【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒュウガトウキ抽出物および／または圧搾物、ならびにこのエキスから単離された化合物を有効成分とする医薬組成物に関するものである。

【０００２】ヒュウガトウキ（Angelica furcijuga Kit
agawa）は、セリ科植物(Umbelliferae)のシシウド属（A
ngelica L.）に属する植物であり、宮崎県から大分県の南部に分布する九州特産で、丘陵や山地のやや乾いた草地に生える多年草である。 最近では、近似した種の植物であるイヌトウキ(Angelica shikokiana Makino)を有効成分とする肝機能改善用あるいは抗高脂血症用医薬組成物が知られている（特公平４−３３６５号）。 また、イヌトウキ含有化学物質としては、数種のクマリンと二種のステロールが知られている。 このクマリン系化合物、
イソエポキシブテリキシンについては、ヒト白血球を用いる実験において、抗アレルギー、抗炎症剤が知られている。 （特公平５−４８２３３号公報）。

【０００３】本発明にかかるヒュウガトウキは、以前は上記したイヌトウキと誤認されていたが、１９７１年北川政夫により新種であると発表され、その後の栽培における観察実験による比較で、異なる種であることが証明されている。 （宮崎産業経営大学研究紀要第５巻第１号／１９９３年１月）（宮崎県地方史研究紀要第１８輯／
宮崎県立図書館／平成４年３月）

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明者は、上記したイヌトウキの薬理活性に着目し、同属の植物であるヒュウガトウキについて鋭意研究した結果、医薬組成物として有用であることを確認し、本発明に至った。 すなわち、ヒュウガトウキからの抽出エキスにつき精査した結果、ヒュウガトウキ抽出エキス及び含有クマリン化合物であるイソエポキシブテリキシンに、マウス皮膚発癌実験系で有意に皮膚腫瘍の減少を確認した。 また、同様にヒュウガトウキ抽出エキス及びイソエポキシブテリキシンにつき、免疫反応を介した急性肝障害モデルであるＤ
−ガラクトサミンとリポポリサッカライド（大腸菌由来菌体内毒素）を併用することにより誘発される肝障害における血清中のトランスアミラーゼ（ｓ−ＧＯＴ、ｓ−
ＧＰＴ）上昇抑制作用を種々検討した結果、その抑制作用があることを見出した。 尚、上記したようにイヌトウキに抗肝炎作用があることは知られているが、イソエポキシブテリキシンに抗肝炎作用があることはこれまで全く知られていなかった。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明は、前記知見にもとづくもので、医薬組成物であって、ヒュウガトウキ（Angelica furcijuga Kitagawa）抽出物および／または圧搾物を有効成分とすることを特徴としている。 特に、前記知見にもとづくもので、抗癌剤または抗肝炎剤として適用されるものである。

【０００６】また、ヒュウガトウキに含まれている下記化学式（化１）のイソエポキシブテリキシンを有効成分とする抗癌剤または抗肝炎剤である。

【０００７】

【化１】

【０００８】尚、ローマ数字は特許庁がサポートしていない文字のため、本明細書に記載されているｔｅｒｅｂ
ｉｎｔｈａｃｏｓｉｄｅ１、ｔｅｒｅｂｉｎｔｈａｃｏ
ｓｉｄｅ２、ｔｅｒｅｂｉｎｔｈａｃｏｓｉｄｅ３、ｐ
ｒａｅｒｏｓｉｄｅ ２及びｐｒａｅｒｏｓｉｄｅ４のそれぞれのアラビア数字は、下記数１〜４に示すローマ数字の代用として使用している。

【０００９】

【数１】

【００１０】

【数２】

【００１１】

【数３】

【００１２】

【数４】

【００１３】

【発明の実施の形態】本発明に含有される抽出物および圧搾物は、栽培種又は野生種のヒュウガトウキ（Angeli
ca furcijuga Kitagawa）の花、根、茎、葉、枝などから採取される。 植物エキスの採取法には、上記植物を水洗・細断して抽出もしくは圧搾する方法、更には液体分を留去して濃縮乾燥することにより、粉末状ないし固形状のエキスにする方法がある。

【００１４】例えば抽出法においては、抽出溶媒としてのアルコール溶液の濃度は１０〜１００％、好ましくは４０〜８０％がよく、抽出後は植物エキスの効能と取扱の観点からアルコール溶液の濃度は２５％以下、場合によってはアルコール分を０にして使用してもよい。

【００１５】また、ヒュウガトウキから圧搾物を製造するには、地下茎などに付着した泥を落とし、全草を水洗する。 次いで、カッター、ミキサーなどで粗切して、プレスにより圧搾する。 プレスの圧縮圧力は、５００〜
５，０００ｋｇ／ｃｍ２程度に設定すればよい。 圧搾汁をこのまま、または精製もしくは希釈して使用することができる。

【００１６】ヒュウガトウキ含有のイソエポキシブテリキシンは、ヒュウガトウキの地下茎をメタノールで還流抽出し、濾液を減圧濃縮し、メタノールエキスを得る。
これを常法にしたがいＨＰ−２０カラムクロマトグラフィーで水→メタノール→アセトン→メタノールの順に溶出させ、水溶出分、第１分画分、第２分画分、第３分画分と粗分画する。 次いで、第３分画分を順相、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー、順相、逆相高速カラムクロマトグラフィーを用いて繰り返し、分離、精製を行うことにより、十数種の新規あるいは既知クマリン化合物とともに、イソエポキシブテリキシンを単離、取得できる。

【００１７】イソエポキシブテリキシンのヒト１日当たりの服用量は１０〜２５ｍｇ、またイソエポキシブテリキシンを含むヒュウガトウキ粉末では1０〜１５ｇ、アルコール抽出エキスでは１〜１．５ｇ、水エキスでは2
〜３ｇ、圧搾汁では１〜２ｍｌで有効と推定される。 適当な賦形剤を加えて、顆粒や錠剤とすることもできる。
医薬のみならず、健康食品として広く利用できる。

【００１８】

【実施例】（抽出及び単離）宮崎県産ヒュウガトウキ（Angelica furcijuga Kitagawa）の新鮮地下茎４，０
００ｇを熱時メタノール約１０，０００ｍｌで抽出後、
減圧下溶媒留去し、メタノール抽出エキス２１７．０ｇ
（５．４％）（以下カッコ内はいずれも新鮮地下茎からの収率を示す）を得た。 メタノール抽出エキスのうち、
１９５．２ｇをダイアイオン高速−２０カラムクロマトグラフィーに付し、Ｈ _２ Ｏ→ＭｅＯＨ→ＭｅＣＯＭｅ→
ＭｅＯＨの順に溶出させ、水溶出部１４０ｇ（３．８９
％）、第１分画分６．６ｇ（０．１７％）、第２分画分１７．７ｇ（０．４９％）、第３分画分２５．０ｇ
（０．６９％）をそれぞれ得た。 水溶出部及び第１分画分は、薄層クロマトグラフィーの検討から糖類及びアミノ酸など一次代謝成分であったことから、第２分画分について、順相及び逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー、及び高速液体クロマトグラフィー（ＯＤＳ）によるＭｅＯＨ−Ｈ _２ Ｏ、ＭｅＣＮ−Ｈ _２ Ｏ、２ＰｒＯＨ−
Ｈ _２ Ｏで順次溶出した結果、新規リグナン配糖体ｔｅｒ
ｅｂｉｎｔｈａｃｏｓｉｄｅ ３（１１）、クマリン骨格中のラクトン部が開環した型の新規配糖体ｔｅｒｅｂ
ｉｎｔｈａｃｏｓｉｄｅ ２（１０）（０．００２９
％）、新規アグリコンを有するクマリン配糖体ｔｅｒｅ
ｂｉｎｔｈａｃｏｓｉｄｅ １（６）（０．０００７９
％）、ｆａｌｃａｒｉｎｄｉｏｌ（０．０４０％）、他にクマリン配糖体ａｐｉｏｓｙｌｓｋｉｍｍｉｎ（０．
０３０％）、ｈｙｍｅｘｅｌｓｉｎ（０．０００９９
％）、ｐｒａｅｒｏｓｉｄｅ ２（０．０１２％）及び４（０．０１９％）、ｍａｒｍｅｓｉｎｉｎ（０．００
０８９％）、（Ｒ）−ｐｅｕｃｅｄａｎｏｌ ７−Ο−
β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（０．００４
４％）、リグナン配糖体（＋）−ｐｉｎｏｒｅｓｉｎｏ
ｌ Ο−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ
（０．０００１０％） を得た。 また第３分画分について、順相及び逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＯＤＳ）によるＭｅ
ＯＨ−Ｈ _２ Ｏ、ＭｅＣＮ−Ｈ _２ Ｏ、２ＰｒＯＨ−Ｈ _２ Ｏ
で順次溶出し、次いで高速液体クロマトグラフィー（ｃ
ｎ）によるｎ−Ｈｅｘａｎｅ−２−ＰｒＯＨで順次溶出した結果、三種の新規ケールラクトン型クマリンｔｅｒ
ｅｂｉｔｈａｃｉｎ Ｂ（１６）（０．００１９％）、
ｔｅｒｅｂｉｎｔｈａｃｉｎ Ｃ（２１）（０．０１４
％）、ｔｅｒｅｂｉｎｔｈａｃｉｎ Ａ（１５）（０．
０１１％）、isoepoxybuterixin（０．０４０％）、ａ
ｎｏｍａｌｉｎ（０．０１３％）、ｐｔｅｒｙｘｉｎ
（０．０１７％）、ｉｓｏｐｔｅｒｙｘｉｎ（０．０４
０％）、ｓｕｋｓｄｒｆｉｎ（０．０１４％）、ｓｅｒ
ａｖｓｃｈａｎｉｎ（０．００２２％）、ｂｅｒｇａｐ
ｔｅｎ（０．００１１％）、（−）−ｆａｌｃａｒｉｎ
ｏｌ（＝ｐａｎａｘｙｎｏｌ）（０．００２１％）、ｆ
ａｌｃａｒｉｎｄｉｏｌ（０．００４６％）、β−ｓｉ
ｔｏｓｔｅｒｏｌ（０．０３２％）が単離された。

【００１９】

【試験例１】（Ｄ−ＧａｌＮ／ＬＰＳ肝障害保護）２５
〜２７ｇのｄｄｙ系雌マウスを用い、Ｄ−ガラクトサミン（Ｄ−ＧａｌＮ）３５０ｍｇ／ｋｇ及びリポポリサッカライド（ＬＰＳ）１０μｇ／ｋｇを腹腔内注射し、肝障害を誘発した。 表３の各テストサンプルは、Ｄ−Ｇａ
ｌＮ／ＬＰＳ注射の１時間前に与えられた。 採血は、Ｄ
−ＧａｌＮ／ＬＰＳ注射１０時間後に行った。 各値は、
Ｓ． Ｅ． Ｍによる平均値を示す（ｐ＜０．０５、ｐ＜
０．０１）。 各サンプルの投与量及び血清トランスアミラーゼ活性値（ｓ−ＧＰＴ、ｓ−ＧＯＴ）を表１に示す。

【００２０】

【表１】

【００２１】

【試験例２】（Ｄ−ＧａｌＮ誘発細胞毒性の保護作用）
ヒュウガトウキ抽出成分の肝保護作用は、初代培養肝細胞を用いて３−（４，５−ジメチルチアゾル−２−イル）−２−，５−ジフェニルテトラゾリウム ブロマイド（ＭＴＴ）カラーメトリックアッセイにより測定した。 肝細胞は、ウィスター系雄ラット（１３０〜１６０
ｇ）からコラーゲン散布法により分離した。 仔牛血清１
０％、ペニシリン１００ユニット／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ、インシュリン１μＭ、デクサメタゾーン１μＭを含むウィリアム培養液１００μｌ中に4×１０ ^４セルからなる細胞懸濁液を９６ウエル組織培養プレートに接種、５％ＣＯ _２雰囲気中で３７℃、4
時間予備培養した。 培養液をＤ−ＧａｌＮ（１ｍＭ）とテストサンプルを含む新鮮培養液に変え、肝細胞を４４
時間培養した。 培養液をさらに１００μｌの培養液に変更、これに１０μｌのＭＴＴ溶液（ＰＢＳ中５ｍｇ／ｍ
ｌ）を加えた。 4時間培養後培養液を除去し、次いで０．０４ＮのＨＣｌを含むイソプロパノール１００μｌ
を加え、細胞中に生成されたフォルマザンを溶解した。
フォルマザン溶液の光学濃度（Ｏ．Ｄ）は、マイクロプレートリーダーにより、５７０ｎｍ（リファレンス：６
５５ｎｍ）で測定した。 抑止率は、次式数５で求めた。
結果を表２に示す。

【００２２】

【数５】抑止率（％）＝｛（サンプルＯ．Ｄ−対照群Ｏ．Ｄ）÷（正常群Ｏ．Ｄ−対照群Ｏ．Ｄ）｝

【００２３】

【表２】

【００２４】

【試験例４】（抗炎症薬理活性）ｄｄｙ系雄性マウス（体重約３０ｇ）を頚椎脱臼により安楽死させ、腹腔内に緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を６〜７ｍｌ注入し、軽くマッサージした。 得られた腹腔滲出液をＰＢＳ、次いでＲＰＭＩ１６４０（１０％牛胎仔血清、１００ユニット／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含む）培地で洗浄した。 ９６穴平底マイクロプレートに１ウェル当たり５×１０ ^５個／１００μｌの細胞を加え、３７℃、５％炭酸ガス−９５％空気下で１時間培養した。 浮遊細胞をＰＢＳで洗浄し、上記培養液にリポポリサッカライド（シグマ社製、サルモネラエンテリティディス由来）１０μｇ／ｍｌ及び被検物質を含むものを２００μｌ加え、２０時間培養した。 培養上清１００
μｌにグリース試薬（１％スルファニルアミドと０．１
％Ｎ−１−ナフチルエチレンジアミン ジハイドロクロライドを２．５％燐酸に溶解したもの）１００μｌを加え、室温で１０分間放置した。 マイクロプレートリーダーによって吸光度を測定した（測定波長５６２ｎｍ、対照波長６３０ｎｍ）。 亜硝酸ナトリウムを標準物質として培養液中に蓄積したＮＯ ⁻の量をＮＯの生成量とみなして判定した。 被検物質としては、実施例で取得したファルカリノール、ファルカリンジオール及びイソエポキシブテリキシンと、抗炎症作用が知られている対照薬としてハイドロコーチゾンを用いた。 結果を表３に示す。

【００２５】

【表３】

【００２６】表１から明らかなように、対照群ではＤ−
ＧａｌＮ／ＬＰＳ投与の１０時間後に著しい肝障害により、血清トランスアミナーゼ活性（ｓ−ＧＰＴ、ｓ−Ｇ
ＯＴ）が約６０００単位まで上昇したが、ファルカリンジオールをはじめ、ヒュウガトウキ由来物質投与群ではいずれもｓ−ＧＯＴ、ｓ−ＧＰＴの上昇を有意に抑制した。

【００２７】この実験モデルにおいては、Ｄ−ＧａｌＮ
でやや障害を受けた肝細胞にＬＰＳ刺激で活性化したマクロファージが作用することによって強い障害が発生すると考えられている。 そこで、作用機序を解明する目的で、初代培養肝細胞を用い、Ｄ−ＧａｌＮによる細胞毒性からの保護作用についてＭＴＴアッセイ法により検討した。 ＭＴＴアッセイ法は細胞の脱水素酵素によって黄色のＭＴＴが赤紫色のホルマザンに変化することを利用した細胞数測定方法である。 その結果、表２に示すように、イソエポキシブテリキシンには濃度依存的な肝細胞保護作用が認められた。 一方、ファルカリンジオールには、逆に肝細胞に対する毒性がみられた。 その他の微量成分としてイソプテリキシン（ｉｓｏｐｔｅｒｙｘｉ
ｎ）に保護作用が認められた。

【００２８】また、ＬＰＳによるマクロファージの活性化にともなって産生される一酸化窒素（ＮＯ）の量を指標に、マクロファージの活性化を抑制するかどうか検討した。 ＮＯはただちに酸化されＮＯ _２ −に変化するため、培養液中のＮＯ _２ −の量をＮＯの量とみなした。 イソエポキシブテリキシンおよびファルカリンジオールは、表３に示すようにマクロファージに対して細胞毒性を示さない濃度でＮＯの産生を強く抑制した。 またアノマリン（ａｎｏｍａｌｉｎ）、ベルガプテン（ｂｅｒｇ
ａｐｔｅｎ）、セラブシャニン（ｓｅｒａｖｓｃｈａｎ
ｉｎ）、イソプテリキシンや新規化合物テレビンタシンＡにも抑制作用が認められ、特に、ファルカリンジオールに強い活性が認められた。 ファルカリンジオールは肝細胞毒性を示すにもかかわらず、マクロファージの活性化を強く抑制するため、この肝障害を抑制したものと考えられる。 また、イソエポキシブテリキシンは肝臓側に作用して肝保護作用を示すのみならず、マクロファージの活性化を抑制することによってＤ−ＧａｌＮ／ＩＰＳ
による肝障害を抑制するものと推察される。

【００２９】

【試験例４】（抗腫瘍薬理活性）実験動物に雌のＣＤ−
１系７〜８週令のマウスを一群２０匹とした。 実験２日前、バリカンで剃毛し、毛の成育の休毛期のマウスを用いた。 被検体はすべてアセトンに溶解させ、マイクロピペットで０．２ｍｌ剃毛した皮膚に塗布した。 まず発癌のイニシエーターとしてジメチルベンゼンアントラセン（ＤＭＢＡ）２００ｎｍｏｌをマウス皮膚に塗布した。
１０日後に週２回テトラデカノールホルボール−１３−
アセテート（ＴＰＡ）５ｎｍｏｌを塗布し、１８週間続けた。 被検体は、ＴＰＡ塗布と同時に週２回塗布、１８
週間続けた。 判定は腫瘍のマウス当たりの数とマウスに腫瘍の発生した割合との２種で評価した。 結果を図１に示す。

【００３０】図１から明らかなように、ヒュウガトウキエキス群及びイソエポキシブテリキシン群には、明白な抗腫瘍効果が認められた。 抗腫瘍効果は、腫瘍の発生したマウスの数でも、マウス１匹当たりの腫瘍数においても確認された。

【００３１】

【発明の効果】本発明のヒュウガトウキ抽出エキスおよびその含有イソエポキシブテリキシンは、上述のように天然物由来のすぐれた医薬組成物として、また健康食品として産業上広く利用できる。 また、日ごろ手軽に摂取できる健康食品数ｇで副作用もなく安心して長期にわたり発癌を抑制できれば、社会的な貢献度も大きい。

【図面の簡単な説明】

【図１】ヤマニンジンアルコール抽出エキスとイソエポキシブテリキシンのＣＤ−１マウスでの皮膚腫瘍発生抑制効果を示すグラフで、（イ）は腫瘍の発生したマウス数を示し、（ロ）はマウス１匹当たりの腫瘍数を示す。