上的所希望的位置处。
[0230] 在标绘之后，将这些带在55℃下干燥且使用PVA封闭溶液封闭，并且随后在65℃下干燥且在密封的铝箔袋中与干燥剂一起在室温下储存过夜。
[0231] D.用于固定金溶胶标记的结合试剂(用于在实施例1的实例中使用)的制剂和装置：
[0232] 方法
[0233] 1.P3G测定：
[0234] 将在章节A.1中制备的5806涂覆的溶胶缀合物在一个离心机中旋转沉降且除去上清液。将所得到的沉淀涡旋且超声处理，并且随后将沉淀在一种金溶胶缀合物喷涂缓冲液中复原成所希望OD的金(在高实例中OD80)。在以下实例中使用的金溶胶缀合物喷涂缓冲液(pH 7.6)含有10mM Tris(西格玛公司)、5％w/v蔗糖(西格玛公司)、以及0.5％(w/v)BSA*(普罗利恩特生物制剂公司(Proliant Biologicals)，SKU#68700)。然而，还可以使用的喷涂缓冲液的其他实例可以具有在稀释剂溶液中的另外物质并且还可以具有更高或更低水平的在以上实例中列出的成分。(随后改变为0.5％w/v酪蛋白)。
[0235] 将G041密理博玻璃纤维 切割成26mm*35cm且负载到一个Biodot喷涂钻机上。
[0236] 设置该biodot喷涂钻机以便用5806涂覆的溶胶缀合物在玻璃纤维上的所希望的位置处浸渍/灌注该玻璃纤维。在该实例中，以每次喷涂1.65μl/cm的标绘速率用OD80缀合物的4个顺次对玻璃纤维进行喷涂。
[0237] 将金溶胶灌注的玻璃纤维在55℃下干燥且在密封的铝箔袋中与干燥剂一起在室温下储存过夜。
[0238] 2.hCG测定：
[0239] 以与上文相同的方式制备用于hCG测定的金溶胶浸渍/灌注的玻璃纤维带，除了在此使用3299涂覆的金溶胶(参见章节A.2)并且溶胶缀合物的OD是OD111。在在此举例的实例中，以1.65μl/cm的标绘速率用金缀合物的2个顺次对玻璃纤维进行喷涂。
[0240] 3.FSH测定：
[0241] 对于FSH测定，使用OD62金缀合物的2个顺次以1.65μl/cm的给料速率将3299涂覆的金溶胶(参见章节A.2)喷涂在玻璃纤维上。将给料的带干燥且以与上述实例相同的方式储存。
[0242] E.测定条带构造/产生：单条带测定芯片构建体的实例(每个芯片/条带一种测定)[0243] 方法
[0244] 1.P3G测定：
[0246] 将背衬层压板(Ferrisgate公司)放置到运动卡片压板上，并且将具有固定的P3G-卵白蛋白(章节C.1)的一个封闭的硝酸纤维素带在一个预定位置处固定到该背衬层压板上。
[0247] 将5806溶胶缀合物灌注的玻璃纤维(章节D.1)的一个带在硝酸纤维素带之上以2mm重叠固定到该背衬层压板上。
[0248] 一个辊垫确保该芯片的所有部件与该背衬层压板的良好接触。
[0249] 然后使用一个Biodot切割器将这些带切割成6mm单独芯片，并且与干燥剂一起储存在铝箔袋中直到准备好使用。
[0250] 2.hCG测定：
[0251] 以与P3G测定相同的方式组装hCG测定部件，除了使用用3468固定的硝酸纤维素带(章节C.2)和用3299金溶胶缀合物浸渍的玻璃纤维带(章节D.2)。
[0252] 然后使用一个Biodot切割器将这些带切割成6mm单独芯片，并且与干燥剂一起储存在铝箔袋中直到准备好使用。
[0253] 3.FSH测定：
[0254] 以与P3G测定相同的方式组装FSH测定部件，除了使用用5948固定的硝酸纤维素带(章节C.3)和用3299金溶胶缀合物浸渍的玻璃纤维带(章节D.3)。
[0255] 然后使用一个Biodot切割器将这些带切割成6mm单独芯片，并且与干燥剂一起储存在铝箔袋中直到准备好使用。
[0256] 实例9
[0257] 在该实例中，提供关于在根据本发明的一种设备中使用的说明性算法的进一步信息。
[0258] 相较于常规自用妊娠测试，本发明的测定设备提供在预期的月经期当天之前的更高妊娠检测率，同时保留对妊娠的特异性。本发明的测定设备通过以下方式实现这一点：不仅具有针对hCG的更高灵敏度，而且测量FSH和一种或多种孕酮代谢物，以便在非常低的hCG浓度下保留对妊娠的特异性；升高的hCG水平可以在一些绝经后和围绝经期女性中观察到，这在一种过度灵敏的hCG测试的情况下可能产生假阳性结果。FSH充当妊娠的排除，因为高水平与围绝经期和绝经后状态相关，同时孕酮代谢物(例如P3G)充当妊娠的划入，因为在妊娠中观察到升高的水平。
[0259] 在该概念的一个简单实施例中，该设备可能如以下表2中所概述运行。在该实例中，所测定的孕酮代谢物是P3G：
[0260] 表2
[0261]
[0262] *设想其中冲突的FSH和孕酮代谢物测定结果出现的实例的可能性将是非常低的。该设备将典型地被编程为在这类情况下宣布一个“未怀孕”结果，和/或使用者可以被通知在随后的阶段再次测试。
[0264] 可以通过使用一个更广泛的算法可能地实现改进的性能：FSH的水平或孕酮代谢物水平的重要性(权重)可以取决于hCG的水平和/或用于测试FSH和所使用的孕酮代谢物的阈值可以取决于hCG的水平。在一种更复杂的情况下，FSH阈值可以取决于hCG浓度并且孕酮代谢物阈值可以取决于FSH水平(反之亦然)。
[0265] 该算法在图6中示意性地表示。参照该图，该算法/逻辑树涉及本发明的包括两个侧流测试条带的测试设备的一个实施例。一个第一条带用于进行针对hCG的一个测定并且一个第二条带用于进行针对FSH的一个测定和针对P3G的一个测定。
[0266] 在该逻辑树中，测定结果读取器首先检查hCG测定结果，并且将该测定信号与对应于2.5mIU/ml的hCG浓度的一个预定信号值进行比较。如果该测定结果小于2.5mIU/ml阈值，则读取器可以立即指示测试受试者“未怀孕”(在图中遵循“＜”符号)。[然而，总体测定的结局(即，“怀孕”或“未怀孕”)可能不一定被指示给使用者，直到已确定所有三种分析物测定的结果]。可替代地，如果尿样品中测定的hCG浓度等于或大于2.5mIU/ml阈值，则读取器继续检查FSH测定结果(在第二测定条带上的第一测试线或检测区)。因为高于2.5mIU/ml的hCG浓度可能是由于非妊娠相关的来源，所以该测定的总体结局的一个“早期”确定可能不太可能仅基于hCG测定结果。
[0267] FSH测定具有10mIU/ml的阈值。如果样品中测定的FSH浓度等于或大于10mIU/ml阈值，则测定设备/读取器宣布测试的结果为“未怀孕”。相反，如果样品中的FSH浓度高于10mIU/ml阈值，则测定设备/读取器将继续检查P3G测定结果。
[0268] P3G测定结果是从第二侧流测定条带上的第二测试线或检测区读取的。如果P3G测定指示样品中的P3G浓度小于4μg/ml，则受试者被宣布为“怀孕”。
[0269] 对于本领域的技术人员将清楚的是，针对一个具体实施例选择的精确信号值或阈值浓度将至少部分地取决于所采用的这些测定的特定特征(例如，试剂、流动基质、缀合物的浓度等)，这样使得以上鉴别的阈值可能在其他实施例中略微不同，但是相对量将是总体上相同的。
[0270] 此外，该图示出顺序地检验或检查hCG、FSH和P3G测定的结果的测定设备/读取装置。将清楚的是，对应测定结果可以按任何顺序或基本上同时地检验。此外，如果这些分析物的浓度非常高于(或低于，在适当时)相关的阈值浓度，则一种或两种测定结果的“早期”确定可能能够实现总体测定结果的结局的确定(即，“怀孕”或“未怀孕”)，而无需知道所有三种分析物测定的结果。
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