一株产γ-氨基丁酸的戊糖乳杆菌及其在普洱茶生产中的
应用
技术领域
[0001] 本
发明涉及
微生物领域中的一株可以产生γ-氨基丁酸的戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)及其在普洱茶生产中的应用。
背景技术
[0002] γ-氨基丁酸(GABA)是一种天然存在的功能性氨基酸。研究表明，γ-氨基丁酸具有降低血压、改善脑功能、增强长期记忆及提高肝、肾机能等生理活性。γ-氨基丁酸广泛存在于自然界的动
植物体内，在动物体内只存在于神经组织中，是
哺乳动物中枢神经中重要的抑制性神经递质，参与多种代谢。γ-氨基丁酸是由L-谷氨酸经谷氨酸脱氢酶(GAD)脱羧而成。
[0003] 很多普洱茶中不仅含有咖啡因，而且指标远高于绿茶和乌龙茶，在“农业部茶叶检测中心”的检验中，普洱茶中的咖啡因含量竟高达4.41％(
质量/质量百分比浓度)。目前已知的各种茶叶中，普洱茶的咖啡因含量最高，但品饮普洱熟茶后，并不影响人的正常睡眠。很多学者认为，普洱茶在反复的加工过程中，影响人睡眠的主要“凶手”—咖啡因逐渐消失所致。但在对普洱茶进行化学分析后发现，这一结论是不成立的。答案就在于γ-氨基丁酸(GABA)，因为GABA最基本的生理功能就是降低神经元活性，防止神经细胞
过热，起到
镇静神经的功能，进而对咖啡
碱的受体产生颉抗作用。换句话说，就是GABA将咖啡因兴奋人体中枢神经的“作用”给抵消了。
[0004] γ-氨基丁酸(GABA)的制备方法主要有化学合成法和生物合成法两种。化学合成法多见于
专利文献的报道，成本较高，得率较低，并且在生产工艺中常使用危险
溶剂，甚至是有毒溶剂。因此，化学合成法制备的GABA不能用于食品领域，也不能被认为是一种天然的
食品添加剂。生物合成法相比较来说是一种既安全、又低成本的方法。根据最新的研究报道和专利文献的报道，乳酸菌、
酵母菌、曲霉菌等一些安全性高的微生物在GABA类食品的制备中已有应用。2009年9月27日，中国卫生部正式批准γ-氨基丁酸、初乳碱性蛋白、共轭亚油酸、共轭亚、油酸甘油酯、植物乳杆菌(菌株号ST-Ⅲ)、杜仲籽油为新资源食品。从此，对γ－氨基丁酸而言，进入了一个崭新纪元。
[0005] 乳酸菌是一种
革兰氏阳性菌，很多菌株都具有高GAD(谷氨酸脱羧酶)活性，能富集产生GABA，如Lactobacillus plantarum M-10、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus brevis hjxj-01等。作为辅助
发酵剂，戊糖乳杆菌已被广泛应用于酸奶、干酪、
冰激凌、发酵肉制品、巧克
力、豆制品等产品的生产中。由于存在合成GABA化学方法的反应条件苛刻、天然原料昂贵以及安全性差的问题，很难得到广泛应用。在微生物中，目前在多种乳酸菌、细菌、酵母菌和霉菌中均发现了GAD的存在。
[0006] 在普洱茶研究领域，前期由于缺乏从微生物专业
角度的系统研究，
益生菌的获得相对较难。随着微生物分离手段的成熟和现代生物信息学的高速发展，从传统渥堆发酵样品中分离、纯化得到益生菌株并应用于普洱茶的生产工艺中已成为可能，这对于提高普洱茶的品质和普洱茶产业的发展将发挥重要作用。
发明内容
[0007] 本发明的第一个目的是提供一株可以产生γ-氨基丁酸(GABA)的戊糖乳杆菌。
[0008] 本发明所提供的可以产生γ-氨基丁酸的戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)，命名为TMCC 70009，该菌株已于2014年01月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCCNo.8685。
[0009] TMCC 70009菌株的16S rRNA基因序列如
序列表中序列1所示，经分析鉴定为可以产生γ-氨基丁酸的戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)。
[0010] 将该菌株用ISP 2培养基在35℃下液态培养3天，测得其γ-氨基丁酸含量达1.6μg/mL。
[0011] 本发明可以产生γ-氨基丁酸的戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)TMCC70009CGMCC No.8685的形态特征及最适生长条件：
[0012] 在ISP 2培养基上于35℃
温度下培养72小时后形成乳白色菌落，表面光滑，菌落整齐，边缘无褶皱，直径约1mm；在
显微镜下观察，细胞呈长圆形，以单个或链状存在；
[0013] 在无
氧条件下也能生长，为兼性厌氧菌，生长温度在20-50℃之间，高于55℃不能生长。
[0014] 本发明可以产生γ-氨基丁酸的戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)TMCC70009CGMCC No.8685有提高普洱茶品质的作用，可应用于普洱茶的生产工艺中。
[0015] 本发 明 还提 供 了一 种 用可 以 产生γ- 氨基 丁 酸的 戊 糖乳 杆 菌(Lactobacilluspentosus)TMCC 70009 CGMCC No.8685生产普洱茶的方法，具体方法包括以下步骤；
[0016] 1)对普洱毛茶进行潮
水：将普洱毛茶加水至
含水量达到20％-50％(体积/体积百分比浓度，优选为45％)，灭菌；
[0017] 2)发酵：将处于生长指数期的戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)TMCC70009CGMCC No.8685的
种子液以2％-10％(重量/体积百分比浓度)的接种量接种到已潮水的普洱毛茶中，在20-50℃温度下经过3-4周的发酵，发酵期间每隔一周进行补水并翻堆，得到普洱熟茶。
[0018] 在上述普洱茶的生产方法中，所述步骤2)中的生长指数期是指在厌氧或兼性厌氧条件下在ISP 2液体培养基中培养16-18h；所述种子液的接种量优选为5％(重量/体积百分比浓度)；所述发酵温度优选为45℃。
[0019] 用上述方法生产的普洱熟茶茶汤具有清新花香、滋味醇和、层次丰富；经检测，γ-氨基丁酸含量为1.5-2.2％(质量/质量百分比浓度，以下同)，而在普洱毛茶中γ-氨基丁酸含量很低，为4.3mg/100g(0.0043％)。在普通普洱熟茶中γ-氨基丁酸含量一般为0.32％-0.9％，说明戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)TMCC 70009CGMCC No.8685可以产生高浓度的γ-氨基丁酸，一方面可显著缩短发酵周期，发酵周期仅为3-4周，普通方法的发酵周期一般为6-8周，这是因为在人为条件下创造了菌株最适的生长环境，微生物单一且无其它菌株竞争，酶量分泌充足。另一方面弥补了传统普洱熟茶滋味平淡、香气不明显的不足，对于提高普洱茶品质发挥了重要作用，这是因为该菌株以茶叶为底物分泌了香气物质(如
雪松烯醇、反-丁香烯、1-甲基-4-(1-甲基-亚乙烯基)-环乙烯等)，增加了特殊的香气成分；在滋味上，由于避免了杂菌的影响，口感更纯正。
[0020] 本发明自传统渥堆普洱茶发酵样品中通过传统的平板稀释涂布、初筛、复筛的分离纯化方法获得了一株可以产生γ-氨基丁酸的戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)TMCC 70009CGMCC No.8685。将该菌株用ISP 2培养基在35℃下液态培养3天，测得其γ-氨基丁酸含量达1.6μg/mL。实验证明，将该菌株应用于普洱茶的生产中，一方面可显著缩短发酵周期，发酵周期可缩短至3-4周，另一方面确实有提高普洱茶品质的作用，用该菌株发酵生产的普洱熟茶的茶汤具有清新花香、滋味醇和、层次丰富，不仅弥补了传统普洱熟茶滋味平淡、香气不明显的不足，使普洱熟茶的品质在香气、汤色、滋味上均有明显的提高，而且使γ-氨基丁酸的含量高达1.5-2.2％(质量/质量百分比浓度)，使普洱熟茶不仅具有降低血压、改善脑功能、增强长期记忆及提高肝、肾机能等作用，同时也由于γ-氨基丁酸的含量较高，避免了咖啡碱的兴奋刺激作用，利于安神睡眠。此外，随着戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)TMCC 70009CGMCC No.8685的大量繁殖，其分泌的酶量也增加，在
纤维素酶、
糖化酶的作用下，茶叶中的内含物质经氧化、分解、聚合，大分子的不溶性物质可转化为可溶性的小分子物质，更加丰富了普洱茶的滋味，其丰富的酶系也抑制了其它杂菌特别是少数有害微生物的滋生，降低了普洱茶发酵生产中的失败
风险。本发明对普洱茶新产品的开发提供了重要的应用
基础，为普洱茶产业的发展提供了新的微生物资源。
[0021] 下面结合具体
实施例对本发明做进一步详细说明。
具体实施方式
[0022] 所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。
[0023] 实施例中描述到的的各种
生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
[0024] 实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0025] 实施例1、可以产生γ-氨基丁酸的戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)TMCC70009CGMCC No.8685的分离、鉴定及保藏
[0026] 一、TMCC 70009菌株的分离及纯化
[0027] KMB分离培养基配方：蛋白胨20g，甘油10g，K2HPO41.5g，MgSO4.7H2O 1.5g，琼脂糖15g，蒸馏水1000mL，pH 5.6，121℃灭菌40min，备用；
[0028] KMB培养基可用于戊糖乳杆菌的分离及培养。
[0029] ISP 2纯化培养基配方：蛋白胨4g，
葡萄糖4g，酵母浸膏5g，琼脂糖2g，蒸馏水1000mL，pH自然(6.8-7.3)，121℃灭菌40min，备用；
[0030] ISP 2培养基可用于细菌、放线菌、酵母的纯化。
[0031] 先从传统渥堆中采集新鲜的普洱茶发酵茶样，通过KMB平板分离得到300株戊糖乳杆菌，再用ISP 2培养基纯化培养基进行纯化。分离、纯化方法包括以下步骤：
[0032] 1)将配制好的固体培养基加热融化，冷却至45℃左右，倒入无菌培养皿中，每皿约20mL，冷却后备用。
[0033] 2)取待分离的普洱茶样，
研磨粉碎，取1g，在超净台中加入到装有9mL无菌水的试0
管中，振荡制成菌悬液，浓度记为10。
[0034] 3)按十倍稀释法逐步稀释，稀释7次为止。十倍稀释法是指下一管的菌悬液浓度是上一管的十分之一。
[0035] 4)将标记为10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7浓度的菌悬液分别取500μL注入到已配制好的培养皿中，并用涂布棒均匀涂布，每个浓度三个重复，便于比较。完成后放置于20-50℃条件下培养，每24小时观察1次；
[0036] 5)培养3-7天后，挑取单菌落转接到新鲜ISP 2培养基中培养，多次划线纯化直至得到纯化菌株，命名为TMCC 70009。
[0037] 二、TMCC 70009菌株的分子生物学鉴定
[0038] TMCC 70009菌株的16S rRNA基因序列如序列表中序列1所示，经分析鉴定为可以产生γ-氨基丁酸的戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)。
[0039] 三、测定TMCC 70009菌株产生的多酚
氧化酶的酶活力
[0040] 将该菌株用ISP 2培养基在35℃下液态培养3天，测得其γ-氨基丁酸含量达1.6μg/mL，而其它戊糖乳杆菌株产生的γ-氨基丁酸含量一般仅为0.1μg/mL -1.8μg/mL。
[0041] 四、TMCC 70009菌株的形态特征及最适生长条件
[0042] 在KMB培养基上于35℃温度下培养72小时后形成乳白色菌落，表面光滑，菌落整齐，边缘无褶皱，直径约1mm；在显微镜下观察，细胞呈长圆形，以单个或链状存在；
[0043] 在无氧条件下也能生长，为兼性厌氧菌，生长温度在20-50℃之间，高于55℃不能生长。
[0044] 五、TMCC 70009菌株的保藏
[0045] 本发明可以产生γ-氨基丁酸的戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)TMCC70009菌株已于2014年01月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.8685。
[0046] 实施例2：可以产生γ-氨基丁酸的戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)TMCC70009 CGMCC No.8685在普洱茶生产中的应用
[0047] 用可以产生γ-氨基丁酸的戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)TMCC70009CGMCC No.8685生产普洱茶，具体方法包括以下步骤；
[0048] 1)对普洱毛茶进行潮水：将普洱毛茶加水至含水量达到45％(体积/体积百分比浓度，25％-50％均可)，灭菌；
[0049] 2)发酵：将处于生长指数期(生长指数期是指厌氧或兼性厌氧条件下在ISP 2液体培养基中培养16-18h)的戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)TMCC 70009CGMCC No.8685的种子液以5％(2％-10％均可，重量/体积百分比浓度)的接种量接种到已潮水的普洱毛茶中，在45℃(20-50℃均可)温度下经过3-4周的发酵，发酵期间每隔一周进行补水并翻堆，得到普洱熟茶。
[0050] 对大益2012年7572普洱熟茶及本发明的普洱熟茶进行γ-氨基丁酸含量的检测，方法参见Berthelot比色法。
[0051] 结果如表1所示。
[0052] 表1 普洱熟茶的品质检测结果(质量/质量百分比浓度)
[0053]检测项目 大益2012年7572普洱熟茶 本发明的普洱熟茶
γ-氨基丁酸含量 0.63％-0.86％ 1.5-2.2％
[0054] 经检测，γ-氨基丁酸含量为1.5-2.2％(质量/质量百分比浓度，以下同)，而在普洱毛茶中γ-氨基丁酸含量很低，为4.3mg/100g(0.0043％)。在普通普洱熟茶中γ-氨基丁酸含量一般为0.32％-0.9％，说明戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)TMCC 70009 CGMCC No.8685可以产生高浓度的γ-氨基丁酸，一方面可显著缩短发酵周期，发酵周期仅为3-4周，普通方法的发酵周期一般为6-8周，这是因为在人为条件下创造了菌株最适的生长环境，微生物单一且无其它菌株竞争，酶量分泌充足。另一方面用上述方法生产的普洱熟茶茶汤具有清新花香、滋味醇和、层次丰富，弥补了传统普洱熟茶滋味平淡、香气不明显的不足，对于提高普洱茶品质发挥了重要作用，这是因为该菌株以茶叶为底物分泌了某种香气物质，增加了特殊的香气成分；在滋味上，由于避免了杂菌的影响，口感更纯正。γ-氨基丁酸使普洱熟茶不仅具有降低血压、改善脑功能、增强长期记忆及提高肝、肾机能等作用，同时也由于γ-氨基丁酸的含量较高，避免了咖啡碱的兴奋刺激作用，利于安神睡眠。此外，随着戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)TMCC 70009CGMCC No.8685的大量繁殖，其分泌的酶量也增加，在
纤维素酶、糖化酶的作用下，茶叶中的内含物质经氧化、分解、聚合，大分子的不溶性物质可转化为可溶性的小分子物质，更加丰富了普洱茶的滋味，其丰富的酶系也抑制了其它杂菌特别是少数有害微生物的滋生，降低了普洱茶发酵生产中的失败风险。本发明对普洱茶新产品的开发提供了重要的应用基础，为普洱茶产业的发展提供了新的微生物资源。
