本发明涉及一种称为“多核酶”(“Polyribozyme”)能够为植物 提供对病毒抗性的核苷酸序列，以及使植物具有抗性的方法。本发 明还涉及表达多核酶的植物。

现已发展了几种为栽培植物提供对病毒抗性的途径，即向植 物病毒核酸序列基因组中整合入：衣壳蛋白基团、非结构蛋白基 因、反义病毒RNA序列和卫星病毒RNA(见，例如，Cuozzo 等，1988，Bio/Technology6,549－557；Rezaian等，1988，Plant， Mol.Biol.11,463－471；Harrison等，1987，Nature 328,797－ 802)。

这些出版物报道了部分抗性或耐性的产生。但是，多数情况下 只是延缓症状或减轻症状，而无完全抗性。

还有，这些方法中的一些－例如使用卫星病毒RNA的方法－ 可能引起新的问题。例如，在一种植物中减轻症状的卫星病毒可能 对另一种植物就是致命的。况且，引入植物中的卫星病毒核苷酸序 列中的突变可能增加感染的严重性而不是减小它。

与此相似，使用衣壳蛋白提供抗性也有缺点。例如，某病毒的某 一特殊毒株的衣壳蛋白不一定保护植物抵抗此病毒另一毒株的感 染。用不同病毒间或不同毒株间的衣壳蛋白氨基酸的同源性程度难 以预测该蛋白表达所提供的耐性程度。再者，通过衣壳蛋白的表达 抗病毒感染保护植物，带来诱导植物中表达的衣壳蛋白与感染转 基因植物其它病毒之间的异体衣壳化的危险。虽然这还没有在转基 因植物因植物中得到证实，但这已在两株BYDV间和ZYMY和 PRSV间观察到。

使用核酶(ribozyme)也被认为可提供植物对病毒的抗性。核是 一些象酶一样能特异性催化靶RNA裂解的RNA分子。在专利 申请EP－A－321021中描述了用核酶在植物细胞中的第一批实 验。从那以后，几位作者曾试图优化核酶的结构和操作条件，以有 效地裂解病毒RNA。

例如，Lamb和Hay(J.Gen，Virol.1990，71：2257－2264)已证 实单核酶在体外对马铃薯卷叶病毒的RNA聚合酶及衣壳蛋的基 因的编码区RNA有裂解作用。但是，此体外裂解反应仅在40℃发 生；迄今还不可能在0℃观察到任何反应。根据不同的种类，植物 一般在10到30℃间载培。而在体内使用时，Lamb和Hay建议要 增加互补臂的长度。但如果臂太长，在靶RNA与核酶之间可产生 稳定的双螺旋，阻碍核糖酶的解离，使其不能催化另一裂解反应。 再者，根据互补臂的长度和序列，核酶本身可形成二极结构，这减小 了其裂解活性。

Edington和Nelson(“Gene Regulation；Biology of Antisense RNA and DNA：ERICKSON和IZANT编辑，Raven Press Ltd，New－York，1992)已描述了在体外和体内使用单核酶 灭活烟草花叶病毒(TMV)的聚合酶基因。他们观察到根据体外还 是体内使用，核酶表现非常不同的行为。因此核酶的体外活性不能 用于预测同一核酶的体内活性。例如，体外裂解看来效力低，需要高 于TMV基因组RNA浓度20倍的核酶浓度。另一方面，使用 TMV感染的烟草原生质体的体内实验中，核酶抑制病毒RNA增 殖的90％。令人感兴趣的是，注意到用作对照的反义RNA仅抑制 病毒增殖的20％。这些作者还参考了Gerlach等的研究，后者使用 了定向于TMV的聚合酶基因的多核酶。这种多核酶在体外不起作 用，因为其长度使核酶与靶RNA间形成双螺旋。而在体内，该多 核酶可以裂解底物。表达单核酶或多核酶的转基因烟草植物已显示 在用TMV感染后可延缓症状但未提及完全抗性，即最终不存在症 状。作者得出结论说，必须通过实验确定诸如互补臂的最佳长度、 靶序列的选择和启动子的选择这些参数，以使解决核酶的 “compartment－alisation”问题成为可能。

EP－A－0421376描述了针对CMV的非编码RNA的核酶。 WO－A－9213090描述了通过用“第I类内含子”型的单核酶在序 列中引入外源序列来灭活CMV衣壳蛋白的RNA。这些文件都没 有提到产生对CMV的完全抗性。

本发明提出要解决的技术问题是提供一种可使植物对病毒具 有抗性而无所述缺点的可靠物质。

本发明者已通过针对病毒衣壳蛋白的多核酶的概念和应用解 决了这一问题。这种多核酶能够灭活编码所述蛋白的基因，从而提 供对病毒的完全抗性。

考虑到现有技术中使用衣壳蛋白基因的反义序列所得平凡结 果，本发明的多核酶的效力是令的惊异的，因为这些方法都涉及相 应RNA的灭活。另外，几位作者还曾反对使用反式作用多核酶，因 为此核酶不能相互独立地起作用，还因为具有相同序列的催化区 有时趋于相互杂交，这样形成非活性结构(见，例如，Taira， Workshop”RNA－Editing－Plant Mitochondria”，Abstract Book，Berlin，September15－20，1992)。鉴于所选择的靶标是衣 壳蛋白和用于灭活此靶标的方法是多核酶，本发明所得结果是出人 意外的。

除灭活的效力外，与已知方法相比，本发明的多核酶具有几个 优点：

－核酶的酶功能：特异性地催化几种病毒RNA的裂解而无 结构修饰。这种酶切导致用于衣壳蛋白表达的病毒RNA全部破 坏，它作为病毒增殖抑制剂抑制了病毒的感染功能。

－此核酶是一种非编码RNA分子，它不能诱导异体衣壳化 或产生新的病毒株。

－鉴于衣壳蛋白诱导的耐受性的特异性难于预测，如果互补臂 相当于不同病毒株或不同相关病毒间保守的同源区，可以构建核 酶使其特异性地裂解一种或多种病毒株，或数种相关病毒。

为了彻底理解本发明，将关于核酶的概括特征具体化将是有 用的。核酶是一种RNA分子，鉴于其序列和二级结构，它具有核 糖核酸酶活性，它这使得它与第二个互补RNA分子杂交时可以 裂解该第二种RNA。因此，后者称为核酶的“底物”。

核酶具有两个必需部分：

(i)以下将称为“互补序列”的序列，选择这种序列以使其与要 裂解的底物互补，使这两种分子杂交；和

(ii)催化区，它具有与所选底物无关不参与与底物的杂交的序 列，构成其“环”形二级结构。

一般，催化区位于互补序列之内，这样，一部分互补序列位于 催化区的5’端，另一部分位于其3’端。在催化区每一侧的这些具 有互补序列的片断常称为“杂交臂”。

本发明的目的是一种多核酶。更具体地讲，它是一种称为“多 核酶”的核酸序列，它具有核糖核酸内切酶活性，能够使病毒衣壳蛋 白的基因灭活，其特征在于它包括：

i)与该基因或其转录本或其复制中间体的至少一部分互补的 序列，在此互补序列中的不同位点包括：

ii)多重核酶催化区，和

iii)任选的一种或多种不与所述基因的转录本互补的序列，所 述非互补序列插入在互补序列的2个连续碱基间。

本发明说明书中，术语“多核酶”指由一系列核酶从头到尾构 建而成的RNA分子，因此核酶是多核酶的主要单元。换句话说， 它是通过杂交臂连结起来的一系列催化区，这些臂的总长构成了 互补序列。多核酶一般作为对单一转录本的“单一分子”，而每个催 化区的裂解位点位于同一转录本上：衣壳蛋白质。本发明的多核酶 还可包括：除上述的2个必需部分〔(i)互补序列和(ii)催化区〕以 外的，一种或多种对底物的非互补序列(iii)。下列将详细描述这些 非互补序列的性质和功能。

多核酶的两个必需部分中，互补序列定决定底物的序列。对本 发明来讲，它是与病毒衣壳蛋白基因互补的序列，或与该基因的片 断互补的序列。当病毒是RNA(+)病毒时，其基因直接作为 mRNA，互补序列与此基因真正互补。在另一情况下，它是与基因 的转录本互补。它还可以与一复制中间体互补。

互补序列可与衣壳基因的全长杂交。此时互补序列的总长为 所研究的衣壳蛋白基因长度的函数而变化。另一方面，互补序列可 以仅与基因的片断杂交。所述片断必须足够长以能在相应的多核酶 序列中包括至少两个催化区。总体来讲，催化区不计在内，互补序列 的长度(即杂交臂之和)可在约40－2000个碱基间变化。优选400 －1000碱基的长度，许多病毒的衣壳蛋白基因有的1000个碱基 (如CMV，PLRV)。

本发明说明书中，术语“互补”指多核酶与此底物间具有足够 高的互补性使得能够稳定地杂交，并有效地裂解底物。当多核酶不 含有(iii)型序列(即“非互补”序列)时，互补度通常为100％。在序 列中存在一定数量的失配是充许的，只要它不妨碍杂交和底物的裂 解。

多核酶的第(ii)部分(即催化区)可来自任何类型适宜的核酶， 例如“榔头”型、“发夹”型或“第I类内含子”型。同一种多核酶可含 有来自不同类型核酶的催化区，例如“榔头”型和“发夹”型。催化区 优选来自“榔头”型核酶，图1A、B、C和D中表明了其序列结构。专 利申请EP－A－321021和WO－A－9119789中详细描述了这些 核酶。

虽然图1中所示催化区具有保守序列，但已观察到某些核苷酸 可以被缺失、插入、取代或修饰而不影响核酶的活性。本发明包括在 多核酶中使用这些修饰的催化区，只要保留其催化活性即可。用下 面描述的实验可以验证此活性。

例如，图1A中所示催化区II的一个或多个核苷酸可被含有 诸如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、甲基胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、黄嘌 呤、次黄嘌呤、肌苷或其它甲基化碱基的核苷酸所置换。“保守”碱基 C－G一起形成催化环的第一个碱基对，它可以用U－A代替 (Koizumi等，FEBS Letts、228,2,228－230，1988)。

图1中所示催化区的核苷酸还可以被化学修饰。核苷酸由碱 基、糖和单磷酸酯基因组成。这些基因每个都可以被修饰。在 “Principles of Nucleic Acid Structure”(Ed.Wolfram Sanger， Springer Verlay，New York，1984)中描述了这种修饰。例如，碱基 可带有取代基如卤原子、羟基、氨基、烷基、叠氮基、硝基、苯基等。 也可以对核苷酸的糖部分进行修饰，用卤原子、氨基或叠氮基取代 仲羟基，甚至进行2’甲基化。

核苷酸的磷酸酯基团可用N，S或C代替氧原子进行修饰，分 别形成氨基磷酸酯、硫代磷酸酯和膦酸酯。这些物质可能表现有用 的药代动力学性能。

催化区的碱基和/或核苷酸还可带有诸如氨基酸的取代基，例 如，酪氨酸或组氨酸。

还观察到可以在催化区的某些位点插入外加的核苷酸，而不 影响核酶的活性。例如，选自A、G、C或U的外加碱基可以插在图 1A或1B中的1A之后。

根据本发明的一种方案，核酶可含有诸如图1D中所示的一个 或多个结构作为催化区。该结构称为“微小酶”，在国际专利申请 WO－A－919789中有述。它代表一个“榔头”型的催化区，其“环” 已用“P”代替。P可以是G和1A间的共价连结，一个或多个核苷酸 (RNA或DNA，或混合物，或甚至为上述的衍生物)或除核苷酸以 外的不影响催化活性的任何原子或原子集团。当P代表多个核苷 酸时，它可含有多个内部碱基配。构成基团“P”的序列和核苷酸数 目不是关键之处，可在1－20个核苷酸内变化，例如优选1－6个。 最好选择没有Watson－Crick型的内部碱基配对的序列。

通过将多核酶，或转录后产生多核酶的序列与底物接触，然后 证明裂解的发生，这样可在体外证实本发明多核酶的催化活性。体 外裂解反应的实验条件如下：温度在4－60℃之间，优选20－55℃ 之间，PH在约7.0到9.0之间，存在二价金属如Mg2+，浓度为1－ 100mM(优选1－20mM)。多核酶的量一般与底物等摩尔比，或过 量。体外裂解反应最好按照Hamb和Hay描述的方法进行(J. Gen.Virol.，1990，71，2251－2264)。这篇文章中描述了从插入 质粒的寡脱氧核糖核苷酸体外转录产生核酶的适当条件。

体内裂解条件是细胞中天然存在的条件。

“榔头”型核酶从“靶”点XXX(优选XUX)的紧下游裂解底物， 其中X代表4个碱基A、C、G、U中的一种，U代表尿嘧啶。一种特 别优选的靶序列是XUY，其中Y代表A、C或U，X常为G，例如 GUC。其它可能的但效力较差的靶点，例如是CAC、UAC和AAC。 对于“发夹”型核酶，优选的靶序列是AGUC。

这些靶序列在多核酶的构建和功能化中很重要，这不但是因 为它们指示底物的裂解位置，而且因为它们定义了必须在互补序 列中插入催化区的位置。实际上，多核酶的每个催化区必须位于互 补序列中相当于转录本中XUX位点的位置。例如，如果一个XUX 位点位于衣壳蛋白基因的108位，另一个在205位，则催化区一个 插入在互补序列中相应的108位，另一个插入在205位。

XUX单元是RNA序列中存在的高频单元。例如，在碱基随 机等同分布的序列中，平均每64个碱其中有一个GUC单元。这表 明底物通常含有多个XUX裂解位点。如上所述，多核酶的催化区 位于互补序列中相应于XUX位点的位置。但是根据本发明，为达 到有效裂解，不必包括相应于底物的每个XUX靶序列的催化区。 根据本发明，当多核酶含有至少2个催化区时，可达到有效裂解。互 补序列中包含的催化区的总数等于或小于基因中存在的XUX总 数。因此本发明的多核酶所含催化区的数目变化很大。例如，对 CMV，当靶序列为GUC时，多核酶可含有的2个到的11或12个 催化区。当决定在互补序列中包含数目少于底物中XUX位点数的 催化区时，根据下列标准选择位点：

a)2个XUX靶点间的距离，相应的多核酶中2个催化区间的 距离必须足够长，使得位于相应催化区之间的多核酶的杂交臂能 与底物稳定杂交，并防止催化区与其自身杂交。至少8个碱基，优选 至少14个碱基，例如约20个碱基的距离是特别有利的。当然，只有 当底物所含XUX位点非常靠近时才考虑这一标准。否则，如果底 物的XUX位点间相互以大于8－20个碱基分隔，该标准就不重 要。

b)XUX靶点优选位于衣壳蛋白基因的没有明显二级结构的 部分。这有助于多核酶与底物接近，并增加其效力。

c)XUX位点可形成同一病毒的不同株或不同的相关病毒所 保守的同源性区域的一部分。根据这一标准构建的多核酶可特异性 地裂解数个病毒株或数个相关病毒。例如，与相关病毒BWYV和 BYDV的衣壳蛋白序列相比，PLRV的衣壳蛋白基因的中央区域 是高度保守的。此中央区域内的XUX位点，特别是GUX，因此构 成本发明的一种多核酶的优选位点。

另外，作为实例，在毒株I17F、FNY、M、I、O、Y、D和C之间， CMV衣壳蛋白质序列的5’末端(100多个碱基长)是高度保守的。 在该保守序列内的位置84处，所有这些毒株均有一保守的GUC位 点。

根据本发明的这一方案，能使数个CMV毒株灭活的多核酶在 催化区域中含有一个催化区，位于互补序列相当于位置84的位点 (参见下文实验例)。

d)XUX靶点的另一选择标准是与被转化植物的内源基因没 有同源性。事实上，尽管很少，但有些病毒拥有在植物基因组中能找 到同源序列的序列。因此，避免XUX位点位于这种序列内是很重 要的。

根据本发明一种特别优选的实施方案，除上述的2个必需部 分(i)和(ii)外，多核酶还可含有第三个组分(iii)，即一个或多个与 病毒衣壳蛋白基因不互补的序列。象催化区一样，这些非互补序列 被插入到互补区的不同位点，互补性因插入而被中断。令人惊奇地 是，本发明人观察到在多核酶杂交臂内存在所述非互补序列并不妨 碍多核酶与底物的杂交，而且在某些情况下，甚至可提高裂解反应 的效率。

将这些非互补序列插入在互补序列的两个连续的碱其之间， 从而非互补序列与互补序列形成一个共线性插入。在这种情况下， 多核酶具有结构： ((杂交臂－催化区－杂交臂)－(非互补序列)n)p 其中n＝0或1，p＞1。

作为本发明这一实施方案的一个实例，可提及由核酶序例、与 底物的不同片段(连续的和邻接的)互补并且由非互补序列连在一 起的杂交臂组成的多核酶。换句话中，在所述结构中，杂交臂的聚集 重新组成了与衣壳蛋白基因互补的序列。

在多核酶中非互补序列的存在表明，多核酶两个催化区之间 的距离大于底物中两个相应GUC位点间的距离。根据本发明的这 种方案，位于催化区每一侧的杂交臂的长度必须至少是4个碱基， 而且优选的是每一侧至少8个碱基，并可多达800到1000个碱基。

非互补序列的特性可随其功能的不同而异。可以是具有“填 充”功能的序列，即在底物相应的两个XUX位点彼此非常近时，可 以增大多核酶两个催化区之间的距离。用这种方式，可以避免在两 个相邻的催化区之间形成失活的双螺旋。也可以用作非互补序列使 用具有确定的二级结构的序列，其可具有防止可观长度的多核酶， 如有800多碱基的多核酶在无活性的二级结构中自身再折叠。作为 这种结构类型的一个实例，可提及通过缺失一个或多个必需的碱 基而使其失活的核酶。由下文实施例中描述的多核酶136举例说 明了本发明实施方案的这种模式。

多核酶的非互补序列也可具有明确的功能，例如，它可以由用 于筛选转化株的编码序列或者含有作用于衣壳蛋白以外之底物或 者顺式作用于多核酶某部分之核酶的序列构成。总而言之，非互补 序列并不编码蛋白质。它也可含有多克隆位点。非互补序列的长度 通常在2到500个碱基之间，如20到100个碱基。当存在多个互补 序列时，它们可共同构成核酶长度的高达约90％，例如50％。

本发明的多核酶通常由RNA组成。然而，可以由DNA取代 多核酶的某些部分，如杂交臂或这些臂的部分，或者催化区的部 分，特别是“环”，条件是保持催化活性(参见，如国际专利申请WO －9119789中描述的DNA取代RNA)。

可以构建本发明的多核酶以使任何病毒衣壳蛋白失活。衣壳蛋 白是蛋白质亚单位，由病毒基因组编码，构成多聚衣壳。所述衣壳由 这些相同的蛋白质亚单位沿核酸一个接一个排列组成。衣壳亚单位 的空间排列，根据病毒不同，要么产生螺旋要么是二十角结构。本发 明涉及针对具有螺旋颗粒或二十角颗粒的病毒以及具有被膜之病 毒衣壳蛋白的多核酶。所述被膜是位于核蛋白衣壳外周的脂蛋白 膜。

作为适宜病毒的实例，可从下列各类中选择：花椰菜花叶病毒 组，如花椰菜花叶病毒(CaMV)；双联病毒组，如EcoRI米线条病毒 (MSV)；呼肠孤病毒科，如伤瘤病毒(WTV)；弹状病毒科，如马铃 薯黄矮病毒(PYDV)；蕃茄斑萎病毒(TSWV)；烟草花叶病毒组，如 烟草花叶病毒(TMV)；马铃薯X病毒组，如马铃薯X病毒( PVX)；马铃薯Y病毒组，如马铃薯Y病毒(PVY)；荷兰石竹隐 潜病毒组，如荷兰石竹隐潜病毒(CLV)；黄化病毒组，如甜菜黄化 病毒(BYV)；烟草脆裂病毒组，如烟草脆裂病毒(TRV)；大麦病 毒组，如大麦条斑花叶病毒；芜菁病毒组，如芜菁黄花叶病毒 (TYMV)；黄症病毒组，如大麦黄矮病毒(BYDV)或马铃薯卷叶病 毒(PLRV)；蕃茄丛矮病毒组，如蕃茄丛矮病毒(TBSV)；南方菜豆 花叶病毒，如南豆花叶病毒(SBMV)；烟草坏死病毒(TNV)；蠕传 多面体病毒组，如烟草环斑病毒(TRSV)；豇豆花叶病毒组，如 豇豆花叶病毒(CPMV)；豌豆耳突花叶病毒(PEMV)；黄瓜花叶病 毒组，如黄瓜花叶病毒(CMV)；雀麦花叶病毒组，如雀麦花叶病毒 (BMV)；等轴不稳定环斑病毒组，如烟草线条病毒(TSV)，这些 蛋白质的序列是已知的(如参见，在专著“Elements de Virologie Végétale”，Pierre Cornuet，.I.N.R.A.Paris，1987，ISBN：2－ 85340－808－6中引述的大量文献)。

根据一种特别优选的方案，衣壳蛋白是黄瓜花叶病毒(CMV) 的衣壳蛋白质。由于CMV可以感染750种以上的植物，因此属于 黄瓜花叶病毒组的黄瓜花叶病毒有很大的农学重要性。CMV是一 种多组分病毒，由含三个基因组RNA(RNA1－3)和一个亚基基组 RNA(RNA4)的二十面体颗粒组成，RNA3含有一个拷贝的衣壳 蛋白质基因；但得自RNA3的亚基因组RNA4用作合成衣壳蛋白 质的基体。将不同的CMV株分成两类：

含毒株C、D、FNY、Y、I17F和Chi的亚组I；

毒株Q和WL所属的亚组II。

比较属于相同亚组的CMV毒株衣壳蛋白质的氨基酸序列表 明有95％的同源性。亚组I和II之间的序列同源性较低，为80％ 左右。

已经发现抗CMV(毒株I17F)衣壳蛋白的本发明多核酶对于 灭活不同CMV毒株是极为有效的，而且被转化植物得到完全抗 性。

除多核酶外，本发明还涉及生产抗病毒植物的方法，特征在于 将多核酶或如上述的编码多核酶的序列导入植物。

通常，经遗传转化，由此将编码多核酶的DNA序列稳定整合 到植物其因组中，从而将多核酶导入植物。

可以使用所有将外源DNA导入植物的导入植物的方法，如土 壤杆菌、电穿孔、厚生质体融合、用颗粒枪轰击、或DNA渗入细胞 如花粉、微孢子、种子和不成熟胚胎中，病毒载体如双联病毒或者 卫星病毒。根瘤土壤杆菌和根毛土壤杆菌构成优选的工具。在这 种情况下，将编码多核酶的序列连同所有必需的调节序列如启动 子、终止子等以及筛选转化株必需的任何序列一起导入适宜的载体 中。

本发明还涉及由该方法得到的转基因植物。更具体地说，涉及 对病毒有抗性的转基因植物，特征在于它们在其基因组中含有转 录后可产生本发明多核酶的序列。

在本发明中，术语“完全抗性”指完全没有症状，“耐受性”指植 物被感染(即显示出症状)但随后又恢复。术语“敏感性的”指植物表 现出病症并复制病毒。“抗性型”指完全抗性植物和耐受性植物的总 和。

可以用下列方法检测本发明转基因植物的“抗性”性质：对第 一子代完成自体受精或与未转化的基因型杂交以得到T1。随后，用 所研究的病毒接种T1植物。根据本发明，75％的自体受精T1是有 完全抗性。在与未被转化之基因型杂交的情况下，50％的植物是完 全抗性的(根据本发明，通过检测已经经受转化和再生过程的整个 植物群体来得到这些数据。应注意这些植物中只有75％的是被转 化了的)。

可用“Southern印迹”分析证实植物的转化性质，可用 Northern印迹分析确定通过转化导入的序列的表达。在下文实施 例中将描述这些分析。

用本领域已知的植物转化和再生方法可很好地生产由本发明 多核酶保护的转基因植物。一个实例是在专利公开No.EP－A－ 0412912中描述的甜瓜转化和再生方法。

抗CMV的转基因植物是特别优选的，如甜瓜，黄瓜，笋瓜 (courgette)、蕃茄胡椒和菜豆。

下述附图举例说明了本发明的各个方面：

－图1表示本发明多核酶催化区的优选结构，这些区在每一 侧均由与病毒衣壳蛋白的部分互补的序列包围：

(i)在图1A中：X代表A、G、C或U；每个X是相同或不同的； n＋n’≥，6，n和n’是相同或不同的；(★)代表互补核糖核苷酸之 间的氢键；X’和X”代表在至少其部分长度上彼此互补并可由至 少一个核苷酸彼此相连，由此形成一个环的寡核糖核苷酸。可将选 自A，G、C或U的附加核苷酸插入A’后。核酶的催化区由图1A的 部分(II)表示，部分(I)表示杂交臂。

(ii)在图1B中，X，(★)，n，n’和A’具有与图1A中相同的意 思。M和M’≥1，并且是相同或不同的。B代表一个键，一个碱基 对，一个核糖核苷酸或含至少2个核糖核苷酸的寡核糖核苷酸。

(iii)图1C代表核酶的一个优选模式(Haseloff and Gerlach， 1988)，RNA底物在与核酶互补的GUC裂解位点周围可以有任何 序列(X)。箭头表示裂解位点。用黑色显示保守碱基。

(iV)图1D表示核酶(称为“微小酶”)的结构，由元件“P”取代 催化区的环。P可以是至少一个核苷酸(核核苷酸，脱氧核糖核苷 酸，衍生物或混合物)，条件是在序列(X’)n和(X)n’及P仅由核糖 核苷酸构成时，“P”基团的核糖核苷酸不是经“Watson－Crick”碱 基配对的碱基对。“P”也可以是不影响核糖酶催化活性的键或任何 原子或原子集团。X的意思与图1A中的相同。

－图2表示CMV(I17F)衣壳蛋白质的序列，下面划线的是 GUC位点。

－图3显示为了在CMV衣壳蛋白质序列中的不同位点处导 入TobRSV催化位点而进行定点诱变实验的寡脱氧核糖核苷酸 A、B、C、E的结构(表明与DNA基质序列杂交)。

－图4说明为了诱导对CMV抗性而构建的基因的结构：

(i)衣壳蛋白质

(ii)多核酶136：与带有2个核酶的衣壳蛋白质互补的序列：

(ii)多核酶161：与带有3个核酶的衣壳蛋白质互补的序列：

(iv)多核酶163：与携带3个核酶的衣壳蛋白质互补的片段；

(v)多核酶165：与带4个核酶的衣壳蛋白互补的序列；

－图5显示对表达多核酶136之转基因甜瓜植物在某些情况 下的原始转化株，T1和T2后代)的Northern印迹分析结果

T0：原始转化株；

T1；T1后代；

T2：T2后代；

A：品系141.1

NT：未转化的对照组。

－图6显示对表达多核酶136之转基因甜瓜植物(在有些情况 下的原始转化株T1和T2后代)的Southern印迹分析结果：

T0：原始转化株；

T1：T1后代；

T2：T2后代；

NT：未被转化的对照组。

－图7显示对表达衣壳蛋白质基因之转基因甜瓜植物(在某 些情况下的原始转化株，T1和T2后代)的Southern印迹分析结 果：

T0：原始转化株；

T1：T1后代；

T2：T2后代；

A：品系88.105；

B：品系159.8；

NT：未转化对照组。

－图8显示对由pBIOS135转化的转基因甜瓜植物(原始转 化株)的Western印迹分析结果：

A、B、C、D和E：5个品系的原始转化株；

NT：未被转化的对照组；

R：用20ng CMV重新构建；

－图9表示在pBIOS135转化的品系中，随时间延长CMV症 状的发展情况：

D：天数；

无症状植物；

耐受性植物；

敏感性植物。

－图10表示在pBIOS135转化的品系中，随时间延长CMV 症状的发展情况：

D：天数

无症状植物

耐受性植物

敏感性植物。

下列实施例描述了含3或4个核酶的4种多核酶的构建，所述 核酶由24个碱基的榔头型保守序列(图1)和与不同大小的CMV (I17F毒株)衣壳蛋白质序列互补的臂。在这些实施例中显示的衣 壳蛋白核苷酸序列的编号与专利申请EP－A－0412912中的相 同。

这些核酶的每一种都裂解CMV衣壳蛋白质基因序列上的不 同GUC序列。图4中举例说明了这些构建体的结构：

－多核酶136：1074个碱基长，含有核酶A(位置84)和B(位 置108)及从中区缺失了一个G和一个A(位置20和21)的核酶C★ (位置204)，所述核酶由下列长度的互补臂包围：

·从5’末端到核酶A的82个核苷酸

·核酶A和B之间的22个核苷酸；

·核酶B和C★之间的94个核苷；

·从核酶C★到3’末端的803个核苷酸。

－多核酶161：1076个碱基后，与多核酶136相同，区别仅在 于核酶C在位置204有核酶C★中缺失的G和A。

－多核酶163：426个核苷酸长，含有由下列长度的互补臂包围 的3个核酶A(位置84)，B(位置108)和C(位置204)：

·从5’末端到核酶A的82个核苷酸；

·核酶A和B之间的22个核苷酸，

·核酶B和C之间的94个核苷酸；

·从核酶C到3’末端的153个核苷酸。

－多核酶165：1099个核苷酸长，含有由下列长度的互补臂包 围的4个核酶A(位置84)，B(位置108)，C(位置204)和E(位置 608)：

·从5’末端到核酶A的82个核苷酸；

·核酶A和B之间的22个核苷酸；

·核酶C和E之间的94个核苷酸；

·从核酶E到3’末端的399个核苷酸。

这些多核酶不含有对于其表达并整合到植物基因组中所需的 信号。必须将构成性或非构成性启动子(如病毒或细菌启动子如 NOS，或者植物启动子如Rubisco的启动子和遍在蛋白的启动子) 放在多核酶的5’末端，并且必须在3’末端放置poly(A)序列。可以 用在植物中有功能的适宜启动子；本发明人选择了得自花椰菜花 叶病毒(CaMV)的被人为是最强的构成性启动子的35S启动子。 多聚腺苷酸化信号poly(A)可以是来自CaMV35S基因，从植物 中分离的基因或者章鱼碱合成酶的基因；本发明人选择了得自胭 脂碱合成酶(tnos)基因的poly(A)信号。将构建的表达盒导入得自 pBI121载体的pBIOS4转化载体中，所述pBI121载体含有卡那 霉素抗性基因(编码新霉素磷酸－转移酶的基因neo)和编码葡糖 苷酸酶的iud A基因。遗传转化甜瓜子叶并再生转基因甜瓜植物的 方法与专利“转基因甜瓜”，No.EP－A－412912(BIOSEM)中描述 的相同。

实施例1；构建抗黄瓜花叶病毒株I17F衣壳蛋白质基因的核 酶：

噬菌粒蓝本(bluescribe)pBSIISK(SIRATAGENE)含有 与称为pBIOS113的CMV毒株I17F的RNA4互补的DNA(在 欧洲专利公开EP－A－0412912中描述了它的生产方法)，用其作 为构建不同核酶的起始点，用所述核酶得到抗不同CMV毒株的转 基因甜瓜。

衣壳蛋白质基因序列的不同位置导入卫星TobRV(烟草环斑 病毒)的催化位点。EP－A－0412912的图3中列出了与CMV毒 株I17F的RNA4(1007个碱基对长)互补的DNA序列；用氨基酸 序列显示编码衣壳蛋白质的部分。

由于Hasehoff和Gerlach描述的的“榔头”型核酶优先在 GUC单元的C后裂解，所以在衣壳蛋白质编码序列上选择4个位 置(图2)：

*位置A，核苷酸84，

*位置A，核苷酸108，

*位置C，核苷酸204

*位置E，核苷酸608

为了在这些位置导入通常称为“榔头”的24碱基核酶，决定 使用KUNKEL研制的在单链DNA上诱变的方法(Proc.Nat. Acad，Sci.82：488－492)，该方法需要与被诱变DNA部分杂交的 并且在使用DNA聚合酶合成互补链时在3’末端作为引物的合 成的寡脱氧核糖核酸。从EUROGENTEC公司订购了下列4种寡 核苷酸： oligo A： 5′TCGACGGTTACCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACCAGCACTGGTTG 3′ oligo B： 5′CGGGAACCACCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACGCGGACGACG    3′ oligo C： 5′GTTAATAGTTGCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACGACCAGCTGC   3′ oligo E： 5′GAATACACGAGCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACGGCGTACTTTC  3′

用这4种寡核苷酸和购自BIORAD公司的定点诱变试剂盒 (日录号170－3576)，诱变由噬菌粒pBIOS113产生的单链DNA。 图3显示4种寡核苷酸与靶单链DNA的杂交，箭头指示DNA聚 合物对合成互补链的作用。分析转化大肠杆菌后得到的几个重组克 隆，首先用限制酶消化以检测一些片段大小的增加。借助从美 国Biochemicals公司购得的“seguenasek”盒变体II，使用22个碱 基的寡核苷酸，oligo No.13(位置53到74)对显然含3个催化位点 的克隆pBIOS116进行测序。结果表明催化位点A和B完全插入， 催化点C不完全插入。在位置20和21(G和A)发生两个碱基的缺 失。尽管Lamb和Hay(Journal of Cencral Virology，1990，71： 2257－2264)证明该位点对裂解没有影响，但决定在表达载体 pBIOS3(Perez al，Plant Mol，Biology 1989，13：365－373)中的 反方向上克隆约1100bp的DNA片段(1007bp＋21bp×2＋19bp＋ 在5’和3’的多接头相邻序列)，以研究在多核酶中存在无核酶活 性的非互补序列的影响。为此目的在得自PROMEGA BIOTECH 公司的质粒pGEH 72f(+)的KpnI－XbaI位点克隆pBIOS113的 KpnI－XbaI片段；这样在含催化位点的衣壳蛋白质序列的任一 侧都会含有BamHI位点。然后用BamHI消化所得的质粒pBIOS 151，将所研究的片段(多核酶136，图4)导入pBIOS3的BamHI 位点。筛选在反义方向上含有位于花椰菜花叶病毒强构成性启动子 和胭脂碱合成酶基因的终子止控制下之片段的重组克隆，称为 pBIOS125。

在二重载体pBIOS4的EcoRI位点处克隆含有处于上述转录 调节序列控制下之核酶(带2个功能催化位并缺失了一个的互补 片段)的该质粒之EcoRI片段。后者是载体pBI121(Jefferson et al，1987：EMBO Journal6：3901－3907)的衍生物，通过抑制位于 编码β－葡糖苷酸酶基因3’末端的EcoRI位点，而在同一基因的 5’末端设定一个EcoRI位点而修饰之。在无御能力的根瘤土壤根 菌RC58’3菌株的三亲接合后，在不同的转化实验中使用所得的 二元载体，pBIOS136，所述RC58’3菌株得自菌株C58’3( Muclineaux et al.，Plant Seience 63：237－245，1989)而且事实 上是抗利福霉素的自发突变体。

实施例2：构建抗黄瓜花叶病毒株I17F衣壳蛋白质基因的不 同核酶

鉴于实施例1中所述的多核酶136(图4)不含有针对位置608 的催化位点，而且针对位置204的是不完全的，故开始进一步的定 点诱变实验。为此目的，将所述质粒的EcoRI片数克隆到经EcoRI 消化的噬菌体M13mp18(得自PHARMACIA公司)中。确定充许 包裹含两个催化位衣壳蛋白基因编码链的重组噬菌体的特征， 并用它作为使用寡脱氧核糖核苷酸C和E(一起或分别地)进行新 的诱变实验的基体。按前文实施例所述步骤完成诱变，由于起始物 质是噬菌体，故单链基体的产率更高。用寡核苷酸No.13和19－ mer寡核苷酸(位置694到位置676)对不同重组克隆测序，后者得 以定序位置608处导入的催化位点。用含有与本发明一致之催化位 点的克隆构建二重载体pBIOS161，pBIOS163和pBIOS165(见图 4)。除pBIOS161含有未缺失的催化位点C外，二重载体pBIOS161 与pBIOS136完全相同。

对于编码核酶的与衣壳蛋白质基因的全序列杂交并含有三个 功能性催化位点A，B，C(对pBIOS161而言)或四个功能性催化 位点A，B，C，E(对pBIOS165而言)的基因而言，在纯化含35S启 动子、核酶、终止子NOS的EcoRI片段后，立即将所述基因克隆到 二重载体pBIOS4的EcoRI位点处。对于含3个催化位点A，B，C 并只与CMV之RNA45’末端的前360个碱基杂交的核酶而言( 就pBIOS163来说)，用限制酶HindIII消化后，缺失剩余的3’部 分(在衣壳蛋白质基因和该序列3’侧HindIII位点处且得自多接 头的位置361)。然后将该质粒缺失的EcoRI片段克隆于二重载体 pBIOS4的EcoRI位点上。

表达多核酶之甜瓜的转化和再生：

将后3个二重载体导入土壤杆菌中并按专利申请EP－A－ 0412912中所述方法用于转化。

实施例3；转基因植物的分子分析

Northern印迹分析

借助Northern印迹分析用pBIOS136转化后得到的甜瓜植物 (图5)。按照Chandlor等的(Plant Physiology(1983)74：47－54) 所述方法，从培养在温室中的转基因和未转基因植物的幼叶中提取 总RNA。

在1％变性琼脂糖凝胶中对其进行电脉分离，转移到Hybond C 上并与经由三重消化BamHI片段所得到的片段而构成的探针杂 交，所说的片段相当于衣壳蛋白质基因的完整互补片段，其携带有 3个核酶，其中两个是有功能活性的(多核酶136)。三重消化有利 于同源序列间的杂交并使之有可能得到更强的信号。

用亚甲兰着染膜以证实加于凝胶上的总量RNA的同质性和 RNA的质量。在转录水平上得到的初级转化株和相应的T1和T2 后代的结果示于图2中并显示：

－在所有得自被围化植物的样品中均观察到1.45kb的主转录 本，但阴性对照样品中则没有；

－依据初级转化株的不同，转录本的数目有相当大的变化。这 种变化可以解释为T－DNA和T－DNA的片段整合在植物基因 组的不同位点并因此而受到环境的影响所造成的。

－初级转化株的转录水平和它们的T1与T2后代的转录水平 间没有相关性。

Southern印迹分析

借助Southern印迹分析用pBIOS136或pBIOS135转化后得 到的甜瓜植物(图6和7)。按照Dellaporta等人(Plant Molecular Bioloygy Reporeter(1983)1；19－21)方法，从培养在温室中的转基 因(初级转化株，有些情况下使用T1和T2后代)以及非转基因植物 的幼叶中提取总DNA。因EcoRI(在pBIOS4中所研究基因之表达 盒的克隆位点)水解该DNA，在0.8％琼脂糖凝胶中电泳，转移到 Hybond N+上并与三个探针：基因nptII、三重消化的多核酶136( 参见Northern印迹分析)和基因gus杂交。

用pBIOS136 5次转化过程的结果(图6)表明：

－品系146.42：

在初级转化株146.42、其T1后代和T2后代的情况下，与3个 探针的杂交特征完全相同，此表明T－DNA的片段已没有分离， 并且可能有一个单一的座位。多核酶136的几个拷贝存在于植物 基因组中。事实上，可见到大小为1.75kb、4.4kb、8.3kb和8.8kb的 4个杂交带。1.75kb带相应于预期成对的理论大小的带(EcdRI，多 核酶)。4.4kb带与多核酶136和基因nptII杂交。此外，用EcoRI/ nwptII对进行分析并没有测出该带，这表明在植物基因组中存在 nptII基因的单一拷贝。8.3kb和8.8kb的带与多核酶136和gus 基因杂交。用EcoRI/gus对只测到这两个带，表明存在所有或部 分gus基因的两个拷贝。3个探针均与用XhoI消化之T0、T1和T2 的DNA杂交也提示存在一单一座位。

－品系146.34：

在初级转化株146.34和其T1后代的情况下，只有初极转化 株的某些杂交带仍存在于个别T1中，此结果进一步表明T－DNA 的某些片段已被除去。就EcoRI/多核酶136的分析来说，分子大 小为1.75kb、3kb和5.3kb的3个带对于T0和T1植物是共同的， 而另外3条大小为7.3kb、6.8kb和4.25kb的带则是T0的特征带。 这一结果表明在T1和T0植物中分别存在多核酶的3个和6个拷 贝。在nptII杂交中，于T0植物中检测到两条3kb和5.3kb的 EcoRI带，显示存在所有或部分nptII基因的两个拷贝。在T1基因 中只看到3kb的EcoRI带，表明存在nptII基因的单个拷贝。在 gus杂交中，于T0植物中发现有3条大小为4.25的、5.3kb和6. 8kbr EcoRI带，而T1后代中只存在5.3kb的带。这一结果揭示在 T0和T1植物中分别存在整个或部分gus基因的3个拷贝和1个 拷贝。再者，3个探针均与XhoI消化的T0和T1植物的DNA杂交 提示存在2个座位。

－品系146.30和146.28：

在初极转化株146.30和146.28以及它们的相应T1后代中， 观察到相似情况。

－品系141.1

在初极转化株141.1和其后代的情况下，杂交特征是相似的。 1.75的、10kb和10kb的EcoRI带分别揭示了与探针多核酶136、 nptII和gus的杂交。这表明存在有整合到植物基因组中的T－ DNA的单一拷贝。

最后，在对转化株146.42和其后代(T1和T2)以及转化株 141.1和其后代T1的分析中观察到了遗传稳定性。所研究的4条 泳道揭示了T－DNA或T－DNA片段的高拷贝数特征，而品系 141.1则只具有一个已整合的T－DNA拷贝。

此外，注意到在用pBIOS135转化的品系中也存在T－DNA 拷贝和/或T－DNA部分的拷贝(图7)。

Western印迹分析(比较分析)

借助Western印迹分析用含有衣壳蛋白质基因的表达盒的 PBIOS4转化的转基因甜瓜植物。BIOSEM的专利申请EP－A－ 0412912(1989年8月11日)详细描述了所使用的方法学和所得到 的结果。然而，应强调的是，衣壳蛋白质基因的表达水平占总蛋白 质含量的0.001％至0.4％不等。借助少数实例，图8说明了取决于 叶龄和对植物基因组的可能环境影响而造成的这种表达水平的变 化。

实施例4：由多核酶136和衣壳蛋白质特化的甜瓜对CMV的 抗性试验(比较试验)

使表达衣壳蛋白质基因或多核酶136之基因的转基因甜瓜植 物(基因型TEZIER10)自体受精或与基因型TEZIER10的未被 转化植物杂交。将得自这些自身受精的种子(T1代)和继后自体受 精的种子(T2代等)播种于人工气候室(以16小时光照周期变化的 气候小室)中。

在2至4片叶阶段，将用CMV毒株TL28感染之新鲜叶的粉 碎制剂机械接种到源于后代的23株植物上。

感染16天后(最佳时期)，估计症状(花叶病，叶片拆迭、黄化)。 将被感染的植物分成三类：

－没有症状的抗性植物(R)；

－有症状的敏感植物(S)；

－“恢复”的耐受植物(T)，即新生的叶发育没有症状，而老叶 表现有症状。

可以出现几次“恢复”循环。新生的健康叶是否变成新感染的叶 取决于气候条件。

“抗性型”植物包括没有症状的植物和耐受植物。

用于抗CMV抗性试验中的对照组包括：

－敏感对照组：TEZIER10和Vedrantais；

－至少有CMV、Virgos和Free Cucumber的三个隐性基因 的抗性对照组。

表达衣壳蛋白质基因之T1代甜瓜品系对CMV毒株TL28的 抗性：

表1中给出了所得的20个品系的结果并显示：

－用TL28感染导致3至30％没有症状的T1植物产生。接种 TL28的未转化的对照组TEZIER10产生0％没有症状的植物。 抗性对照组Virgos和Free Cucumber分别产生92％和100％无症 状植物，并且均没有显示任何耐受现象。

－恢复现象以高比例存在。所研究的14个品系显示没有较明 显比例(22至59％)的耐受性T1植物。

－抗性和耐受T1植物的百分比与衣壳蛋白质的表达水平向 没有相关性。事实上，例如品系159.8和164.2有相同的衣壳蛋白 质表达水平(0.01％)而表现出不同的抗性水平。159.8品系的T1 个体都是敏感性的，而在164.2品系中则26％是没有症状的且有 48％是耐受性的。

－经自体受精得到大多数表达衣壳蛋白质基因的品系。在接种 CMV的T1植物中，预期的衣壳蛋白质基因的理论频率为75％。抗 性型植物(没有症状和耐受性的)的百分比根据转基因品系的不同 而25％和82％间有所变化。

表1

表达衣壳蛋白质基因的T1代甜瓜植物

对CMV毒株TL28的抗性 品系        杂交      ％CP     ％R     ％T     ％S  88.105       I       0.01      3       22      75  131.6       BC       0.06      9        0      81  145.1        I                 4        0      96  145.2       BC       0.06     22       35      43  153.4        I       0.1       0       30      70  153.5        I       0.06     17       57      26  153.6        I       0.13     18       32      50  153.8        I       0.01     17       43      40  153.9        I       0.06     30       39      31  153.19       I       0.05     29       52      19  153.20       I       0.01     30       39      31  153.22       I       0.4      18       27      55  159.4       BC       0.002     0        0     100  159.8        I       0.01      0        0     100  164.2        I       0.01     26       48      26  164.23      BC       0.01     30       35      35  166.5        I                23       55      22  166.10       I                23       59      18  170.5       BC       0.3       9        0      91  171.7        I                 9        0      91  TEZIER 10                      0        0     100  VEDRANTAIS                     0        0     100  VIRGOS                        92        0       8  FREECUCUMBER                 100        0       0 说明：

I：自体受精

BC：与未被转化的基因型TEZIER 10杂交

％CP；作为可溶性总蛋白质百分比的衣壳蛋白质表达水平

％R：抗性植物或没有证状植物的百分比

％T：耐受性植物的百分比

％S：敏感植物的百分比

*表达多核酶136的T1代中甜瓜植物对CMV毒株TL28的 抗性

表2中给出了所得到的13个品系的结果并显示：

－在10个品系的病例中，因TL28感染后30％至87％的T1 个体没有症状；

－“恢复”现象很少存在。只有4个品系显示有耐受性T1植 物，范围达9％至26％。

经与未被转化的品系TZ10杂交得到大多数表达多核酶136 的品系。在接种CMV的T1植物中，预期的多核酶的理论频率为 50％。根据转基因品系的不同。“抗性型”植物的百分比在30％至 65％之间不等。

最后，在使用“核酶”战略的情况下，较大数目的T1代的品系没 有症状并有很少的耐受性植物。

表2

表达多核酶136的T1代甜瓜植物对CMV毒株TL28的抗性     品系    杂交    ％R    ％T    ％S     141.1    BC     48     9      43     141.2    BC     39     26     35     141.3    BC     43     17     40     141.4    BC     26     26     48     141.5    BC     52     0      48     141.6    BC     39     0      61     146.19   BC     30     0      70     146.28   BC     47     0      53     146.42    I     87     0      13     146.47   BC     43     0      57  TEZIER 10           0     0     100  VEDRANTAIS          0     0     100  VIRGOS             92     0       8  FREECUCUMBER      100     0       0

说明：

I：自身受精

BC：与未被转化的基因型TEZIER 10杂交

％R：抗性植物或没有症状植物的百分比

％T：耐受性植物的百分比

％S：敏感性植物的百分比

*对CMV毒株TL28的抗性和借助对某些系的GUS试验估 计分离的试验总结

表3中给出的结果显示：

－产生两个品系(品系88.105和153.8)的表达衣壳蛋白质基 因的抗性型植物(没有症状的植物和耐受植物)，以及一个表达多 核酶136(品系146.42)的完全抗性品系(没有症状的植物)；

－产生两个表达多核酶136(品系141.1和146.28)的耐性品 系(耐性植物)。

表3

对CMV毒株TL28的抗性试验和GUS基因及抗性基因在后 代中的行为  品系        X  GBN        分子特征   ％G            R            T             S   ％H  ％G       OT病毒   ％T  ％G      OT病毒   ％S  ％G       OT病毒  88.105         T0         K+CP+G+   702        I  T1         K+CP+G+   710        I  T2         K+CP+G+   153.8         T0          K+CP+G+   740        I  T1          K+CP+G+   545        I  T2          K+CP+G+   159.8         T0          K+CP+G   739.1      I  T1          K+CP+G    80   100    73   100     0     3    100      0.78                  +/-0.02     12    100     0.56                  +/-0.10     50    100     0.69                  +/-0.56   22  100        1.46                +/-0.39  100  100        0.71                +/-0.11   43  100        0.85                +/-0.10   50  100        0.92                +/-0.57    75    53        1.42                  +/-0.26    45    58        0.94                  +/-0.17   100     0        1.42                  +/-0.27   141.1         T0          K+RZ+G+   730.1     BC  T1          K+RZ+G+   146.28        T0          K+RZ+G+   734.1     BC  T1          K+RZ+G+   539.2      I  T2          K+RZ+G+   146.31        T0          K+RZ+G+   735.1     BC  T1          K+RZ+G+   146.42        T0          K+RZ+G+   755.1      I  T1          K+RZ+G+   540        I  T2          K+RZ+G+    57    73    68     0    77    82    79    100       0.42                  +/-0.22    90    100       0.45                  +/-0.30   40  100        0.88                 +/0.21   37  100        1.00                +/-0.25    60     19       1.05                  +/-0.17   100     73       1.96                  +/-0.48    63     53       1.64                  +/-0.42   100      0       1.64                  +/-0.46    21      0       1.75                  +/-0.37    10      0       1.52                  +/-0.65  TEZIER 10  VEDRANTAIS  VRGOS  FREE CUCUMBER     0     0     96             0.05                  +/-0.02     100           0.21                  +/-0.10     0     0     4     0    100             1.70                   +/0.77    100             1.70                  +/-0.72     0     0 说明：

X：杂交的类型；I：自体受精；BC：与未被转化的基因型 TEZIER 10杂交

GEN：代；T0：初始转化株；T1：No.1代；

T2：No.2代

K：nptII基因，CP：衣壳蛋白质基因；RZ：多核酶136；G：gus基 因

+：存在；-：不存在；QT：数量

％G：表达gus基因之植物的百分比

％R：抗性植物或没有症状植物的百分比

％T；耐性植物的百分比

％S：敏感性植物的百分比

1)对各品系的遗传学研究：

能够根据gus基因的表达水平确定分离的类型和纯合性状态。

就88.105和153.8两个品系来说，在自体受精得到的T1代 中gus基因的表达水平分别是80％和73％。这表明在单一座位有 T－DNA整合之显性基因的孟德尔型分离(3∶1)。分子分析已显 示存在被整合到植物基因组中的单一拷贝。

此外，两个品系的T2代中gus基因的表达水平均为100％，从 而进一步证实被整合基因的纯合性状态。

就品系146.42来说，在自体受精得到的T1代中gus基因的表 达水平为77％，此表明在单一座位有T－DNA整合之显性基因 的孟德尔型分离。分子分析已显示在植物基因组的单一座位存在几 个T－DNA和/或T－DNA片段。

再者，在T2代中gus基因的表达水平为90％：这一事实强调， 对于被整合的基因所试验的品系不是纯合的(表3)。就品系146.42 来说，在T3中得到纯合性。对于品系141.1，在与未被转化的 TEZIER10基因型杂交后得到的T1代中，gus基因的表达水平为 57％。这一事实也与在单一座位有T－DNA整合的显性基因的孟 德尔型分离(1∶1)相符。分子分析已显示被整合到植物基因组中 的单一T－DNA的存在。

就品系146.28来说，在与未被转化的TEZIER10基因型杂交 后得到的T1代中，gus基因的表达水平为73％。这一事实表明在几 个座位有T－DNA整合的显性基因的分离。分子分析已显示在植 物基因组的两个座位上存在几个T－DNA或T－DNA片段。

2)针对病毒的行为：

所有抗性型植物都表达gus基因。某些敏感植物表达gus基因 (表3)。

就品系88.105来说，在自体受精后的T1代中得到25％的抗 性型植物和75％的敏感植物。这表明对抗性基因之隐性基因的孟 德尔型分离(1∶3)。

就品系153.8来说，在自体受精的T1代中得到55％的抗性型 植物和45％敏感植物。根据这一事实难以对抗性基因的行为作出 结论。

就品系141.1来说，在与未被转化的TEZIER10基因型杂交 的T1代中，得到40％的耐受植物和60％的敏感植物。这一结果表 明对抗性基因之显性基因的孟德尔型分离(1∶1)。因此多核酶136 的行为相似于gus基因的行为。

就品系146.42来说，经自体受精后产生的T1代中，得到79％ 没有症状的植物和21％敏感植物。这一结果暗示对抗性基因之显 性基因的孟德尔型分离(3∶1)。因此多核酶136的行为相似于gus 基因的行为。

3)估计病毒的量：

用ELISA检测法测定的病毒量在没有症状植物中相当低；但 还比Free Cucumber抗生对照植物中高些(表10)。

耐受植物含有可估计量的病毒。

敏感植物具有很高量的病毒。

表达多核酶的植物(品系146.42，T2和T3)比表达衣壳蛋白质 的抗性型植物(系153.8，T2)含有较小量的病毒。

虽然在所测得的病毒量与症状严重程度间有着相当好的相关 性。

4)随时间CMV引起的症状的发展

用CMV毒株TL28感染图1和2中所示品系的植物。接种后 第6、8、12、14、16和19天记录症状。结果以直方图形式给出(图9 和10)。

16天后得到的值没有显示进一步的变化。就“衣壳蛋白质”品 系来说，注意到无症状植物的数目有可波动的迅速减少趋势有利 于有症状植物的出现。就品系88.105和153.8来说(T1代)，分别 在第16天和14天增加了以“恢复”现象为特征的耐性植物。此 外，在品系88.105的T2代中，在第8天100％无症状的植物转变 为100％耐受植物并直到第19天仍继续存在(图9)。

这种无症状植物突然变成耐受植物的现象可解释为气候条件 的显著影响。

在品系153.8的T2代中，注意到耐受植物的逐渐出现。从第 16天以后，有50％的T2植物无症状并有50％植物是耐受性的。

就“多核酶”品系来说，在品系141.1和146.28中强调无症状 T1植物数目的减少有利于有症状植物(图10)。

此外，就品系141.1来说，从第16天后记录到40％的耐受性 T1植物。在品系146.28中，从D14天有耐受性T2植物发育并且在 第16天达到26％。

再者，在品系146.42中，在第6天出现80％的没有症状的T1 植物，并且随时间进程仍几乎保持在稳定水平(第8、12和14天为 78％，第16天为79％)。

品系146.42的T2植物表现有相似的行为。这一结果显示出该 系的很高的抗性水平并后代中抗性基因的稳定性。

最后，得到两个表达衣壳蛋白质基因的“抗性”型的品系，以及 一个表达多核酶136完全抗性品系。就两个表达衣壳蛋白质基因 的品系来说，所观察到的抗性与完全抗性相比更相似于耐受性。 带实上，在某些条件下，有些病毒感染的表现严重症状的植物能够 发育新的健康叶。

就表达多核酶136的完全抗性品系来说，没有观察到耐受现 象。就两个表达衣壳蛋白质的品系来说，在抗性植物中观察到相对 大量的病毒，对在表达多核酶136的抗性植物中病毒的量几乎是 与Free Cucumber抗性对照植物是同样的。

实施例5：表达多核酶165的T1代甜瓜品系对CMV毒株 TL28感染的抗性。

就表达多核酶165的13个T1品系所得到的结果示于表4中 并表明：

－被TL28感染后，12个品系的15％至100％和T1个体没有 症状；

－只轻微地存在“恢复”现象。只有5个品系有6％至60％的 T1耐受植物。

经自体受精已得到了大部分表达多核酶的品系。在接种CMV 的T1植物中，多核酶165的理论频率为75％。根据转基因系的不 同，“抗性型”植物的百分比为15％至100％。

最后，同表达多核酶136的品系一样，大多数表达多核酶165 的品系没有症状并且只有很少的耐受植物。多核酶165不同于多核 酶136在于有两个附加的功能性核酶。就对CMV感染的抗性来 说，两种构建得到了相似的结果。

表4

表达多核酶165的T1代甜瓜植物对CMV毒株TL28感染的 抗性     品系    杂交    ％R    ％T    ％S     10.2     I       100    0       0     203.6    BC       0     0      100     205.1    I        50   45       5     205.3    I        66    0       34     206.1    I        94    6       0     207.3    I        61    0       39     207.5    I        80    0       20     207.7    I        64    0       36     207.8    I        69    9       22     207.9    I       100    0        0     211.1    I        15    0       85     212.1    I        87    13       0     215.1    I        20    60      20  VEDRANTAIS           0     0      100   VIRGOS             100    0        0    FREE              100    0        0  CUCUMBER 说明：

I：自体受精

BC：与未被转染的TELIZIER10基因型杂交

％R：抗性植物或无症状植物的百分比

％T：耐受植物的百分比

％S：敏感植物的百分比