上皮细胞活性肽复合物纳米微脂囊的应用及其备制
专利汇可以提供上皮细胞活性肽复合物纳米微脂囊的应用及其备制专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种 冷冻干燥 法制备的上皮细胞活性肽(hEGF)，与番茄红素 树脂 、 牛 至精油等形成复合物，利用逆相 蒸发 －冷冻干燥法制备上皮细胞活性肽复合纳米微脂囊，粒径为30～80纳米。公开了上皮细胞活性肽复合物纳米微脂囊的制备方法，以其在 化妆品 、 皮肤 修复剂中的应用。本发明的上皮细胞活性肽复合物纳米微脂囊基于纳米定向皮肤、组织渗透技术，实现上皮细胞活性肽活性成份快速、稳定、较长时间渗透至皮肤组织基底层，达到显著的皮肤、组织修复效果，增强皮肤、组织细胞抗 氧 化作用，维持组织细胞增值，细胞分化、生长作用，可起到祛斑、防止皮肤光老化的效果。可提供一种因多种原因引起的皮肤、组织损害修复、防皱减斑的 生物 化妆品。，下面是上皮细胞活性肽复合物纳米微脂囊的应用及其备制专利的具体信息内容。
1.本发明公开了一种上皮细胞活性肽复合物纳米微脂囊的应用及其备制，其特征在于，利用逆相蒸发-冷冻干燥法制备上皮细胞活性肽，与番茄红素树脂、薰衣草精油、牛至精油复合形成微脂囊至少一种形成复合物柔性纳米微脂囊，考察其包封率或载药量、变形性及稳定性；上皮细胞活性肽复合物纳米微脂囊为多室脂质体。所述的微脂囊其平均粒径为(78.86±4.32)nm，Zeta电位为(61.22±7.62)mV，包覆率可以为80.2～90.0％，载药量可以为22.0～26.0％。上皮细胞活性肽复合物纳米微脂囊柔性纳米脂质体具有较高的稳定性。
含量测定方法简单、可靠，稳定性和变形性高，可能成为透过皮肤屏障转运的有效载体。番茄红素通过清道夫受体B类1型蛋白(SR－B1)的转运被人体吸收，到达各种靶器官，抑制氧化应激、维持线粒体功能、抗细胞凋亡。所述的上皮细胞活性肽复合物由上皮细胞活性肽、番茄红素树脂、薰衣草精油、牛至精油复合而成：
上皮细胞活性肽10μg/L 20～30份、亚麻籽油番茄红素570mg/L 10～15份、薰衣草精油
3～10份、牛至精油3～10份。
2.根据权利要求1所述的上皮细胞活性肽复合物纳米微脂囊，其特征在于，上皮细胞活性肽复合物由以下质量份的物质复合而成：
上皮细胞活性肽30份、番茄红素树脂15份、薰衣草精油6、牛至精油6份。
3.根据权利要求1～2中任一项所述的上皮细胞活性肽复合物纳米微脂囊，其特征在于，所述的微脂囊的包覆率为80.2～90.0％，载药量为22.0～26.0％。
4.权利要求3所述的上皮细胞活性肽复合物纳米微脂囊的制备方法，其特征包括以下步骤：
(1)用公开的方法获取上皮细胞活性肽：小分子细胞活性物质成为细胞活性转移因子。
大分子细胞活性物质为大分子细胞活性因子。分离培养上皮细胞；收获上皮细胞培养液：用相应的培养基和因子培养细胞生长到一定阶段，取上清液；可多次传代收获。上皮细胞活性肽获取后：
①透析提取小分子上皮细胞活性肽，将上皮细胞裂解物适当处理后，装入透析袋或玻璃透析装置内，在一定温度下透析，12-30h收取透析液。
②中空纤维柱分离提取上皮细胞活性肽将上皮细胞裂解物经处理后，用分子截留孔径(如0.2KD、5KD、10KD、15KD等)的中空纤维柱分离截取上皮细胞活性肽，按分子量不同区分转移因子和活性因子。
③离子交换器和层析提取上皮细胞活性肽。
(2)鉴定①蛋白质浓度鉴定；②核糖和多核苷酸的浓度鉴定；③蛋白质和核酸类物质鉴定；④上皮细胞活性肽鉴定。
(3)上皮细胞活性肽含量检测[酶联免疫吸附法(ELISA)]：分别配制质量浓度为15，30，
50，100，200，300，400，500ng/mL的上皮细胞活性肽系列溶液，以0.2％聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)破坏脂质膜的空白柔性纳米微脂囊做空白对照，按照EGF-ELISA检测试剂盒说明书的方法和步骤检测样品，以样品中上皮细胞活性肽的质量浓度(X)为横坐标、检测的OD值(Y)为纵坐标，采用四参数回归方法进行运算，得回归方程Y＝(A-D)/[1+(X/C)^B]+D，以检测样品中神经干细胞活性因子的含量。
(4)亚麻籽油提取番茄红素树脂：22％番茄固体物：亚麻籽油按1:1用微波萃取法制成
570mg/L番茄红素的亚麻籽番茄油；
(5)蒸馏方法提取薰衣草精油；
(6)蒸馏方法提取牛至精油；
(7)上皮细胞活性肽复合物纳米微脂囊(逆相蒸发－冷冻干燥法)制备：精密称取大豆磷脂、胆固醇和维生素E，置瓶中，加入适量氯仿(含1％无水乙醇)，于4℃水浴中溶解脂质。
取甘露醇、胆酸钠和上皮细胞活性肽溶解于4℃磷酸盐缓冲液(PBS)(pH＝7.4)溶液中。脂质溶解后，将PBS溶液倒入脂质溶液中，在水浴式超声仪中(低于10℃)超声10min(超10s，停
5s)，形成均匀乳液。室温下放置30min。将溶液于旋转蒸发仪上减压蒸发(负压0.07MPa，转速500r/min)，形成水相脂质体混悬液后，继续蒸发15min，以彻底去除有机溶剂。再在水浴式超声仪中(低于10℃)超声10min(超声10s，停5s)。将脂质体混悬液转移高压均质挤出机中，高压均质3次，再通过0.1μm微孔滤膜挤出10次后，－40℃预冻24h后，于冷冻干燥机中制备成冻干粉末。
(8)上皮细胞活性肽复合物纳米微脂囊分离采用由Fry等提出的交联葡聚糖-50(Sephadex G－50)微柱离心法分离柔性纳米微脂囊和游离神经干细胞活性因子。将交联葡聚糖－50用适量PBS溶液浸泡24h后装柱，以3000r/min离心3min以去除其中多余的PBS，先用不含上皮细胞活性肽复合物的空白柔性纳米微脂囊0.25mL过柱，然后向柱中加入0.25mL上皮细胞活性肽复合物柔性纳米微脂囊混悬液，离心，收集离心液，微脂囊就和仍然滞留于柱中的游离药物分离。
(9)观察形态；柔性纳米微脂囊径1.0％磷钨酸负染，将柔性纳米微脂囊用PBS缓冲液稀释10倍，在室温下用粒径和电位分析仪测定其粒径和电位；包封率(EE)采用以下公式计算:
EE(％)＝柔性纳米脂质体EGF含量/柔性纳米脂质体混悬液中EGF总含量×100％；载药量:
取上皮细胞活性肽复合物冻干微脂囊1mg置5mL容量瓶中，加入0.2mL10％TritonX-100，加PBS至刻度，测定总上皮细胞活性肽复合物量；冻干微脂囊载药量＝上皮细胞活性肽复合物的量/1mg×100％。本方法所制备的上皮细胞活性肽复合物柔性纳米微脂囊应为多室脂质体。其平均粒径为(78.86±4.32)nm，Zeta电位为(61.22±7.62)mV，包覆率可以为80.2～
90.0％，载药量可以为22.0～26.0％。
(10)变形性测定：取1mL一次性注射器，分别加入1mL蒸馏水、上皮细胞活性肽复合物柔性纳米微脂囊及上皮细胞活性肽复合物普通脂质体，分别外加0.1，0.2，0.3，0.4和0.5MPa压力，计算样品完全通过100nm一次性微孔滤膜的时间，计算样品通过时间与蒸馏水通过时间之比，以测定柔性纳米微脂囊的变形性，相比，上皮细胞活性肽复合物柔性纳米微脂囊应具有极显著的变形性。
(11)稳定性鉴定：取3批上皮细胞活性肽微脂囊复合物混悬液、上皮细胞活性肽复合物冻干粉及上皮细胞活性肽复合物微脂囊冻干粉冻干粉，分别置室温25℃、4℃条件下，于0，
3m测定其包封率、载药量、pH、粒径和Zeta电位，并观察外观，以确定其稳定性。
5.根据权利要求4所述的上皮细胞活性肽复合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)用公开的方法获取上皮细胞分离培养上皮细胞，收获上皮细胞培养液：上皮细胞活性肽分离、备制、鉴定(①蛋白质浓度鉴定；②核糖和多核苷酸的浓度鉴定；③蛋白质和核酸类物质鉴定；④上皮细胞活性肽活性物质生物活性鉴定。
6.根据权利要求5所述的上皮细胞活性肽复合物纳米微脂囊的制备方法，其特征在于，步骤(7)中所述的一种公开方法，上皮细胞活性肽复合物纳米微脂囊(逆相蒸发-冷冻干燥法)制备：精密称取大豆磷脂、胆固醇和维生素E，置梨形瓶中，加入适量氯仿(含1％无水乙醇)，于4℃水浴中溶解脂质。取甘露醇、胆酸钠和上皮细胞活性肽溶解于4℃PBS(pH＝7.4)溶液中。脂质溶解后，将PBS溶液倒入脂质溶液中，在水浴式超声仪中(低于10℃)超声10min(超声10s，停5s)，形成均匀溶液。室温下放置30min。将溶液于旋转蒸发仪上减压蒸发(负压
0.07MPa，转速500r/min)，形成水相脂质体混悬液后，继续蒸发15min，以彻底去除有机溶剂。再在水浴式超声仪中(低于10℃)超声10min(超声10s，停5s)。将脂质体混悬液转移高压均质挤出机中，高压均质3次，再通过0.1μm微孔滤膜挤1次后，-40℃预冻24h后，于冷冻干燥机中制备成冻干粉末。
7.权利要求6所述的上皮细胞活性肽复合物纳米微脂囊的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的上皮细胞活性肽复合物含量检测[酶联免疫吸附法(ELISA)]：使其分别配制质量浓度为15，30，50，100，200，300，400，500ng/mL的上皮细胞活性肽复合物系列溶液，以0.2％TritonX-100破坏脂质膜的空白柔性纳米脂质体做空白对照，按照EGF-ELISA检测试剂盒说明书的方法和步骤检测样品，以样品中上皮细胞活性肽复合物的质量浓度(X)为横坐标、检测的OD值(Y)为纵坐标，采用四参数回归方法进行运算，得回归方程Y＝(A-D)/[1+(X/C)^B]+D，以检测样品中上皮细胞活性肽复合物的含量。
8.权利要求7所述的上皮细胞活性肽复合物纳米微脂囊的制备方法，其特征在于，步骤(8)所述的上皮细胞活性肽复合物纳米微脂囊分离采用交联葡聚糖-50(SephadexG–50)微柱离心法分离柔性纳米微脂囊和游离上皮细胞活性肽。将Sephadex G-50用适量PBS溶液浸
24h后装柱，以3000r/min离心3min以去除其中多余的PBS，先用不含上皮细胞活性肽复合物的空白柔性纳米微脂囊0.25mL过柱，然后向柱中加入0.25mL上皮细胞活性肽复合物柔性纳米微脂囊混悬液，离心，收集离心液，微脂囊就和仍然滞留于柱中的游离药物分离。
9.权利要求8所述的上皮细胞活性肽复合物纳米微脂囊的制备方法，其特征在于，步骤(9)所述的观察其形态；用柔性纳米微脂囊径1.0％磷钨酸负染，将柔性纳米微脂囊用PBS缓冲液稀释10倍，在室温下用粒径和电位分析仪测定其粒径和电位；包封率(EE)采用以下公式计算:EE(％)＝柔性纳米脂质体EGF含量/柔性纳米脂质体混悬液中上皮细胞活性肽复合物总含量×100％；载药量:取上皮细胞活性肽复合物冻干微脂囊1mg置5mL容量瓶中，加入
0.2mL10％TritonX-100，加PBS至刻度，测定总上皮细胞活性肽复合物量；冻干微脂囊载药量＝上皮细胞活性肽复合物的量/1mg×100％。本方法所制备的上皮细胞活性肽复合物柔性纳米微脂囊应为多室脂质体。其平均粒径应为(80.66±3.86)nm，Zeta电位为(61.22±
7.62)mV，平均包封率为(37.86±4.77)％；平均载药量为(6.58±1.27)％。
10.权利要求9所述的上皮细胞活性肽复合物纳米微脂囊的制备方法，其特征在于，步骤(10)所述的变形性测定：取1mL一次性注射器，分别加入1mL蒸馏水、上皮细胞活性肽复合物柔性纳米微脂囊及上皮细胞活性肽复合物普通脂质体，分别外加0.1，0.2，0.3，0.4和
0.5MPa压力，计算样品完全通过100nm一次性微孔滤膜的时间，计算样品通过时间与蒸馏水通过时间之比，以测定柔性纳米微脂囊的变形性，相比，上皮细胞活性肽复合物柔性纳米微脂囊应具有极显著的变形性。
11.权利要求10所述的上皮细胞活性肽复合物纳米微脂囊的制备方法，其特征在于，步骤(11)的稳定性鉴定：取3批上皮细胞活性肽微脂囊复合物混悬液、上皮细胞活性肽复合物冻干粉及上皮细胞活性肽复合物微脂囊冻干粉冻干粉，分别置室温25℃、4℃条件下，于0，
3m测定其包封率、载药量、pH、粒径和Zeta电位，并观察外观，以确定其稳定性。
12.权利要求1所述的上皮细胞活性肽复合物纳米微脂囊制备的上皮细胞活性肽复合物在医疗及化妆品领域中的应用。
上皮细胞活性肽复合物纳米微脂囊的应用及其备制
技术领域
背景技术
表皮组织在受到伤害后一般都能自行修复。但受到某些疾病、因素、自身基因的影响，阻碍了表皮细胞的分化、增殖，导致细胞组织长久不能修复、异常增殖或老化、变性(老年斑、淀粉样蛋白(Aβ)介导)。基于人表皮活性因子的这些生物特性，hEGF已广泛应用于医学临床领域，除了烧伤、烫伤、胃肠道的修复以外，还主要用于促进表皮的修复和再生，用于术后皮肤伤口的愈合、激光的伤口愈合、皮肤溃疡的愈合；上皮细胞活性肽复合物纳米微脂囊是将其活性物质包裹在类脂物质(黄豆卵磷脂)中的一种微小且空心的球状物质，其直径革命性地比传统护肤品缩小1000倍(以纳米为计算单位)，便可以轻易穿透毛孔和角质层细胞的间隙，进入皮肤深层，顺利把hEGF、番茄红素树脂等有效成分送到真皮层和基底层，发挥其修复上皮组织、抑制淀粉样蛋白(Aβ)介导的氧化应激和细胞凋亡的作用。具有护肤、修复、抗皱、抗衰、美白、防晒和晒后修复、抑制粉刺和痤疮、消斑等作用。
本发明的第三个目的在于提供上述上皮细胞活性肽复合物纳米微脂囊应用，以解决上述技术问题中的至少一个方面。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种上皮细胞活性肽复合物纳米微脂囊，主要利用逆相蒸发-冷冻干燥法制备神经干细胞活性因子复合柔性纳米微脂囊，微脂囊其其平均粒径应为(80.66±3.86)nm，Zeta电位为(61.22± 7.62)mV，平均包封率为(37.86±
4.77)％；平均载药量为(6.58±1.27)％。所述的上皮细胞活性肽复合物至少有以下一种成分组成：上皮细胞活性肽、番茄红素树脂、薰衣草精油、牛至精油复合而成：上皮细胞活性肽
10μg/L 20～30份、亚麻籽油番茄红素10～15份、薰衣草精油3～10份、牛至精油3～10份。
(2)上皮细胞活性肽系由多个氨基酸组成的多肽，其纳米微脂囊深入皮肤组织内，可促进细胞增殖、分裂，启动创伤修复过程，刺激内皮细胞、角化细胞、平滑肌细胞生成，促进透明质酸、糖蛋白、纤维连接蛋白等细胞外基质合成，增加皮肤血流量，改善其微循环，为表皮细胞修复创造良好的环境，避免代谢产物聚集，影响创面修复。
(3)通过微脂囊包覆技术将上皮细胞活性肽复合物纳米微脂囊活性成分包覆形成纳米级的微脂囊，一方面可以提高上皮细胞活性肽复合物的稳定性，使其具有长效持久的缓释功能，维持上皮细胞活性存在、促进上皮细胞分化、决定轴突生长方向、诱导突起生长；另一方面，在确保不破坏上皮细胞的前提下，将上皮细胞活性肽采用微脂囊包覆技术包覆形成微脂囊后，能提高上皮细胞活性肽复合物成分的相容性，使其更加方便地应用于制剂中。
(4)纳米微脂囊由于粒径处于纳米级范围，具有突出的纳米效应，即小尺寸效应和表面效应。小尺寸效应意味着其穿透生理组织、皮肤屏障能力很强，渗透力增强，可有效携带上皮细胞活性肽活性物质轻易穿透皮肤和基底组织，可增加皮肤羟脯氨酸表达，促进胶原合成，刺激表皮细胞增殖，提高其修复速率。。
(5)选择微脂囊混悬液、脂质体冻干粉和上皮细胞活性肽冻干粉。制备成脂质体或冻干粉末，都可提高其稳定性。
(6)在原料方面，所使用的亚麻籽油番茄红素树脂、薰衣草精油、牛至精油高抗氧化复合物活性成分均为纯天然植物提取物，牛至除抗氧化作用外，还是天然防腐剂，从而保证了原料的高效、无毒、防腐、安全；增加上皮细胞活性肽稳定性和互补性。
(7)在一些具体的实施方式中，微脂囊的包覆率可以为78.2～90.0％，载药量可以为
20.0～25.0％。由此，可以使得微脂囊的上皮细胞再生效果更佳。
(2)采用逆相蒸发－冷冻干燥法制备上皮细胞活性肽复合物纳米微脂囊；
(3)进行上皮细胞活性肽含量检测[酶联免疫吸附法(ELISA)]；
(4)采用由Fry等提出的SephadexG－50微柱离心法分离柔性纳米脂囊和游离上皮细胞活性肽；
(7)精确观察其形态；
(8)精确测定变形性：
(9)严格稳定性鉴定：
本发明的制备上皮细胞活性肽复合物纳米微脂囊的方法，采用特定的加入顺序，不仅可以保证上皮细胞活性肽复合物的复合结构，还可以使得绝大部分上皮细胞活性肽复合物被包裹，减少浪费高效利用。
根据本发明的又一方面，还提供了上述上皮细胞活性肽复合物纳米微脂囊在化妆品、医疗上的应用。将本发明的上皮细胞活性肽复合物纳米微脂囊添加多种化妆品(霜剂、膏剂、喷剂、面膜)、医用生物制剂中，一般按生物制剂总质量的20％～30％来添加，可以制成注射剂、口服剂、外用喷剂(涂抹膏、霜剂)等类型的生物制剂。
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