用于增加植物中的氮使用效率和/或氮利用效率的方法
阅读：130发布：2020-05-14
专利汇可以提供用于增加植物中的氮使用效率和/或氮利用效率的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供用于增加 植物 中的氮使用效率和/或氮利用效率的方法，其包括通过增加所述植物中乙烯依赖的向地性 缺陷 的黄绿蛋白(EGY)的活性或表达修饰所述植物。，下面是用于增加植物中的氮使用效率和/或氮利用效率的方法专利的具体信息内容。
1.用于增加植物中的氮使用效率和/或氮利用效率的方法，其包括通过增加所述植物中乙烯依赖的向地性缺陷的黄绿蛋白(EGY)的活性或表达修饰所述植物。
2.植物中增加的编码EGY蛋白的多核苷酸的表达或增加的EGY蛋白的活性用于增加植物中的氮使用效率和/或氮利用效率的用途。
3.权利要求1的方法或权利要求2的用途，其中EGY蛋白在所述植物叶中过表达。
4.前述权利要求中任一项的方法或用途，包括在植物内表达包含编码EGY多肽的核酸序列的多核苷酸(例如外源性多核苷酸)。
5.权利要求4的方法或用途，其中所述多核苷酸(例如外源性多核苷酸)包含编码EGY多肽的核酸序列，所述核酸序列与用于指导所述核酸序列在所述植物中转录的异源启动子操作性连接。
6.权利要求5的方法或用途，其中所述启动子为叶特异性或叶优选的启动子。
7.前述权利要求中任一项的方法或用途，其中所述植物为作物植物，例如，果实作物、种子作物、豆类或坚果作物。
8.前述权利要求中任一项的方法或用途，其中所述方法或用途用于在烟草植物中减少至少一种烟草特异性亚硝胺(TSNA)或其前体(例如叶硝酸盐)的水平。
9.用于产生具有减少的至少一种TSNA或其前体的烟草植物、烟草植物繁殖材料、烟草叶、切割的收获的烟草叶、处理的烟草叶或切割和处理的烟草叶的方法，所述方法包括修饰所述烟草植物以在所述植物中增加EGY基因的表达或增加EGY蛋白的活性。
10.权利要求8或9的方法或用途，其中当与未经修饰以增加所述植物中EGY基因的表达或增加EGY蛋白的活性的烟草植物相比时至少一种TSNA或其前体减少。
11.权利要求8-10中任一项的方法或用途，其中TSNA为烟碱衍生的亚硝胺酮(NNK)、亚硝基去甲烟碱(NNN)、亚硝基新烟草碱(NAT)或N-亚硝基新烟碱(NAB)。
12.前述权利要求中任一项的方法或用途，其中所述植物来自物种普通烟草
(Nicotiana tabacum)或黄花烟草(Nicotiana rustica)。
13.前述权利要求中任一项的方法或用途，其中编码所述EGY多肽的多核苷酸：
a. 编码具有下列保守残基的EGY多肽：包含Gly-176、Asn-177、Leu-178和Arg-179的GNLR基序；包含His-311、Glu-312、X-313、X-314和His-311的HEXXH基序；和包含Asn-441、X-
442、X-443、Pro-444、X-445、X-446、X-447、Leu-448、Asp-449和Gly-450的NXXPXXXLDG基序；
其中X为任何氨基酸并且其中保守残基的编号意指EGY蛋白与具有SEQ ID NO: 1的拟南芥(Arabidopsis thaliana) EGY1蛋白比对时的有效等效位置；或
b. 包含编码如SEQ ID NO: 2或3所示的多肽或其功能片段或与SEQ ID NO: 2或3或其功能片段具有至少70%序列同一性的序列的多核苷酸序列；或
c. 包含如SEQ ID NO: 4、5、21或22所示的多核苷酸序列或与SEQ ID NO: 4、5、21或22具有至少70%序列同一性的多核苷酸序列；或
d. 包含可与如以上a.、b.或c.中所定义的多核苷酸杂交的多核苷酸序列。
14.前述权利要求中任一项的方法或用途，其中由EGY基因或编码所述EGY多肽的核酸序列所编码的多肽包含如SEQ ID NO: 2或3所示的序列或其功能片段或与SEQ ID NO: 2或
3或其功能片段具有至少70% (优选地85%，更优选地90%)序列同一性的序列。
15.包含编码如权利要求13或14中定义的EGY蛋白的核酸的构建体或载体。
16.一种构建体或载体，其包含与叶特异性或叶优选的启动子操作性连接的编码如权利要求13或14中定义的EGY蛋白的核酸。
17.一种植物细胞(例如烟草植物细胞)，其：
i) 包含外源性EGY多核苷酸；
ii) 包含权利要求15或16的构建体或载体；和/或
iii) 通过权利要求1-14中任一项的方法或用途可获得(例如获得)。
18.一种植物(例如烟草植物)，其：
i) 包含外源性EGY多核苷酸；
ii) 经修饰以达到与未修饰的植物相比氮使用效率和/或氮利用效率增加，其中所述修饰为增加所述修饰的植物中EGY多肽的活性或表达；
iii) 通过权利要求1-14中任一项的方法或用途可获得；
iv) 包含权利要求15或16的构建体或载体；和/或
v) 包含权利要求17的细胞。
19.从权利要求18的植物可获得的植物繁殖材料(例如植物种子)。
20.权利要求18的或从权利19的繁殖材料可获得的或从权利要求1-14中任一项的方法可获得的植物(例如烟草植物)的收获的叶。
21.权利要求16的植物(例如烟草植物)的收获的叶，其中收获的叶为切割的收获的叶。
22.一种处理的叶(例如处理的烟草叶，优选地不能存活的处理的烟草叶)，其：
a. 包含权利要求17的植物细胞；
b. 从通过权利要求1-14中任一项的方法可获得的植物可获得；
c. 通过处理权利要求18的植物可获得；
d. 从自权利要求19的植物繁殖材料繁殖的植物可获得；和/或
e. 通过处理权利要求20或权利要求21的收获的叶可获得。
23.权利要求22的处理的叶(例如处理的烟草叶)，其中植物或叶通过调制、发酵、巴氏杀菌或其组合处理。
24.权利要求22或权利要求23的处理的叶，其中处理的叶为切割的处理的叶。
25.权利要求17的植物细胞、权利要求18的植物、权利要求19的植物繁殖材料、权利要求20或21的收获的叶或权利要求22-24中任一项的处理的叶，其中植物为作物植物，例如果实作物、种子作物、豆类或坚果作物。
26.权利要求17的植物细胞、权利要求18的植物、权利要求19的植物繁殖材料、权利要求20或21的收获的叶或权利要求22-24中任一项的处理的叶，其中植物来自物种普通烟草或黄花烟草。
27.一种植物产品，其：
a. 从通过权利要求1-14中任一项的方法获得或可获得的植物制备；
b. 从权利要求18的植物制备；
c. 从自权利要求19的植物繁殖材料繁殖的植物制备；
d. 从权利要求20或21的收获的叶制备；
e. 从权利要求22-24中任一项的处理的叶制备；和/或
f. 从自权利要求18的修饰的植物获得或可获得的植物提取物制备或包含自权利要求
18的修饰的植物获得或可获得的植物提取物。
28.权利要求27的植物产品，其为可消耗的植物产品。
29.权利要求28的可消耗的植物产品，所述植物产品为烟草产品。
30.权利要求29的烟草产品，其中所述烟草产品为吸烟制品。
31.权利要求30的烟草产品，其中所述烟草产品为无烟烟草产品。
32.权利要求30或31的烟草产品，其中所述烟草产品为烟草加热装置，例如气溶胶产生装置。
33.权利要求18的所述植物或所述植物的部分的植物提取物(例如烟草提取物)。
34.吸烟制品、无烟烟草产品或烟草加热装置，其包含通过权利要求12的方法获得或可获得的来自物种普通烟草或黄花烟草的植物或其部分或权利要求18的植物。
35.以下用于生产如权利要求27-32中任一项所定义的产品的用途：
a. 权利要求18的植物或其部分；
b. 从权利要求19的植物繁殖材料繁殖的植物(优选叶)；
c. 权利要求20或权利要求21的收获的叶；
d. 权利要求22-24中任一项的处理的叶；和/或
e. 从权利要求18的植物获得的植物提取物。
36.权利要求18的植物用于培育植物的用途。
37.权利要求18的植物用于生长作物的用途。
38.权利要求18的植物用于生产叶(例如处理的(优选调制的)叶)的用途。
39.用于针对EGY变体筛选植物(例如烟草植物)的方法，所述方法包括比较所述植物中的EGY多核苷酸序列(例如基因)与野生型EGY多核苷酸序列以鉴定所述植物中变体EGY多核苷酸序列的存在情况，和任选地进一步确定与包含野生型EGY多核苷酸序列的植物相比所述变体EGY多核苷酸序列增加NUE和/或NUTL。
40.用于鉴定具有增加的NUE和/或增加的NUTL倾向的植物(例如烟草植物)的方法，所述方法包括比较所述植物中的EGY多核苷酸序列(例如基因)与野生型EGY多核苷酸序列以鉴定所述植物中变体EGY多核苷酸序列的存在情况，和任选地进一步确定与包含野生型EGY多核苷酸序列的植物相比所述变体EGY多核苷酸序列增加NUE和/或NUTL。
41.权利要求39或40的方法，其中所述植物为烟草植物并且所述野生型EGY多核苷酸序列为如SEQ ID NO: 4、5、21或22所示的序列。
42.权利要求41的方法，进一步包括确定所述变体EGY多核苷酸序列与所述植物中与包含野生型EGY多核苷酸序列的植物相比减少的TSNA水平有关。
43.产生具有增加的NUE和/或增加的NUTL的植物的方法，所述方法包括：
a.将通过权利要求39-42中任一项的方法鉴定为具有增加的NUE和/或增加的NUTL的供体植物与不具有所述变体EGY多核苷酸序列和具有商业期需性状的受体植物杂交；
b. 任选地从与所述受体植物杂交的所述供体植物的子代分离遗传物质；和
c. 任选地用分子标志进行分子标志辅助选择，其包括鉴定包含与增加的NUE和/或增加的NUTL相关的变体EGY多核苷酸序列的渗入区域。
44.基本如本文参考说明书和附图所描述的方法、叶、植物、植物繁殖材料、收获的叶、产品、用途或其组合。
用于增加植物中的氮使用效率和/或氮利用效率的方法
发明领域
[0001] 本发明涉及用于改善植物中的氮使用效率和/或氮利用效率的方法，和具体地，涉及用于减少烟草植物中的烟草特异性亚硝胺或其前体的方法。本发明进一步涉及通过本方法可获得的植物及其下游产品(例如繁殖材料、收获的叶、处理的叶和可消耗的产品)。
[0002] 背景日益增长的世界人口需要增加的粮食产量。根据联合国粮食和农业组织的预测(FAO,
2006, “World Agriculture: towards 2030/2050”. 中期报告. FAO, Rome, Italy)，从
2000到2050，谷类产量将需要增加60%。更多的作物产量需要更大量的植物营养物。因此，肥料消耗将会随着作物产量需求增加而显著增加。施用肥料以平衡用收获的作物从田间的永久性营养物输出和土壤提供的营养物之间的缺口。然而，并非所有施用的肥料在作物中结束。部分肥料营养物损失在较广阔的环境中，并且还可促成环境问题。
2006, “World Agriculture: towards 2030/2050”. 中期报告. FAO, Rome, Italy)，从
2000到2050，谷类产量将需要增加60%。更多的作物产量需要更大量的植物营养物。因此，肥料消耗将会随着作物产量需求增加而显著增加。施用肥料以平衡用收获的作物从田间的永久性营养物输出和土壤提供的营养物之间的缺口。然而，并非所有施用的肥料在作物中结束。部分肥料营养物损失在较广阔的环境中，并且还可促成环境问题。
[0003] 因此，在农业上存在对更有效的植物营养物使用的社会和政治需求。
[0004] 氮(N)和硝酸盐(NO3-)可用性调节植物代谢、生长和发育的许多方面。氮使用效率(NUE)和氮利用效率(NUTL)为评估降低氮(N)损失同时维持农业生产力的措施的效率的关键指示物。NUE通常定义为每单位施用的氮所收获的植物材料的重量。NUTL通常定义为每单位植物累积的氮所收获的材料的重量。
[0005] 因此改善NUE和/或NUTL为农业生产的期需目标。
[0006] 烟草特异性亚硝胺(TSNA)通过在烟草的调制和处理期间发生的亚硝化反应从烟碱和相关化合物形成，如图1中所说明的。晾制的烟草中的亚硝化剂通常为熟化期间从通过微生物作用还原叶硝酸盐衍生的亚硝酸盐，已经显示亚硝胺的产生与高水平的硝酸盐/亚硝酸盐和一氧化氮相关(Liang S., Yang J., Zhou J., Yu J., Ma Y., Bai R., Xu F., Yang C; Acta Physiol. Plant. (2013) 35: 3027-3036)。外源性物质的施用可通过调节白肋(burley)烟草中生物碱类和亚硝酸盐的生物合成减少烟草特异性亚硝胺的水平。Acta Physiol. Plant. (2013) 35: 3027-3036)。TSNA减少为烟草工业的期需目标。
[0007] 发明概述根据第一个方面，本发明提供用于增加植物中的氮使用效率(NUE)和/或氮利用效率(NUTL)的方法，其包括通过增加所述植物中乙烯依赖的向地性缺陷的黄绿蛋白(ethylene-dependent gravitropism-deficient and yellow green protein, EGY)的活性或表达修饰所述植物。
[0008] 在另一个方面，本发明提供植物中增加的编码EGY蛋白的多核苷酸的表达或增加的EGY蛋白的活性用于增加植物中的氮使用效率和/或氮利用效率的用途。
[0009] 在另一个方面，本发明提供用于通过增加烟草植物中乙烯依赖的向地性缺陷的黄绿蛋白(EGY)的活性或表达减少所述植物中至少一种烟草特异性亚硝胺(TSNA)或其前体的水平的方法。
[0010] 在另一个方面，本发明提供用于产生具有减少的至少一种TSNA或其前体的烟草植物、烟草植物繁殖材料、烟草叶、切割的收获的烟草叶、处理的烟草叶或切割和处理的烟草叶的方法，所述方法包括修饰所述烟草植物以在所述植物中增加EGY基因的表达或增加EGY蛋白的活性。
[0011] 在进一步的方面，本发明提供包含编码EGY蛋白的核酸的构建体或载体。
[0012] 在另一个方面，本发明提供植物细胞(例如烟草植物细胞)，其：i) 包含外源性EGY多核苷酸；
ii) 包含本发明的构建体或载体；和/或
iii) 通过本发明的方法或用途可获得(例如获得)。
ii) 包含本发明的构建体或载体；和/或
iii) 通过本发明的方法或用途可获得(例如获得)。
[0013] 在另一个方面，本发明提供植物(例如烟草植物)，其：i) 包含外源性EGY多核苷酸；
ii) 经修饰以达到与未修饰的植物相比氮使用效率和/或氮利用效率的增加，其中修饰为在所述修饰的植物中EGY多肽的活性或表达增加；
iii) 通过本发明的方法或用途可获得；
iv) 包含本发明的构建体或载体；和/或
v) 包含本发明的细胞。
ii) 经修饰以达到与未修饰的植物相比氮使用效率和/或氮利用效率的增加，其中修饰为在所述修饰的植物中EGY多肽的活性或表达增加；
iii) 通过本发明的方法或用途可获得；
iv) 包含本发明的构建体或载体；和/或
v) 包含本发明的细胞。
[0015] 在进一步的方面，本发明提供本发明的或从本发明的繁殖材料可获得的或从本发明的方法可获得的植物(例如烟草植物)的收获的叶。
[0016] 在另一个方面，本发明提供处理的叶(例如处理的烟草叶，优选地不能存活的处理的烟草叶)，其：a. 包含本发明的植物细胞；
b. 从通过本发明的方法可获得的植物可获得；
c. 通过处理本发明的植物可获得；
d. 从自本发明的植物繁殖材料繁殖的植物可获得；和/或
e. 通过处理本发明的收获的叶可获得。
b. 从通过本发明的方法可获得的植物可获得；
c. 通过处理本发明的植物可获得；
d. 从自本发明的植物繁殖材料繁殖的植物可获得；和/或
e. 通过处理本发明的收获的叶可获得。
[0017] 在进一步的方面，本发明提供植物产品，其：a. 从通过本发明的方法获得或可获得的植物制备；
b. 从本发明的植物制备；
c. 从自本发明的植物繁殖材料繁殖的植物制备；
d. 从本发明的收获的叶制备；
e. 从本发明的处理的叶制备；和/或
f. 从自本发明的修饰的植物获得或可获得的植物提取物制备或包含自本发明的修饰的植物获得或可获得的植物提取物。
b. 从本发明的植物制备；
c. 从自本发明的植物繁殖材料繁殖的植物制备；
d. 从本发明的收获的叶制备；
e. 从本发明的处理的叶制备；和/或
f. 从自本发明的修饰的植物获得或可获得的植物提取物制备或包含自本发明的修饰的植物获得或可获得的植物提取物。
[0018] 在另一个方面，本发明提供吸烟制品、无烟烟草产品或烟草加热装置，其包含来自通过本发明的方法获得或可获得的物种普通烟草(Nicotiana tabacum)或黄花烟草(Nicotiana rustica)的植物或其部分或本发明的烟草植物。
[0019] 在进一步的方面，本发明提供以下用于生产本发明的产品的用途：a. 本发明的植物或其部分；
b. 从本发明的植物繁殖材料繁殖的植物(优选叶)；
c. 本发明的收获的叶；和/或
d. 本发明的处理的叶；
e. 从本发明的植物获得的植物提取物。
b. 从本发明的植物繁殖材料繁殖的植物(优选叶)；
c. 本发明的收获的叶；和/或
d. 本发明的处理的叶；
e. 从本发明的植物获得的植物提取物。
[0020] 本发明进一步提供本发明的植物用于培育植物的用途。
[0021] 本发明进一步提供本发明的植物用于生长作物的用途。
[0022] 本发明进一步提供本发明的植物用于产生叶(例如处理的(优选调制的)叶)的用途。
[0023] 在进一步的方面，本发明提供用于针对EGY变体筛选植物(例如烟草植物)的方法，所述方法包括比较所述植物中的EGY多核苷酸序列(例如基因)与野生型EGY多核苷酸序列以鉴定所述植物中变体EGY多核苷酸序列的存在情况，和任选地进一步确定所述变体EGY多核苷酸序列与增加的NUE和/或增加的NUTL相关。
[0024] 在另一个方面，本发明提供用于鉴定具有增加的NUE和/或增加的NUTL倾向的植物(例如烟草植物)的方法，所述方法包括比较所述植物中的EGY多核苷酸序列(例如基因)与野生型EGY多核苷酸序列以鉴定所述植物中变体EGY多核苷酸序列的存在情况，和任选地进一步确定所述变体EGY多核苷酸序列与增加的NUE和/或增加的NUTL相关。
[0026] 附图简述图1显示在烟草烟雾中烟草特异性亚硝胺(TSNA)从前体例如烟碱和去甲烟碱经由亚硝化反应形成。
[0027] 图2显示(A) Yb1基因和(B) Yb2基因的定位克隆。绘制暗线以表示遗传标志的相对位置。这些标志之间的遗传距离以cM显示。灰色矩形指示外显子。(C) Yb突变的后果。Yb2的外显子2中8 bp缺失引起移码，其导致在终止于过早的终止密码子之前掺入8个假氨基酸。Yb1的外显子9中插入T引起移码，其导致在终止于过早的终止密码子之前掺入21个假氨基酸。
[0028] 图3显示拟南芥属(Arabidopsis) EGY1 (NP_198372)和普通烟草EGY1 (NtEGY1)和EGY2 (NtEGY2)的多肽和多核苷酸序列。
[0029] 图4显示Yb相关蛋白的氨基酸比对。比对使用MUSCLE产生。保守的核苷酸通过阴影方块指示。三个保守的结构域GNLR、HEXXH和NPDG用黑线加下划线。登录号如下：拟南芥属EGY1 (NP_198372)、雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii)预测的EGY1 (XP_012492480)、葡萄(Vitis vinifera)预测的EGY1 (XP_002269447)、番茄(S. lycopersicum) L2 (NP_001299816)、马铃薯(S. tuberosum)预测的EGY1 (XP_006339202)。
[0030] 图5显示非转化的白肋烟草栽培种TN 90LC和用35S:NtYb1转化的R0 TN 90LC植物的转基因(绿色茎)和非转基因(白色茎) R1子代的产量、氮使用效率(N-USE)、氮利用效率(N-UTL)和硝酸盐水平的平均数值。R1子代的平均值在三个转基因事件(每一转基因事件每一基因型类别20个测量个体)之上平均。
[0031] 图6显示NtYb1在白肋烟草栽培种TN 90LC中过表达对晾制的叶中的TSNA积累的作用。总TSNA计算为NNN、NAT、NAB和NNK的和。‘n’ = 取样的植物的数目。
[0032] 发明详述氮使用效率(NUE或N-USE)/氮利用效率(NUTL或N-UTL)
氮是植物生长所需的主要营养元素之一，通常为植物生长中的限速元素。氮为活细胞中存在的许多重要化合物例如氨基酸、蛋白(例如酶)、核酸和叶绿素的一部分。1.5%-2%的植物干物质和大约16%的总植物蛋白为氮。因此，氮的可用性对氨基酸合成以及氨基酸组成、氨基酸积累、蛋白合成及其积累具有重要影响，基于此，其为植物生长和产量的主要限制因素(Frink等人; Proc. Natl. Acad Sci. USA96, 1175 (1999)，其通过引用结合到本文中)。
氮是植物生长所需的主要营养元素之一，通常为植物生长中的限速元素。氮为活细胞中存在的许多重要化合物例如氨基酸、蛋白(例如酶)、核酸和叶绿素的一部分。1.5%-2%的植物干物质和大约16%的总植物蛋白为氮。因此，氮的可用性对氨基酸合成以及氨基酸组成、氨基酸积累、蛋白合成及其积累具有重要影响，基于此，其为植物生长和产量的主要限制因素(Frink等人; Proc. Natl. Acad Sci. USA96, 1175 (1999)，其通过引用结合到本文中)。
[0033] 植物可利用宽范围的氮种类，包括挥发性氨(NH3)、氮氧化物(NOx)、矿物质氮例如硝酸盐(NO3-)和铵盐(NH4+)、尿素和尿素衍生物，和有机氮(氨基酸、肽等)。一些植物能够通过共生细菌或某些真菌利用大气的氮。然而，在多数农业土壤中，硝酸盐(NO3-)为最重要的氮源(Crawford N. M., Glass A. D. M., Trends in Plant Science, 3 389 (1998); Hirsch R. E .. Sussman M. R., TIBTech 17, 356 (1999) ，其通过引用结合到本文中)。虽然如此铵NH4+也发挥重要的可能被低估的作用，因为当两种形式均存在时多数植物优先利用NH4+——即使NH4+以比NO3-更低的浓度存在(von Wiren N.等人; Curr. Opin. Plant Bioi. 3, 254 (2000)，其通过引用结合到本文中)。
[0034] 在一个实施方案中，实施本发明的方法和/或用途导致与未经修饰以增加EGY蛋白的活性或表达的植物相比修饰的植物中NUE和/或NUTL增加。
[0035] 在一个实施方案中，实施本发明的方法和/或用途导致与未经修饰以增加EGY蛋白的活性或表达的植物相比修饰的植物中NUE增加。
[0036] 在一个实施方案中，实施本发明的方法和/或用途导致与未经修饰以增加EGY蛋白的活性或表达的植物相比修饰的植物中NUTL增加。
[0037] NUE通常定义为每单位施用的氮所收获的植物材料的重量。NUTL通常定义为每单位植物累积的氮所收获的材料的重量。
[0038] 多种合适的用于计算NUE的方法为本领域所已知(例如Carranca等人; Farming for Food and Water Security; 2012; pp. 57–82; Weih等人; Plant Soil 2011, 339, 513–520; Weih; Agronomy 2014, 4(4), 470-477 – 其通过引用结合到本文中)。
[0039] 因此，NUE和NUTL可使用本领域已知的任何合适的方法计算。
[0040] 合适地NUE可按照下列方法计算(如Lewis等人; J. Agric. Food Chem. 60:6454-6461(2012); Moll等人; Agron. J.; 74, 562−564; (1982)中所描述的——各自通过引用结合到本文中)：
N-使用效率(N-USE, kg kg-1) = (调制的叶产量，kg ha-1/ 单位N肥料, kg ha-1)，合适地NUE也可按照下列方法计算：
-1 -1 -1
N-使用效率(N-USE, g g ) = (植物生物量, 克植物 / 单位N肥料，克植物 )
合适地NUTL可按照下列方法计算(如Lewis等人; J. Agric. Food Chem. 60:6454-
6461(2012); Moll等人; Agron. J.; 74, 562−564; (1982)中所描述的——各自通过引用结合到本文中)：
-1 -1 -1
N-利用效率 (N-UTL, kg kg ) = (调制的叶产量，kg ha / N-ACC, kg ha )，其中N-ACC = (调制的叶产量, kg ha-1 x 总N浓度，g kg-1)
合适地NUTL也可按照下列方法计算：
N-利用效率 (N-UTL, g g-1) = (植物生物量，g 植物-1 / N-ACC, g植物-1)
其中N-ACC = (植物生物量, g 植物-1 x % N*10)/1000
合适地，总氮可按照Nelson和Sommers (Agron. J. 65:109-112;1973 – 通过引用结合到本文中)所描述的方法计算，硝酸盐积累(NO3-N)可按照CORESTA推荐的36号方法 (2011)计算——所述方法通过引用结合到本文中。
N-使用效率(N-USE, kg kg-1) = (调制的叶产量，kg ha-1/ 单位N肥料, kg ha-1)，合适地NUE也可按照下列方法计算：
-1 -1 -1
N-使用效率(N-USE, g g ) = (植物生物量, 克植物 / 单位N肥料，克植物 )
合适地NUTL可按照下列方法计算(如Lewis等人; J. Agric. Food Chem. 60:6454-
6461(2012); Moll等人; Agron. J.; 74, 562−564; (1982)中所描述的——各自通过引用结合到本文中)：
-1 -1 -1
N-利用效率 (N-UTL, kg kg ) = (调制的叶产量，kg ha / N-ACC, kg ha )，其中N-ACC = (调制的叶产量, kg ha-1 x 总N浓度，g kg-1)
合适地NUTL也可按照下列方法计算：
N-利用效率 (N-UTL, g g-1) = (植物生物量，g 植物-1 / N-ACC, g植物-1)
其中N-ACC = (植物生物量, g 植物-1 x % N*10)/1000
合适地，总氮可按照Nelson和Sommers (Agron. J. 65:109-112;1973 – 通过引用结合到本文中)所描述的方法计算，硝酸盐积累(NO3-N)可按照CORESTA推荐的36号方法 (2011)计算——所述方法通过引用结合到本文中。
[0041] 上述用于计算NUTL的方法仅基于叶中的总氮，而非所有植物部分的总氮。合适地，在一个实施方案中，茎、中脉和根的组织氮浓度与叶氮浓度成比例。在一个实施方案中，NUE可增加至少约1%、至少约2%、至少约3%、至少约4%、至少约5%、至少约6%、至少约7%、至少约8%、至少约9%、至少约10%、至少约15%或至少约20%。
[0042] 在一些实施方案中NUE可增加约1%-约20%之间、约1%-约15%之间、1%-约10%之间、2%-约10%之间或约2%-5%之间。
[0043] 在一个实施方案中NUTL可增加至少约1%、至少约2%、至少约3%、至少约4%、至少约5%、至少约6%、至少约7%、至少约8%、至少约9%、至少约10%、至少约15%或至少约20%。
[0044] 在一些实施方案中，NUTL可增加约1%-约20%之间、约1%-约15%之间、1%-约10%之间、2%-约10%之间或约2%-5%之间。
[0045] 在一个实施方案中，术语“增加NUE”和/或“增加NUTL”意指修饰的植物在正常条件下或在氮缺乏条件下显示普遍增强的产量。
[0046] 如本文所使用的术语“产量”一般指来自植物特别是作物的可测量的生产。产量和产量增加(与非修饰的植物相比)可以以许多方式测量，应理解技术人员会能够根据具体的实施方案、关注的具体作物和关注的特定目的或应用应用正确的含义。在本文所描述的本发明优选的实施方案中，产量增加指增加的生物量产量、增加的种子产量和/或关于全植物或其部分或植物种子的一种或多种特定含量而言增加的产量。合适地，“产量”指生物量产量，包括干重生物量产量和/或鲜重生物量产量，各自关于植物的空中和/或地下部分，取决于特定情况(检验条件、特定目的作物、目的应用等)。在每一情况下，生物量产量可作为鲜重、干重或水分调整的基础计算，和另一方面在每植物基础上或关于特定面积(例如每英亩/平方米等的生物量产量)计算。合适地，“产量”指可通过一个或多个下列参数测量的种子产量：(每植物或每面积(英亩/平方米等)的)种子数目或饱满种子的数目；种子饱满率(饱满种子的数目和种子总数目之间的比率) ；每植物的花数目；(每植物或每面积(英亩/平方米等)的)种子生物量或总种子重量；千粒重(TKW; 从计数的饱满种子的数目和其总重量推测)；TKW增加可由增加的种子尺寸、增加的种子重量引起；或允许测量种子产量的其它参数。种子产量可在干重或鲜重基础上，或通常在水分调整的基础上(例如15.5%水分)测定。
[0047] 在优选的实施方案中，产量指可收获的产物的生物量。
[0048] 合适地，生物量可为干燥的生物量。
[0049] 合适地，生物量可为空中生物量，优选地干燥的空中生物量。
[0050] 合适地，生物量可为鲜重生物量，例如空中鲜重生物量。
[0051] 合适地，生物量可指植物的可收获部分。
[0052] 如本文所使用的术语“空中的”意指地面以上的植物部分，可包括叶、果实、种子和茎。在一个实施方案中如本文所使用的术语植物的空中部分意指仅植物的叶或植物的叶和/或茎。优选地，术语“空中的”用于指植物的叶。
[0053] 在一个实施方案中术语“提高的生物量”意指与相应的野生型光合活性有机体相比，植物在有限的氮供应的条件下显示增加的生长速率。增加的生长速率可尤其反映在增加的全植物生物量产生，或增加的植物空中部分的生物量产生，或增加的植物地下部分的生物量产生，或增加的植物部分如茎、叶、花、果实、种子的生物量产生。
[0054] 在一个实施方案中，增加的生物量产生包括更高的果实产量、更高的种子产量、更高的鲜物质产生和/或更高的干物质产生。
[0055] 在一个实施方案中生物量可增加至少约1%、至少约2%、至少约3%、至少约4%、至少约5%、至少约6%、至少约7%、至少约8%、至少约9%、至少约10%、至少约15%或至少约20%。在一些实施方案中生物量可增加约1%-约20%之间、约1%-约15%之间、1%-约10%之间、2%-约10%之间或约2%-5%之间。
[0056] 乙烯依赖的向地性缺陷的黄绿蛋白(EGY)乙烯依赖的向地性缺陷的黄绿蛋白(EGY)为叶绿体中类囊体基粒和组织良好的薄片二者发育所需要的膜相关的和ATP独立的金属蛋白酶。其为叶绿体膜中积累叶绿素和叶绿素a/b结合(CAB)蛋白，和基粒形成和正常的叶绿体发育所需。其牵涉响应铵应激调节核基因表达并与ABA信号传导相互作用和在体外以ATP独立的方式进行β-酪蛋白降解。
[0057] 术语“EGY蛋白”和“EGY多肽”在本文中用于指包含保守的GNLR、HEXXH和NXXPXXXLDG基序的蛋白。在一个实施方案中，术语“EGY蛋白”和“EGY多肽”用于指包含GNLR、HEXXH和NXXPXXXLDG基序和提供ATP独立的金属蛋白酶活性的蛋白。
[0058] 术语“增加EGY蛋白的活性或表达”意指当与未经修饰以增加EGY蛋白的活性或表达的植物相比时在修饰的植物中作为整体的植物中EGY蛋白的表达或活性增加。
[0059] 在一个实施方案中当与未修饰的植物相比时修饰的植物中EGY蛋白的活性或表达的增加可超过约5%。合适地EGY蛋白表达或活性的增加可超过约10%、适合地超过约15%。在一些实施方案中EGY蛋白活性或表达的增加可超过约20%，更适合地超过约30%。在一些实施方案中EGY蛋白活性或表达的增加可超过约40%，例如约50%、约60%、约70%、约80%、约90%或约100%。
[0060] 在一个实施方案中，本方法和/或用途可包括增加超过一种EGY多核苷酸、基因或蛋白的表达或活性。
[0061] 一种或多种EGY多核苷酸、基因或蛋白可为如本文中所描述的任何EGY多核苷酸、基因或蛋白。
[0062] 合适地，本方法和/或用途可包括增加NtEGY1和/或ntEGY2的表达。
[0063] 在一个实施方案中，EGY变体可为与野生型EGY多肽相比具有增加的活性的EGY多肽。
[0064] 合适地，野生型EGY多肽可为例如显示为烟草属(Nicotiana) EGY1或EGY2序列(例如包含显示为SEQ ID NO:2或3的序列之一)、拟南芥属EGY1 (AtEGY) (NP_198372)、雷蒙德氏棉EGY1 (GrEGY1) (XP_012492480)、葡萄EGY1 (VvEGY1) (XP_002269447)、番茄L2 (Sl L2) (NP_001299816)或马铃薯EGY1 (St EGY1) (XP_006339202)的EGY多肽。
[0065] 合适地，野生型EGY多肽可包含显示为SEQ ID NO: 1、2、3、17、18、19或20的序列。在一个实施方案中，野生型EGY多肽可包含显示为SEQ ID NO: 2或3的序列。
[0066] 变体EGY多肽可具有与野生型EGY多肽相比增加至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%或至少50%的活性水平。
[0067] 当在植物中表达时，与野生型EGY多肽相比具有增加的活性的变体EGY多肽可以以比野生型EGY蛋白更大的量增加NUE和/或NUTL。
[0068] 合适地，当在植物中表达时，变体EGY多肽与野生型EGY多肽相比可使NUE和/或NUTL多增加至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%或至少50%。
[0069] 在一些实施方案中增加EGY蛋白的活性或表达的植物修饰可使用基因编辑进行。
[0070] 基因编辑可使用本领域已知的任何方法进行。几个非限制性的实例在此处呈现，包括使用CRISPR-Cas9系统。CRISPR/Cas9基因组编辑工具可市售可得，例如来自Clontech (Avenue du President Kennedy 78100 Saint-Germain-en-Laye, France)的“Guide-it”。另一种基因编辑方法包括用市售可得的试剂盒(例如来自Addgene, 1Kendall Sq. Ste. B7102, Cambridge, MA 02139, USA)使用TALEN (转录激活因子样效应物核酸酶)技术。进一步的方法包括使用锌指核酸酶例如从Sigma-Aldrich可得的CompoZr®锌指核酸酶技术。另一种方法包括使用Silva等人Curr Gene Ther. Feb 2011; 11(1): 11–27、WO2007/047859和WO2009/059195 (其教导通过引用结合到本文中)中描述的大范围核酸酶(或进一步的方法)。又进一步的方法为寡核苷酸指导的诱变(ODM)例如从Keygene (Agro Business Park 90, 6708 PW Wageningen, The Netherlands)可得的KeyBase®。
[0071] 在一个实施方案中用于按照本发明使用的EGY蛋白和/或编码EGY蛋白的多核苷酸(例如EGY基因)可为植物(例如烟草植物)内源性的。
[0072] 本文中对“内源性”基因的提及不仅指如在植物中以其天然形式(即无任何人类干预)存在的目的基因，还指随后(再)引入植物中的以分离的形式的同一基因(或基本同源的核酸/基因) (转基因)。例如，包含这样的转基因的转基因植物可遭遇转基因表达的实质减少和/或内源基因表达的实质减少。分离的基因可从有机体分离或可为人造的，例如通过化学合成。
[0073] 在另一个实施方案中用于按照本发明使用的EGY蛋白可为植物(例如烟草植物)外源性的。
[0074] EGY蛋白的实例为烟草属EGY1或EGY2 (例如分别包含SEQ ID NO: 2和3)、拟南芥属EGY1 (AtEGY) (NP_198372)、雷蒙德氏棉EGY1 (GrEGY1) (XP_012492480)、葡萄EGY1 (VvEGY1) (XP_002269447)、番茄L2 (Sl L2) (NP_001299816)、马铃薯EGY1 (St EGY1) (XP_006339202)。
[0075] 在一个实施方案中，EGY多肽包含下列氨基酸序列：i) GNLR (SEQ ID NO: 6)
ii) HEXXH其中X为任何氨基酸(SEQ ID NO: 7)
iii) NXXPXXXLDG其中X为任何氨基酸(SEQ ID NO: 8)
在一个实施方案中，EGY多肽包含下列保守残基：包含Gly-176、Asn-177、Leu-178和Arg-179的GNLR基序，包含His-311、Glu-312、X-313、X-314和His-311的HEXXH基序，和包含Asn-441、X-442、X-443、Pro-444、X-445、X-446、X-447、Leu-448、Asp-449和Gly-450的NXXPXXXLDG基序；其中X为任何氨基酸和其中保守残基的编号意指EGY蛋白与具有SEQ ID NO: 1的拟南芥(Arabidopsis thaliana) EGY1蛋白比对时的有效相等位置。
ii) HEXXH其中X为任何氨基酸(SEQ ID NO: 7)
iii) NXXPXXXLDG其中X为任何氨基酸(SEQ ID NO: 8)
在一个实施方案中，EGY多肽包含下列保守残基：包含Gly-176、Asn-177、Leu-178和Arg-179的GNLR基序，包含His-311、Glu-312、X-313、X-314和His-311的HEXXH基序，和包含Asn-441、X-442、X-443、Pro-444、X-445、X-446、X-447、Leu-448、Asp-449和Gly-450的NXXPXXXLDG基序；其中X为任何氨基酸和其中保守残基的编号意指EGY蛋白与具有SEQ ID NO: 1的拟南芥(Arabidopsis thaliana) EGY1蛋白比对时的有效相等位置。
[0076] 在一个实施方案中，EGY多肽包含显示为SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3的多肽或其功能片段或与SEQ ID NO: 2或3或其功能片段具有至少70%序列同一性的序列。
[0077] 合适地多肽可与SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3或其功能片段具有至少80%同一性。
[0078] 更合适地多肽可与SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3或其功能片段具有至少90%同一性。优选地多肽可与SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3或其功能片段具有至少95%同一性。
[0079] 更优选地多肽可与SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3或其功能片段具有至少99%同一性。
[0080] 如本文所使用的术语“功能片段”指能够编码保留其活性的EGY蛋白的多肽部分。在一个实施方案中功能片段可为本发明的多肽的部分，其包含如本文所描述的EGY多肽的至少50个氨基酸、至少75个氨基酸、至少100个氨基酸、至少150个氨基酸、至少200个氨基酸、至少300个氨基酸、至少400个氨基酸或至少500个氨基酸。
[0081] 在一个实施方案中，EGY多肽包括显示为SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3的多肽或与SEQ ID NO: 2或3具有至少70%序列同一性的序列。合适地所述多肽可与SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3具有至少80%同一性。更合适地所述多肽可与SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3具有至少90%同一性。优选地所述多肽可与SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3具有至少95%同一性。更优选地所述多肽可与SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3具有至少99%同一性。
[0082] 在一个实施方案中EGY多核苷酸可为NtEGY1、NtEGY2、AtEGY (NM_122913.3)、GrEGY1 (XM_012637026)、VvEGY1 (XM_002269411.2)、Sl L2 (NM_001312887.1)或StEGY1 (XM_006339140.2)。
[0083] 合适地EGY基因或多核苷酸为NtEGY1和/或NtEGY2。
[0084] 在一个实施方案中NtEGY1包含SEQ ID NO: 4或与SEQ ID NO: 4具有至少70%序列同一性的序列。合适地NtEGY1可与SEQ ID NO: 4具有至少80%同一性。更合适地NtEGY1可与SEQ ID NO: 4具有至少90%同一性。优选地NtEGY1可与SEQ ID NO: 4具有至少95%同一性。更优选地NtEGY1可与SEQ ID NO: 4具有至少99%同一性。
[0085] 在一个实施方案中NtEGY1包含SEQ ID NO: 4或由其组成。
[0086] 在一个实施方案中NtEGY1基因为基因组多核苷酸序列，其转录为在本文中定义为NtEGY1的多核苷酸序列。在一个实施方案中NtEGY1基因组多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 21或与SEQ ID NO: 21具有至少70% 序列同一性的序列。合适地NtEGY1可与SEQ ID NO: 21具有至少80%同一性。更合适地NtEGY1可与SEQ ID NO: 21具有至少90%同一性。优选地NtEGY1可与SEQ ID NO: 21具有至少95%同一性。更优选地NtEGY1可与SEQ ID NO: 21具有至少99%同一性。
[0087] 在一个实施方案中NtEGY1包含SEQ ID NO: 21或由其组成。
[0088] 在一个实施方案中NtEGY2包含SEQ ID NO: 5或与SEQ ID NO: 5具有至少70% 序列同一性的序列。合适地NtEGY2可与SEQ ID NO: 5具有至少80%同一性。更合适地NtEGY2可与SEQ ID NO: 5具有至少90%同一性。优选地NtEGY2可与SEQ ID NO: 5具有至少95%同一性。更优选地NtEGY2可与SEQ ID NO: 5具有至少99%同一性。
[0089] 在一个实施方案中 NtEGY2 包含SEQ ID NO: 5或由其组成。
[0090] 在一个实施方案中NtEGY2基因为基因组多核苷酸序列，其转录为在本文中定义为NtEGY2的多核苷酸序列。在一个实施方案中NtEGY2多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 22或与SEQ ID NO: 22具有至少70% 序列同一性的序列。合适地NtEGY2可与SEQ ID NO: 22具有至少80%同一性。更合适地NtEGY2可与SEQ ID NO: 22具有至少90%同一性。优选地NtEGY2可与SEQ ID NO: 22具有至少95%同一性。更优选地NtEGY2可与SEQ ID NO: 22具有至少99%同一性。
[0091] 在一个实施方案中NtEGY2 包含SEQ ID NO: 22或由其组成。
[0092] 在一个实施方案中EGY基因或多核苷酸包含SEQ ID NO: 4、5、21或22或其功能片段，或与SEQ ID NO: 4、5、21或22或其功能片段具有至少70% 序列同一性的SEQ ID NO: 4、5、21或22或其功能片段的变体。合适地变体可与SEQ ID NO: 4、5、21或22或其功能片段具有至少80%序列同一性。合适地变体可与SEQ ID NO: 4、5、21或22或其功能片段具有至少
90%序列同一性。合适地变体可与SEQ ID NO: 4、5、21或22或功能片段具有至少95%序列同一性。合适地变体可与SEQ ID NO: 4、5、21或22或其功能片段具有至少99%序列同一性。
90%序列同一性。合适地变体可与SEQ ID NO: 4、5、21或22或功能片段具有至少95%序列同一性。合适地变体可与SEQ ID NO: 4、5、21或22或其功能片段具有至少99%序列同一性。
[0093] 在进一步的实施方案中用于按照本发明使用的EGY多肽可由多核苷酸序列编码，所述多核苷酸序列包含：i) 在本文中显示为SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 21或SEQ ID NO: 22的多核苷酸序列；
ii) i)中显示的多核苷序列的功能片段，所述功能片段编码EGY多肽，或
iii) 编码包含在本文中显示为SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；或
iv) 可与i)、ii)或iii)中教导的多核苷酸在高度严格条件下杂交的多核苷酸序列，或v) 与上述i)、ii)或iii)中显示的多核苷酸具有至少70% (优选地85%，更优选地90%)同一性的多核苷酸序列，或
vi) 由于遗传密码简并性与i)、ii)或iii)中显示的多核苷酸不同的多核苷酸序列。
ii) i)中显示的多核苷序列的功能片段，所述功能片段编码EGY多肽，或
iii) 编码包含在本文中显示为SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；或
iv) 可与i)、ii)或iii)中教导的多核苷酸在高度严格条件下杂交的多核苷酸序列，或v) 与上述i)、ii)或iii)中显示的多核苷酸具有至少70% (优选地85%，更优选地90%)同一性的多核苷酸序列，或
vi) 由于遗传密码简并性与i)、ii)或iii)中显示的多核苷酸不同的多核苷酸序列。
[0094] 如本文所使用的术语“遗传密码的简并性”指编码多肽序列的密码子的冗余，其显示为多重三密码子组合指定一个氨基酸。例如在编码具有异亮氨酸氨基酸的多肽的mRNA分子中，异亮氨酸可由AUU、AUC或AUA编码。这意指编码RNA的DNA分子可具有多个序列，而所得的多肽将会具有相同序列。换言之多态核苷酸序列可编码同一多肽产物。这意指一个核酸序列可包含与第二个序列具有非常低的序列同一性的序列，同时编码相同的多肽序列。
[0095] 在一个实施方案中多核苷酸序列可与SEQ ID NO: 4、5、21或22具有至少80%同一性。合适地多核苷酸序列可与SEQ ID NO: 4、5、21或22具有至少90%同一性。合适地多核苷酸序列可与SEQ ID NO: 4、5、21或22具有至少95%同一性(更合适地至少99%同一性)。更合适地多核苷酸序列可与SEQ ID NO: 4、5、21或22具有至少99%同一性。
[0096] 在一个实施方案中多核苷酸序列可与SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5具有至少80%同一性。合适地多核苷酸序列可与SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5具有至少90%同一性。合适地多核苷酸序列可与SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5具有至少95%同一性(更合适地至少99%同一性)。更合适地多核苷酸序列可与SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5具有至少99%同一性。
[0097] 在一个实施方案中，EGY变体可为与野生型EGY多肽相比具有减少的活性的EGY多肽。
[0098] 合适地，野生型EGY多肽可为例如显示为烟草属EGY1或EGY2序列(例如包含显示为SEQ ID NO:2或3的序列之一)、拟南芥属EGY1 (AtEGY) (NP_198372)、雷蒙德氏棉EGY1 (GrEGY1) (XP_012492480)、葡萄EGY1 (VvEGY1) (XP_002269447)、番茄L2 (Sl L2) (NP_001299816)或马铃薯EGY1 (St EGY1) (XP_006339202)的EGY多肽。
[0099] 合适地，野生型EGY多肽可包含显示为SEQ ID NO: 1、2、3、17、18、19或20的序列。在一个实施方案中，野生型EGY多肽可包含显示为SEQ ID NO: 2或3的序列。
[0100] 具有减少的活性的EGY变体可使用本领域已知的各种方法产生。例如，编码野生型EGY多肽的多核苷酸序列可通过基因编辑修饰以减少EGY蛋白的活性。基因编辑可使用本领域已知的任何方法进行。几个非限制性的实例在此处呈现，包括使用CRISPR-Cas9系统。CRISPR/Cas9基因组编辑工具可市售可得，例如来自Clontech (Avenue du President Kennedy 78100 Saint-Germain-en-Laye, France)的“Guide-it”。另一种基因编辑方法包括用市售可得的试剂盒(例如来自Addgene, 1Kendall Sq. Ste. B7102, Cambridge, MA
02139, USA)使用TALEN (转录激活因子样效应物核酸酶)技术。进一步的方法包括使用锌指核酸酶例如从Sigma-Aldrich可得的CompoZr®锌指核酸酶技术。另一种方法包括使用Silva等人Curr Gene Ther. Feb 2011; 11(1): 11–27、WO2007/047859和WO2009/059195 (其教导通过引用结合到本文中)中描述的大范围核酸酶(或进一步的方法)。又进一步的方法为寡核苷酸指导的诱变(ODM)例如从Keygene (Agro Business Park 90, 6708 PW Wageningen, The Netherlands)可得的KeyBase®。
02139, USA)使用TALEN (转录激活因子样效应物核酸酶)技术。进一步的方法包括使用锌指核酸酶例如从Sigma-Aldrich可得的CompoZr®锌指核酸酶技术。另一种方法包括使用Silva等人Curr Gene Ther. Feb 2011; 11(1): 11–27、WO2007/047859和WO2009/059195 (其教导通过引用结合到本文中)中描述的大范围核酸酶(或进一步的方法)。又进一步的方法为寡核苷酸指导的诱变(ODM)例如从Keygene (Agro Business Park 90, 6708 PW Wageningen, The Netherlands)可得的KeyBase®。
[0101] 变体EGY多肽可具有与野生型EGY多肽相比减少至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%或至少50%的活性水平。
[0102] 当在植物中表达时，与野生型EGY多肽相比具有减少的活性的变体EGY多肽可以以比野生型EGY蛋白更低的量增加NUE和/或NUTL。
[0103] 合适地，当在植物中表达时，变体EGY多肽与野生型EGY多肽相比可使NUE和/或NUTL少增加至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%或至少50%。
[0104] 合适地具有减少的活性的EGY变体可用于在烟草品种例如黄色白肋(Yellow Burley)中增加NUE和/或NUTL，以便增加NUE和/或NUTL同时保留烟草品种(例如黄色白肋品种)的感觉特性。
[0105] NUE和/或NUTL可通过如本文所描述的任何合适的方法测定。
[0106] 烟草特异性亚硝胺(TSNA)众所周知烟草叶中残余的氮促成通过如图1中所说明的亚硝化反应形成亚硝胺。具体地，在调制的叶中硝酸盐和亚硝酸盐和一氧化氮(NO)充当前体形成烟草特异性亚硝胺(TSNA)。不希望受理论束缚，本发明人认为通过调节EGY蛋白表达修饰硝酸盐同化提供调节亚硝酸盐和一氧化氮(NO)产生和因此烟草叶调制和处理期间形成的TSNA水平的能力。具体地，通过增加EGY蛋白表达的表达和/或活性，减少对于通过植物硝酸盐还原酶或经由微生物活性还原成亚硝酸盐(在晾制的烟草中用于TSNA形成的主要的亚硝化剂)可用的游离NO3-N池，因此减少TSNA水平。
[0107] 因此，在一个方面本发明提供用于减少烟草植物(例如烟草植物叶)中至少一种烟草特异性亚硝胺(TSNA)或其前体的水平的方法，其包括通过增加所述植物中乙烯依赖的向地性缺陷的黄绿蛋白(EGY)的活性或表达修饰所述植物。
[0108] 本发明还提供增加的EGY基因表达或增加的EGY蛋白活性用于在烟草植物中减少至少一种TSNA或其前体的用途。
[0109] 从具有增加的EGY基因表达或增加的EGY蛋白活性的烟草植物制备的烟草产品中TSNA含量或浓度的减少为高度有利的技术效果。
[0110] 在一个实施方案中提供用于产生具有减少的至少一种TSNA或其前体的烟草植物、烟草植物繁殖材料、烟草叶、处理的烟草叶、切割烟草叶或切割和处理的烟草叶的方法，所述方法包括修饰所述烟草植物以增加EGY基因的表达或增加EGY蛋白的活性。
[0111] 如本文所使用的术语“烟草特异性亚硝胺”或“TSNA”具有其在本领域的通常含义，即仅在烟草产品或其它包含烟碱的产品中存在的亚硝胺。合适地至少一种烟草特异性亚硝胺可为4-(甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N'-亚硝基去甲烟碱(NNN)、N'-亚硝基新烟草碱(NAT)或N-亚硝基新烟碱(NAB)。
[0112] 更合适地至少一种烟草特异性亚硝胺可为NNK或NNN。
[0113] 当关于至少一种烟草特异性亚硝胺使用时，术语“其前体”指导致形成烟草特异性亚硝胺或涉及导致烟草特异性亚硝胺产生的亚硝化反应的烟草植物的一种或多种化学品或化合物。合适地术语“其前体”可指硝酸盐、亚硝酸盐或一氧化氮。合适地术语“其前体”可指硝酸盐。
[0114] 在一个实施方案中实施本发明的方法和/或用途导致与未经修饰以增加EGY蛋白的活性或表达的烟草植物相比修饰的烟草植物中至少一种TSNA或其前体减少。
[0115] 术语“减少至少一种TSNA或其前体”或“至少一种TSNA或其前体的减少”在本文中用于意指本发明的产品、方法或用途中的至少一种TSNA或其前体的浓度和/或总含量相对于可比较的产品、方法或用途更低。例如，可比较的烟草产品会衍生自未按照本发明修饰但其中所有其它相关特征相同(例如植物种类、生长条件、处理烟草的方法等)的烟草植物。
[0116] 本领域已知的用于测定至少一种TSNA或其前体的浓度和/或水平的任何方法均可使用。特别地可使用例如本文实施例4中详述的方法。例如当测定烟草特异性亚硝胺的前体的浓度和/或水平时，可使用方法例如WO2009/022183、Morot-Gaudry-Talarmain等人 2002. Planta, 215:708-715或Mur等人Plant Science 181 (2011) 509– 519 (其通过引用结合到本文中)中详述的方法。
[0117] 合适地至少一种烟草特异性亚硝胺或其前体的浓度和/或总含量可通过实施本发明的方法和/或用途减少。合适地当与未经修饰以增加EGY蛋白的活性或表达的烟草植物中的至少一种烟草特异性亚硝胺或其前体的浓度和/或水平相比时，本发明的烟草植物(例如通过本发明的方法和/或用途可获得或获得的)中所述至少一种烟草特异性亚硝胺或其前体的浓度和/或水平可减少。
[0118] 与从未经修饰以增加EGY蛋白的活性或表达的烟草植物可获得或获得的烟草叶、收获的叶、处理的烟草叶、烟草产品或其组合相比，至少一种烟草特异性亚硝胺或其前体的浓度和/或总含量在从本发明的烟草植物可获得或获得的烟草叶、收获的叶、处理的烟草叶、烟草产品或其组合中可减少。
[0119] 合适地至少一种烟草特异性亚硝胺或其前体的浓度和/或总含量可在烟草植物叶中减少。合适地至少一种烟草特异性亚硝胺或其前体的浓度和/或总含量可在处理的烟草叶减少。
[0120] 合适地至少一种烟草特异性亚硝胺或其前体的浓度和/或水平可在烟草产品中减少。
[0121] 在一个实施方案中至少一种烟草特异性亚硝胺或其前体可减少至少约1%、至少约3%、至少约5%、至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%或至少约90%。在一些实施方案中至少一种烟草特异性亚硝胺或其前体可减少约5%-约95%之间、约10%-约90%之间、20%-约80%之间、30%-约70%之间或约40%-60%之间。
[0122] 关于处理的(例如调制的)烟草叶，至少一种烟草特异性亚硝胺或其前体可减少约5000 ng/g-约50 ng/g之间、约4000 ng/g-约100 ng/g之间、约3000 ng/g-500 ng/g之间或
2000 ng/g-1000 ng/g之间。在一些实施方案中至少一种烟草特异性亚硝胺或其前体可减少至少约5000 ng/g、至少约4000 ng/g、至少约3000 ng/g、至少约2000 ng/g、至少约1000 ng/g、至少约500 ng/g、至少约100 ng/g或至少约50 ng/g。
2000 ng/g-1000 ng/g之间。在一些实施方案中至少一种烟草特异性亚硝胺或其前体可减少至少约5000 ng/g、至少约4000 ng/g、至少约3000 ng/g、至少约2000 ng/g、至少约1000 ng/g、至少约500 ng/g、至少约100 ng/g或至少约50 ng/g。
[0123] 增加表达本发明的方法和用途包括增加至少一种EGY蛋白的表达。增加表达可通过本领域技术人员已知的任何方法达到。
[0124] 如本文所使用的术语“增加的表达”或“过表达”意指最初的野生型表达水平额外的任何形式的表达。
[0125] “增加的表达”意指与相同品种的亲本植物的表达水平相比植物的mRNA水平或蛋白水平增加。表达水平与在相同条件下培养的相同品种的亲本植物中的对应部分比较。优选地认为其中表达水平增加为亲本植物的至少1.1倍大的情况是其中表达水平增加的情况。此处，更优选植物的表达水平与亲本植物相比通过t检验具有5%的显著差异，以便认为存在表达水平的增加。优选植物和亲本植物的表达水平在相同时间通过相同方法测量。然而，作为背景数据储存的数据也可使用。
[0126] 用于增加基因或基因产物的表达的方法在本领域有良好的文档记录，包括，例如，适当的启动子驱动的过表达、使用转录增强子或翻译增强子。可将用作启动子或增强子元件的分离的核酸引入非异源形式的多核苷酸的适当位置(通常上游)以上调编码目的多肽的核酸的表达。例如，内源性启动子可通过突变、缺失和/或取代在体内更改(参见，US 5,565,350、WO9322443，其通过引用结合到本文中)，或可将分离的启动子以适当的定向和离本发明基因适当的距离引入植物细胞中以控制基因表达。
[0127] 如果期需多肽表达，一般期需在多核苷酸编码区域的3’末端包含多腺苷酸化区域。多腺苷酸化区域可衍生自天然基因，衍生自各种其它植物基因，或衍生自T-DNA。待添加的3’末端序列可衍生自，例如，胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因，或备选地衍生自另一种植物基因，或不太优选地衍生自任何其它真核基因。
[0128] 内含子序列也可加至5’非翻译区域(UTR)或部分编码序列的编码序列以增加细胞溶胶中积累的成熟信使的量。已经显示在植物和动物表达构建体二者的转录单位中包含可剪接的内含子在mRNA和蛋白水平二者增加基因至表达高达1000倍(Buchman和Berg (1988) MoI. Cell biol. 8: 4395-4405; Callis等人 (1987) Genes Dev 1 :1183-1200，其通过引用结合到本文中)。基因表达的这种内含子增强通常当放置在转录单位的5’末端附近时最大。使用玉米内含子Adh1-S内含子1、2和6、Bronze-1内含子为本领域所已知。对于一般信息参见：The Maize Handbook, 第116章, Freeling和Walbot编辑, Springer, N.Y. (1994)，其通过引用结合到本文中。
[0129] 在一个实施方案中增加的表达可通过使用基因编辑或靶向诱变达到。
[0130] 基因编辑可使用本领域已知的任何方法进行。几个非限制性的实例在此处呈现，包括使用CRISPR-Cas9系统。CRISPR/Cas9基因组编辑工具可市售可得，例如来自Clontech (Avenue du President Kennedy 78100 Saint-Germain-en-Laye, France)的“Guide-it”。另一种基因编辑方法包括用市售可得的试剂盒(例如来自Addgene, 1Kendall Sq. Ste. B7102, Cambridge, MA 02139, USA)使用TALEN (转录激活因子样效应物核酸酶)技术。进一步的方法包括使用锌指核酸酶例如从Sigma-Aldrich可得的CompoZr®锌指核酸酶技术。另一种方法包括使用Silva等人Curr Gene Ther. Feb 2011; 11(1): 11–27、WO2007/047859和WO2009/059195 (其教导通过引用结合到本文中)中描述的大范围核酸酶(或进一步的方法)。又进一步的方法为寡核苷酸指导的诱变(ODM)例如从Keygene (Agro Business Park 90, 6708 PW Wageningen, The Netherlands)可得的KeyBase®。
[0131] 合适地，基因编辑可用于在体内更改EGY基因启动子的序列。
[0132] 在本发明的另一个实施方案中，增加的EGY多肽表达可通过在植物内表达包含编码EGY多肽的核酸序列的多核苷酸(例如外源性多核苷酸)达到。在一个实施方案中，所述多核苷酸(例如外源性多核苷酸)包含编码EGY多肽的核酸序列，其与用于指导所述核酸序列在所述植物中转录的异源启动子操作性连接。
[0133] 在一些实施方案中启动子可选自：组成型启动子、衰老特异性启动子、组织特异性启动子、发育调节的启动子和可诱导的启动子。
[0134] 在一个实施方案中启动子可为组成型启动子。
[0135] 组成型启动子在植物发育期间贯穿植物的各个部分持续地指导基因表达，尽管该基因可能不在所有细胞类型中以相同的水平表达。已知的组成型启动子的实例包括与花椰菜花叶病毒35S转录物(Odell JT, Nagy F, Chua NH. (1985). Identification of DNA sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter (鉴定花椰菜花叶病毒35S启动子的活性所需的DNA序列). Nature. 313 810-2，其通过引用结合到本文中)、水稻肌动蛋白1基因(Zhang W, McElroy D, Wu R. (1991). Analysis of rice Act1 5' region activity in transgenic rice plants (转基因水稻植物中水稻Act1 5’区域活性的分析). Plant Cell 3 1155-65，其通过引用结合到本文中)和玉米泛素1基因(Cornejo MJ, Luth D, Blankenship KM, Anderson OD, Blechl AE. (1993). Activity of a maize ubiquitin promoter in transgenic rice (转基因水稻中玉米泛素启动子的活性). Plant Molec. Biol. 23 567-81，其通过引用结合到本文中)相关的那些。组成型启动子例如香石竹蚀环病毒(CERV)启动子(Hull R, Sadler J, LongstaffM (1986) The sequence of Carnation Etched Ring Virus DNA: comparison with cauliflower mosaic virus and retroviruses (香石竹蚀环病毒DNA的序列：与花椰菜花叶病毒和反转录病毒的比较). EMBO Journal, 5(2):3083-3090，其通过引用结合到本文中)。
[0136] 组成型启动子可选自：香石竹蚀环病毒(CERV)启动子、花椰菜花叶病毒(CaMV 35S启动子)、来自水稻肌动蛋白1基因或玉米泛素1基因的启动子。
[0137] 合适地启动子可为CERV启动子。
[0138] 在一个实施方案中启动子可为衰老特异性启动子。
[0139] “衰老特异性启动子”(SAG)可为与控制衰老相关基因表达相关的启动子。因此，启动子可将其操作性连接的编码序列(即基因)的表达基本上专有地限制在衰老组织中。因此，衰老特异性启动子可为以下启动子，其能够优先在植物组织中以发育调节的方式启动基因表达，以致于3’蛋白编码区域的表达基本仅在植物组织经历衰老时发生。将会理解衰老倾向于在植物的较老部分，例如较老的叶中发生，而不在植物的较嫩部分例如种子中发生。
[0140] 已知表达许多衰老相关基因的植物的一个实例为拟南芥属。因此，衰老特异性启动子可从拟南芥属中的衰老相关基因分离。Gepstein等人(The Plant Journal, 2003, 36, 629-642，其通过引用结合到本文中)使用拟南芥属作为模型进行了SAG和其启动子的详细研究。基因构建体可包含来自该文章中公开的任何SAG的启动子。例如，合适的启动子可选自SAG12、SAG13、SAG101、SAG21和SAG18，或其功能变体或功能片段。
[0141] 在一个实施方案中启动子可为SAG12启动子(其为本领域技术人员所已知)，或其功能变体或片段(Gan & Amasino, 1997, Plant Physiology, 113: 313-319，其通过引用结合到本文中)。
[0142] 合适的启动子及其序列可见于WO2010/097623，所述申请通过引用结合到本文中。
[0143] 在另一个实施方案中，启动子可为组织特异性启动子。
[0144] 组织特异性启动子为在植物的一个(或几个)部分中指导基因表达(通常贯穿那些植物部分的一生)的启动子。组织特异性启动子的类别通常也包括其特异性不绝对的启动子，即其可也在优选组织之外的组织中以较低水平指导表达。
[0145] 许多组织特异性启动子为本领域所已知，包括与马铃薯块茎中表达的马铃薯块茎蛋白基因和小麦、大麦或玉米胚乳中表达的高分子量麦谷蛋白基因相关的那些。任何这些启动子均可在本发明中使用。
[0146] 合适地组织特异性启动子可为叶特异性启动子。合适的叶特异性启动子可包括不对称叶(ASYMMETRIC LEAVES) 1 (AS1)。
[0147] 在另一个实施方案中启动子可为发育调节的启动子。
[0148] 发育调节的启动子指导一个或多个植物部分中的基因表达在植物发育期间的特定时间变化。该基因可在该植物部分在其它时间以不同的(通常较低的)水平表达，和也可在其它植物部分中表达。
[0149] 在一个实施方案中启动子可为可诱导的启动子。
[0150] 可诱导的启动子能够指导基因响应诱导物表达。不存在诱导物下基因将不会表达。诱导物可直接作用于启动子序列，或可通过抵抗阻遏物分子的效果起作用。诱导物可为化学剂例如代谢物、蛋白、生长调节物或有毒元素、生理应激例如热、创伤或渗透压或病原体或害虫作用的间接后果。发育调节的启动子可被描述为在植物生命周期的特定点响应植物产生的内源性诱导物或环境刺激的特定类型的可诱导的启动子。已知的可诱导的启动子的实例包括与创伤反应(例如由Warner SA, Scott R, Draper J. (1993) (Isolation of an asparagus intracellular PR gene (AoPR1) wound-responsive promoter by the inverse polymerase chain reaction and its characterization in transgenic tobacco (通过反向聚合酶链反应分离芦笋胞内PR基因(AoPR1)创伤响应启动子及其在转基因烟草中的表征). Plant J. 3 191-201，其通过引用结合到本文中)所描述的)、温度反应(如Benfey & Chua (1989) (Benfey, P.N.,和Chua, N-H. (1989) Regulated genes in transgenic plants (转基因植物中的调节基因). Science 244 174-181，其通过引用结合到本文中)所公开的)和化学诱导(如Gatz (1995) (Gatz, C. (1995) Novel inducible/repressible gene expression systems (新的可诱导的/可阻遏的基因表达系统). Methods in Cell Biol. 50411-424，其通过引用结合到本文中)所描述的)相关的那些。
[0151] 因此在一个实施方案中启动子可选自：CERV启动子、花椰菜花叶病毒35S启动子(完全的或截短的)、核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子、豌豆质体蓝素启动子、胭脂碱合酶启动子、叶绿素r/b结合启动子、高分子量麦谷蛋白启动子、α, β-麦醇溶蛋白启动子、大麦醇溶蛋白启动子和马铃薯块茎蛋白启动子。
[0152] 本发明进一步提供包含与叶特异性启动子操作性连接的编码EGY多肽的核酸的构建体或载体。
[0153] 本发明还提供包含与衰老特异性启动子操作性连接的编码EGY多肽的核酸的构建体或载体。
[0154] 可在载体中包含构建体。合适地载体可为质粒。
[0155] 植物本发明的植物(或其部分)或植物细胞或植物繁殖材料可为作物植物，例如果实作物、种子作物、豆类或坚果作物。
[0156] 本发明的作物植物可选自烟草、番茄、草莓、樱桃、红醋栗、黑醋栗、醋栗、覆盆子、桑椹、辣椒(辣椒属)、辣椒(胡椒属)、西瓜、甜瓜、南瓜、葫芦或茄子(aubergine, eggplant)、橄榄、萝卜、辣根、香蕉、苹果、梨、桃、葡萄藤、柑橘种类、小麦、燕麦、大麦、小黑麦、水稻、藜麦(奎奴亚藜)、福尼奥米(马唐属)、玉米、高粱、黑麦、洋葱、韭菜、小米、荞麦、甘蔗、向日葵、油籽油菜籽(包括低芥酸菜籽)、秋葵、咖啡和可可(Theobroma cacao)、棕榈、棉花、椰子、芝麻、红花、亚麻、木棉、芥末、肉豆蔻、荷荷巴油、豌豆、豆子、苜蓿、扁豆、大豆、花生、杏仁、山核桃、开心果、核桃、巴西坚果、榛子、澳洲坚果、腰果、橡子、山毛榉、榛子和栗子。
[0157] 本发明的植物(或其部分)或植物细胞或植物繁殖材料可为果实作物。本发明的果实作物可选自：番茄、草莓、樱桃、红醋栗、黑醋栗、醋栗、覆盆子、桑椹、辣椒(辣椒属)、辣椒(胡椒属)、西瓜、甜瓜、南瓜、葫芦、茄子、橄榄、萝卜、辣根、香蕉、苹果、梨、桃、葡萄藤和柑橘种类。
[0158] 本发明的植物(或其部分)或植物细胞或植物繁殖材料可为种子作物。本发明的种子作物可为谷类或谷物作物，例如，选自以下的谷类或谷物作物：小麦、燕麦、大麦、小黑麦、水稻、藜麦(奎奴亚藜)、福尼奥米(马唐属)、玉米、高粱、黑麦、洋葱、韭菜、小米、荞麦、甘蔗。在另一个实施方案中本发明的种子作物可选自：向日葵、油籽油菜籽(包括低芥酸菜籽)、秋葵、咖啡、可可(Theobroma cacao)、棕榈、棉花、椰子、芝麻、红花、亚麻、木棉、芥末、肉豆蔻和荷荷巴油。
[0159] 本发明的植物(或其部分)或植物细胞或植物繁殖材料可为豆类。本发明的豆类可选自豌豆、豆子、苜蓿、扁豆、大豆和花生。
[0160] 本发明的植物(或其部分)或植物细胞或植物繁殖材料可为果实或种子作物，所述果实或种子作物为坚果作物。本发明的坚果作物可选自杏仁、山核桃、开心果、核桃、巴西坚果、榛子、澳洲坚果、腰果、橡子、山毛榉、榛子和栗子。
[0162] 如本文所使用的，术语“植物”指在其生命周期或发育的任何阶段的任何植物及其子代。一般而言，除非另有说明，当提及“植物”时，其意在覆盖任何发育阶段的植物，包括单细胞和种子。因此在具体的实施方案中，本发明提供植物细胞，例如分离的植物细胞，所述细胞具有如本文所定义的“修饰的植物”的一个或多个特性。
[0163] 在一个实施方案中，本发明提供植物细胞(例如烟草植物细胞)，其：i) 包含如本文所定义的编码EGY蛋白的外源性EGY基因(例如外源多核苷酸)；
ii) 包含如本文所定义的构建体或载体；和/或
iii) 通过本文所描述的方法或用途可获得(例如获得)。
ii) 包含如本文所定义的构建体或载体；和/或
iii) 通过本文所描述的方法或用途可获得(例如获得)。
[0164] 在另一个实施方案中，本发明提供植物(例如烟草植物)，其：i) 包含如本文所定义的编码EGY蛋白的外源性EGY基因(例如外源多核苷酸)；
ii) 经修饰以达到与未修饰的植物相比氮使用效率和/或氮利用效率增加，其中所述修饰为增加所述修饰植物中EGY多肽的活性或表达；
iii) 通过本文所描述的方法或用途可获得；
iv) 包含如本文所定义的构建体或载体；和/或
v) 包含如本文所定义的细胞。
ii) 经修饰以达到与未修饰的植物相比氮使用效率和/或氮利用效率增加，其中所述修饰为增加所述修饰植物中EGY多肽的活性或表达；
iii) 通过本文所描述的方法或用途可获得；
iv) 包含如本文所定义的构建体或载体；和/或
v) 包含如本文所定义的细胞。
[0165] 在一个实施方案中植物繁殖材料可为从本发明的植物(例如烟草植物)可获得的。
[0166] 如本文所使用的术语“植物繁殖材料”是指取自植物的任何植物物质，可从其产生进一步的植物。合适地植物繁殖材料可为种子。
[0167] 在一个实施方案中修饰的植物为转基因植物。
[0168] 如本文所使用的术语“消耗”意指由人或动物(优选人)摄入。如本文所使用的术语“可消耗的”意指人或动物(优选人)可摄入。摄入可为吃的形式，例如经由口进入身体用于消化和吸收，在该情况下植物将会为食用植物。在其它实施方案中植物可通过燃烧或加热植物材料或其提取物(例如烟草提取物)和吸入因此产生的烟气或烟消耗或可消耗。在后一种情况下消耗可经由口和肺进行。
[0169] 本发明进一步提供本发明的植物的收获的叶。合适地收获的叶可为收获的烟草叶。
[0170] 术语收获的意指将植物的叶或叶们从植物的根移除。收获的叶可由叶和茎材料组成。
[0171] 合适地收获的叶(例如烟草叶)可经受下游处理。因此在一个实施方案中收获的叶可经处理以产生处理的叶。
[0172] 在特别优选的实施方案中，本发明的植物(或其部分)或植物细胞或植物繁殖材料为烟草植物。
[0173] 烟草植物本发明提供指向烟草植物的方法、用途以及烟草细胞、烟草植物和植物繁殖材料。
[0174] 如本文所使用的术语“烟草植物”指烟草产品生产中使用的烟草属中的植物。合适的烟草植物的非限制性实例包括普通烟草和黄花烟草(例如，TN90、K326、LA B21、LN KY171、Tl 1406、Basma、Galpao、Perique、Beinhart 1000-1和Petico)。不意在将术语“烟草”延伸至不用于烟草产品生产的烟草属物种。
[0175] 因此，在一个实施方案中烟草植物确实包括皱叶烟草(Nicotiana plumbaginifolia)。
[0176] 烟草材料可从普通烟草物种的品种(通常称为白肋品种、烤烟或明亮的品种、黑色品种和东方/土耳其品种)衍生。在一些实施方案中，烟草材料从白肋、Virginia、烤制的、晾制的、熏制的、东方的或黑色烟草植物衍生。烟草植物可选自马里兰烟草、稀有烟草、特种烟草、膨胀烟草等。
[0177] 在一个实施方案中，烟草植物不是白肋类型。
[0178] 本文中也考虑使用烟草栽培种和良种烟草栽培种。因此用于本文中的烟草植物可为烟草品种或良种烟草栽培种。
[0179] 特别有用的普通烟草品种包括黑色型、烤制型和东方型烟草。
[0180] 在一些实施方案中，烟草植物可，例如，选自一种或多种下列品种：普通烟草AA 37-1、普通烟草B 13P、普通烟草Xanthi (Mitchell-Mor)、普通烟草KT D#3 杂种107、普通烟草Bel-W3、普通烟草79-615、普通烟草Samsun Holmes NN、来自杂交普通烟草BU21 x 普通烟草Hoja Parado的F4、系97、普通烟草KTRDC#2杂种49、普通烟草KTRDC#4杂种1 10、普通烟草白肋21、普通烟草PM016、普通烟草KTRDC#5 KY 160 SI、普通烟草KTRDC#7 FCA、普通烟草KTRDC#6 TN 86 SI、普通烟草PM021、普通烟草K 149、普通烟草K 326、普通烟草K 346、普通烟草K 358、普通烟草K 394、普通烟草K 399、普通烟草K 730、普通烟草KY 10、普通烟草KY 14、普通烟草KY 160、普通烟草KY 17、普通烟草KY 8959、普通烟草KY 9、普通烟草KY
907、普通烟草MD 609、普通烟草McNair 373、普通烟草NC 2000、普通烟草PG 01、普通烟草PG 04、普通烟草P01、普通烟草P02、普通烟草P03、普通烟草RG 1 1、普通烟草RG 17、普通烟草RG 8、普通烟草Speight G-28、普通烟草TN 86、普通烟草TN 90、普通烟草VA 509、普通烟草AS44、普通烟草Banket A1、普通烟草Basma Drama B84/31、普通烟草Basma I Zichna ZP4/B、普通烟草Basma Xanthi BX 2A、普通烟草Batek、普通烟草Besuki Jember、普通烟草C104、普通烟草Coker 319、普通烟草Coker 347、普通烟草Criollo Misionero、普通烟草PM092、普通烟草Delcrest、普通烟草Djebel 81、普通烟草DVH 405、普通烟草Galpao Comum、普通烟草HB04P、普通烟草Hicks Broadleaf、普通烟草Kabakulak Elassona、普通烟草PM102、普通烟草Kutsage E1、普通烟草KY 14xL8、普通烟草KY 171、普通烟草LA BU 21、普通烟草McNair 944、普通烟草NC 2326、普通烟草NC 71、普通烟草NC 297、普通烟草NC 3、普通烟草PVH 03、普通烟草PVH 09、普通烟草PVH 19、普通烟草PVH 21 10、普通烟草Red Russian、普通烟草Samsun、普通烟草Saplak、普通烟草Simmaba、普通烟草Talgar 28、普通烟草PM132、普通烟草Wislica、普通烟草Yayaldag、普通烟草NC 4、普通烟草TR Madole、普通烟草Prilep HC-72、普通烟草Prilep P23、普通烟草Prilep PB 156/1、普通烟草Prilep P12-2/1、普通烟草Yaka JK-48、普通烟草Yaka JB 125/3、普通烟草ΤΊ-1068、普通烟草KDH-960、普通烟草TI-1070、普通烟草TW136、普通烟草PM204、普通烟草PM205、普通烟草Basma、普通烟草TKF 4028、普通烟草L8、普通烟草TKF 2002、普通烟草TN90、普通烟草GR141、普通烟草Basma xanthi、普通烟草GR149、普通烟草GR153和普通烟草Petit Havana。
907、普通烟草MD 609、普通烟草McNair 373、普通烟草NC 2000、普通烟草PG 01、普通烟草PG 04、普通烟草P01、普通烟草P02、普通烟草P03、普通烟草RG 1 1、普通烟草RG 17、普通烟草RG 8、普通烟草Speight G-28、普通烟草TN 86、普通烟草TN 90、普通烟草VA 509、普通烟草AS44、普通烟草Banket A1、普通烟草Basma Drama B84/31、普通烟草Basma I Zichna ZP4/B、普通烟草Basma Xanthi BX 2A、普通烟草Batek、普通烟草Besuki Jember、普通烟草C104、普通烟草Coker 319、普通烟草Coker 347、普通烟草Criollo Misionero、普通烟草PM092、普通烟草Delcrest、普通烟草Djebel 81、普通烟草DVH 405、普通烟草Galpao Comum、普通烟草HB04P、普通烟草Hicks Broadleaf、普通烟草Kabakulak Elassona、普通烟草PM102、普通烟草Kutsage E1、普通烟草KY 14xL8、普通烟草KY 171、普通烟草LA BU 21、普通烟草McNair 944、普通烟草NC 2326、普通烟草NC 71、普通烟草NC 297、普通烟草NC 3、普通烟草PVH 03、普通烟草PVH 09、普通烟草PVH 19、普通烟草PVH 21 10、普通烟草Red Russian、普通烟草Samsun、普通烟草Saplak、普通烟草Simmaba、普通烟草Talgar 28、普通烟草PM132、普通烟草Wislica、普通烟草Yayaldag、普通烟草NC 4、普通烟草TR Madole、普通烟草Prilep HC-72、普通烟草Prilep P23、普通烟草Prilep PB 156/1、普通烟草Prilep P12-2/1、普通烟草Yaka JK-48、普通烟草Yaka JB 125/3、普通烟草ΤΊ-1068、普通烟草KDH-960、普通烟草TI-1070、普通烟草TW136、普通烟草PM204、普通烟草PM205、普通烟草Basma、普通烟草TKF 4028、普通烟草L8、普通烟草TKF 2002、普通烟草TN90、普通烟草GR141、普通烟草Basma xanthi、普通烟草GR149、普通烟草GR153和普通烟草Petit Havana。
[0181] 品种或栽培种的非限制性实例为：BD 64、CC 101、CC 200、CC 27、CC 301、CC 400、CC 500、CC 600、CC 700、CC 800、CC 900、Coker 176、Coker 319、Coker 371 Gold、Coker 48、CD 263、DF91 1、DT 538 LC Galpao烟草、GL 26H、GL 350、GL 600、GL 737、GL 939、GL
973、HB 04P、HB 04P LC、HB3307PLC、杂种403LC、杂种404LC、杂种501 LC、K 149、K 326、K
346、K 358、K394、K 399、K 730、KDH 959、KT 200、KT204LC、KY10、KY14、KY 160、KY 17、KY
171、KY 907、KY907LC、KTY14xL8 LC、Little Crittenden、McNair 373、McNair 944、msKY
14xL8、窄叶Madole、窄叶Madole LC、NBH 98、N-126、N-777LC、N-7371 LC、NC 100、NC 102、NC 2000、NC 291、NC 297、NC 299、NC 3、NC 4、NC 5、NC 6、NC7、NC 606、NC 71、NC 72、NC
810、NC BH 129、NC 2002、Neal Smith Madole、OXFORD 207、PD 7302 LC、PD 7309 LC、PD
7312 LC 'Periq'e'烟草、PVH03、PVH09、PVH19、PVH50、PVH51、R 610、R 630、R 7-1 1、R 7-
12、RG 17、RG 81、RG H51、RGH 4、RGH 51、RS 1410、Speight 168、Speight 172、Speight
179、Speight 210、Speight 220、Speight 225、Speight 227、Speight 234、Speight G-28、Speight G-70、Speight H-6、Speight H20、Speight NF3、Tl 1406、Tl 1269、TN 86、TN86LC、TN 90、TN 97、TN97LC、TN D94、TN D950、TR (Tom Rosson) Madole、VA 309、VA359、AA 37-1、B 13P、Xanthi (Mitchell-Mor)、Bel-W3、79-615、Samsun Holmes NN、KTRDC 2号杂种49、白肋烟草21、KY 8959、KY 9、MD 609、PG 01、PG 04、P01、P02、P03、RG 1 1、RG 8、VA
509、AS44、Banket A1、Basma Drama B84/31、Basma I Zichna ZP4/B、Basma Xanthi BX
2A、Batek、Besuki Jember、C104、Coker 347、Criollo Misionero、Delcrest、Djebel 81、DVH 405、Galpao Comum、HB04P、Hicks Broadleaf、Kabakulak Elassona、Kutsage E1、LA BU 21、NC 2326、NC 297、PVH 21 10、Red Russian、Samsun、Saplak、Simmaba、Talgar 28、Wislica、Yayaldag、Prilep HC-72、Prilep P23、Prilep PB 156/1、Prilep P12-2/1、Yaka JK-48、Yaka JB 125/3、TI-1068、KDH-960、Tl-1070、TW136、Basma、TKF 4028、L8、TKF 2002、GR141、Basma xanthi、GR149、GR153、Petit Havana。也考虑以上的低转换亚种，即使未在本文中具体鉴定。
973、HB 04P、HB 04P LC、HB3307PLC、杂种403LC、杂种404LC、杂种501 LC、K 149、K 326、K
346、K 358、K394、K 399、K 730、KDH 959、KT 200、KT204LC、KY10、KY14、KY 160、KY 17、KY
171、KY 907、KY907LC、KTY14xL8 LC、Little Crittenden、McNair 373、McNair 944、msKY
14xL8、窄叶Madole、窄叶Madole LC、NBH 98、N-126、N-777LC、N-7371 LC、NC 100、NC 102、NC 2000、NC 291、NC 297、NC 299、NC 3、NC 4、NC 5、NC 6、NC7、NC 606、NC 71、NC 72、NC
810、NC BH 129、NC 2002、Neal Smith Madole、OXFORD 207、PD 7302 LC、PD 7309 LC、PD
7312 LC 'Periq'e'烟草、PVH03、PVH09、PVH19、PVH50、PVH51、R 610、R 630、R 7-1 1、R 7-
12、RG 17、RG 81、RG H51、RGH 4、RGH 51、RS 1410、Speight 168、Speight 172、Speight
179、Speight 210、Speight 220、Speight 225、Speight 227、Speight 234、Speight G-28、Speight G-70、Speight H-6、Speight H20、Speight NF3、Tl 1406、Tl 1269、TN 86、TN86LC、TN 90、TN 97、TN97LC、TN D94、TN D950、TR (Tom Rosson) Madole、VA 309、VA359、AA 37-1、B 13P、Xanthi (Mitchell-Mor)、Bel-W3、79-615、Samsun Holmes NN、KTRDC 2号杂种49、白肋烟草21、KY 8959、KY 9、MD 609、PG 01、PG 04、P01、P02、P03、RG 1 1、RG 8、VA
509、AS44、Banket A1、Basma Drama B84/31、Basma I Zichna ZP4/B、Basma Xanthi BX
2A、Batek、Besuki Jember、C104、Coker 347、Criollo Misionero、Delcrest、Djebel 81、DVH 405、Galpao Comum、HB04P、Hicks Broadleaf、Kabakulak Elassona、Kutsage E1、LA BU 21、NC 2326、NC 297、PVH 21 10、Red Russian、Samsun、Saplak、Simmaba、Talgar 28、Wislica、Yayaldag、Prilep HC-72、Prilep P23、Prilep PB 156/1、Prilep P12-2/1、Yaka JK-48、Yaka JB 125/3、TI-1068、KDH-960、Tl-1070、TW136、Basma、TKF 4028、L8、TKF 2002、GR141、Basma xanthi、GR149、GR153、Petit Havana。也考虑以上的低转换亚种，即使未在本文中具体鉴定。
[0182] 在一个实施方案中植物繁殖材料可为从本发明的烟草植物可获得的。
[0183] 如本文所使用的“植物繁殖材料”指取自植物的任何植物物质，从其可产生进一步的植物。
[0184] 合适地植物繁殖材料可为种子。
[0185] 在一个实施方案中本发明的烟草细胞、烟草植物和/或植物繁殖材料可包含外源性EGY蛋白。在另一个实施方案中烟草细胞、烟草植物和/或植物繁殖材料可包含本发明的构建体或载体。在另一个实施方案中烟草细胞、烟草植物和/或植物繁殖材料可为通过本发明的方法可获得的(例如获得的)。
[0186] 合适地当与未修饰的烟草植物相比时本发明的烟草植物可包含减少的量的至少一种烟草特异性亚硝胺，其中所述修饰为增加所述修饰植物中的EGY蛋白的活性或表达。
[0187] 在一个实施方案中本发明的烟草植物包含本发明的烟草细胞。
[0188] 在另一个实施方案中植物繁殖材料可为从本发明的烟草植物可获得的(例如获得的)。
[0189] 在另一个实施方案中烟草细胞、烟草植物和/或植物繁殖材料可包含如本文所定义的EGY多核苷酸或基因或EGY多肽。
[0190] 合适地，烟草细胞、烟草植物和/或植物繁殖材料可包含：i) 本文中显示为SEQ ID NO: 4、5、21或22的多核苷酸序列或与SEQ ID NO: 4、5、21或
22具有至少70%序列同一性的多核苷酸序列，或
ii) 编码包含本文中显示为SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3的氨基酸序列或其功能片段或与SEQ ID NO: 2或3或其功能片段具有至少70%序列同一性的序列的多肽的多核苷酸，iii) 可与以上i)或ii)中教导的多核苷酸在高度严格条件下杂交的多核苷酸序列，或iv) 与上述i)、ii)或iii)中显示的多核苷酸具有至少70% (优选地85%，更优选地90%)同一性的多核苷酸序列，或
v) 由于遗传密码简并性与i)、ii)或iii)中显示的多核苷酸不同的多核苷酸序列。
22具有至少70%序列同一性的多核苷酸序列，或
ii) 编码包含本文中显示为SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3的氨基酸序列或其功能片段或与SEQ ID NO: 2或3或其功能片段具有至少70%序列同一性的序列的多肽的多核苷酸，iii) 可与以上i)或ii)中教导的多核苷酸在高度严格条件下杂交的多核苷酸序列，或iv) 与上述i)、ii)或iii)中显示的多核苷酸具有至少70% (优选地85%，更优选地90%)同一性的多核苷酸序列，或
v) 由于遗传密码简并性与i)、ii)或iii)中显示的多核苷酸不同的多核苷酸序列。
[0191] 在一个实施方案中多核苷酸序列可与SEQ ID NO: 4、5、21或22具有至少80%同一性。在一个实施方案中多核苷酸序列可与SEQ ID NO: 4或5具有至少80%同一性。
[0192] 合适地多核苷酸序列可与SEQ ID NO: 4、5、21或22具有至少90%同一性。在一个实施方案中多核苷酸序列可与SEQ ID NO: 4或5具有至少90%同一性。
[0193] 合适地多核苷酸序列可与SEQ ID NO: 4、5、21或22具有至少95%同一性(更合适地至少99%同一性)。在一个实施方案中多核苷酸序列可与SEQ ID NO: 4或5具有至少95%同一性。
[0194] 在另一个实施方案中烟草细胞、烟草植物和/或植物繁殖材料可包含含有具有以下保守残基的多肽序列的EGY蛋白：包含Gly-176、Asn-177、Leu-178和Arg-179的GNLR基序、包含His-311、Glu-312、X-313、X-314和His-311的HEXXH基序和包含Asn-441、X-442、X-443、Pro-444、X-445、X-446、X-447、Leu-448、Asp-449和Gly-450的NXXPXXXLDG基序；其中X为任何氨基酸并且其中保守残基的编号意指EGY蛋白与具有SEQ ID NO: 1的拟南芥EGY1蛋白比对时的有效等效位置。
[0195] 合适地多肽可包含显示为SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3的多肽或其功能片段或与SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3或其功能片段具有至少70%序列同一性的序列。
[0196] 合适地多肽可与SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3或其功能片段具有至少80%同一性。更合适地多肽可与SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3或其功能片段具有至少90%同一性。特别地多肽可与SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3或其功能片段具有至少95%同一性。
[0197] 合适地多肽可与SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3具有至少80%同一性。更合适地多肽可与SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3具有至少90%同一性。特别地多肽可与SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3具有至少95%同一性。
[0198] 最合适地多肽可与SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3具有至少99%同一性。
[0199] 在一个实施方案中提供如前述实施方案中所提供的烟草细胞用于生产烟草产品的用途。
[0200] 另外提供如本文所描述的烟草植物用于培育烟草植物的用途。
[0201] 在另一个实施方案中本发明还提供前述实施方案的烟草植物用于生产烟草产品的用途。
[0202] 在另一个实施方案中提供本发明的烟草植物用于生长作物的用途。
[0203] 商业期需的性状术语“商业期需的性状”将会包括性状例如产量和/或质量。
[0204] 分子标志辅助选择分子标志辅助选择可包括进行PCR以鉴定期需的天然存在的遗传变体或渗入的核酸序列，其包含变体EGY核苷酸序列和具有改变的EGY蛋白表达或活性的。
[0205] 在一个实施方案中变体EGY核苷酸序列可增加EGY蛋白的表达或活性。
[0206] 产品本发明还提供从本发明的植物(例如烟草植物)可获得或获得的产品。
[0207] 在一个实施方案中提供本发明的烟草植物用于生产烟草叶的用途。
[0209] 在另一个实施方案中烟草叶可被切割。在一些实施方案中烟草叶可在经受调制、发酵、巴氏杀菌或其组合之前或之后切割。
[0210] 在一个实施方案中本发明提供本发明的烟草植物的收获的叶。
[0211] 在进一步的实施方案中收获的叶可为从自本发明的繁殖材料繁殖的烟草植物可获得的(例如获得)。
[0212] 在另一个实施方案中提供从本发明的方法或用途可获得的收获的叶。
[0213] 合适地收获的叶可为切割的收获的叶。
[0214] 在一些实施方案中收获的叶可包含活烟草细胞。在其它实施方案中收获的叶可经受进一步的处理。
[0215] 还提供处理的烟草叶。
[0216] 处理的烟草叶可为从本发明的烟草植物可获得的。合适地处理的烟草叶可为从根据本发明的任何方法和/或用途获得的烟草植物可获得的。
[0217] 在另一个实施方案中处理的烟草叶可为从自本发明的烟草植物繁殖材料繁殖的烟草植物可获得的。
[0218] 本发明的处理的烟草叶可为通过处理本发明的收获的叶可获得的。
[0219] 如本文所使用的术语“处理的烟草叶”指已经经历本领域中烟草所经受的一个或多个处理步骤的烟草叶。“处理的烟草叶”不包含或基本不包含活细胞。
[0220] 术语“活细胞”指能够生长和/或为代谢活跃的细胞。因此，如果细胞被称为无活力，也称为“不能存活的”，那么细胞不能显示活细胞的特性。
[0221] 术语“基本无活细胞”意指小于约5%的总细胞为有活力的。优选地，小于约3%，更优选地小于约1%，甚至更优选地小于约0.1%的总细胞为有活力的。
[0222] 在一个实施方案中处理的烟草叶可通过以下的一种或多种处理：调制、发酵和/或巴氏杀菌。
[0223] 合适地处理的烟草叶可通过调制处理。
[0224] 烟草叶可通过任何本领域已知的方法调制。在一个实施方案中烟草叶可通过选自以下的一种或多种调制方法调制：晾制、熏制、烤制和晒制。
[0225] 合适地烟草叶可晾制。
[0227] 合适地烟草叶可熏制。熏制通常通过将烟草叶悬挂在其中硬木火保持连续或间歇的低闷烧的大谷仓中达成，通常耗费3天-10天，取决于过程和烟草。
[0228] 在另一个实施方案中烟草叶可烤制。烤制可包括将烟草叶串在烟草棍上并将其悬挂在调制谷仓的层柱上。谷仓通常具有烟道，其从外部进料的火箱运行。通常这导致不暴露于烟而加热调制的烟草。通常温度将会在调制过程期间缓慢升高，整个过程消耗大约1周。
[0229] 合适地烟草叶可晒制。该方法通常涉及将无遮盖的烟草暴露于太阳。
[0230] 合适地处理的烟草叶可通过发酵处理。
[0231] 发酵可以以本领域已知的任何方式进行。通常在发酵期间，将烟草叶堆成调制烟草的堆(批)，覆盖例如粗麻布以保留水份。叶内部剩余的水和烟草重量的组合产生天然热，这使烟草成熟。每日监测批中心的温度。在一些方法中每周打开整个批。然后移除叶以摇动和湿润，并旋转批以致内部的叶到外部和底部的叶放置在批顶部。这确保遍及整批的均匀发酵。叶上额外的水份，加上叶自身的实际旋转，产生热，释放烟草的天然铵和减少烟碱，同时也加深颜色和改善烟草的芳香。通常发酵过程持续至多6个月，取决于烟草的品种、叶上的柄位置、叶的厚度和预期用途。
[0232] 合适地处理的烟草叶可通过巴氏杀菌处理。当烟草叶将会用于制造无烟烟草产品，最优选地鼻烟时，可特别优选巴氏杀菌。
[0233] 烟草叶巴氏灭菌法可通过本领域已知的任何方法进行。例如巴氏灭菌法可以如J Foulds, L Ramstrom, M Burke, K Fagerstrom. Effect of smokeless tobacco (snus) on smoking and public health in Sweden (无烟烟草(鼻烟)对瑞典吸烟和公众健康的作用) (通过引用结合到本文中)中所详述的进行。
[0234] Tobacco Control (2003) 12: 349–359，其教导通过引用结合到本文中。
[0236] 在一个实施方案中巴氏灭菌法可为蒸汽巴氏灭菌法。
[0237] 在一些实施方案中处理的烟草叶可被切割。处理的烟草叶可在处理之前或之后切割。合适地，处理的烟草叶可在处理之后切割。
[0238] 在一些实施方案中烟草植物、烟草植物的收获的叶和/或处理的烟草叶可用于提取烟碱。烟碱提取可使用本领域已知的任何方法达成。例如，用于从烟草提取烟碱的方法在US 2,162,738中教导，其通过引用结合到本文中。
[0239] 在另一个方面本发明提供烟草产品。
[0240] 在一个实施方案中烟草产品可从本发明的烟草植物或其部分制备。
[0241] 合适地烟草植物或其部分可从本发明的烟草植物繁殖材料繁殖。
[0242] 如本文在烟草植物的背景下使用的术语“其部分”指烟草植物的部分。优选地“其部分”为烟草植物的叶。
[0243] 在另一个实施方案中烟草产品可从本发明的收获的叶制备。
[0244] 在进一步的实施方案中烟草产品可从本发明的处理的烟草叶制备。
[0245] 合适地烟草产品可从通过调制、发酵和/或巴氏杀菌中的一种或多种处理的烟草叶制备。
[0246] 合适地烟草产品可包括切割的烟草叶，任选按照前述实施方案处理。
[0247] 在一个实施方案中烟草产品可为吸烟制品。
[0249] 在另一个实施方案中烟草产品可为无烟烟草产品。
[0250] 如本文所使用的术语“无烟烟草产品”指不意在吸烟和/或经受燃烧的烟草产品。在一个实施方案中无烟烟草产品可包括鼻烟(snus)、鼻烟(snuff)、咀嚼烟草等。
[0251] 在进一步的实施方案中烟草产品可为烟草加热装置。
[0252] 通常在加热的吸烟制品中，气溶胶通过热从热源向物理上分离的气溶胶形成基底或材料(可位于热源内部、周围或下游)转移而产生。吸烟期间，挥发性化合物通过来自热源的热转移从气溶胶形成基底释放并夹带在通过吸烟制品吸入的空气中。随着释放的化合物冷却，其冷凝以形成被使用者吸入的气溶胶。
[0253] 用于消耗或吸烟烟草加热装置的气溶胶产生制品和装置为本领域所已知。其可包括，例如，电加热的气溶胶产生装置，其中气溶胶通过热从气溶胶产生装置的一个或多个电加热元件向烟草加热装置的气溶胶形成基底转移而产生。
[0254] 合适地烟草加热装置可为气溶胶产生装置。
[0255] 优选地烟草加热装置可为热但不燃烧的装置。热但不燃烧装置为本领域所已知，通过加热而不是燃烧烟草释放化合物。
[0256] 合适的热但不燃烧装置的实例可为WO2013/034459或GB2515502中教导的装置，其通过引用结合到本文中。
[0257] 在一个实施方案中烟草加热装置的气溶胶形成基底可为本发明的烟草产品。
[0258] 多核苷酸/多肽/构建体/方法在本发明的某些实施方案中，可将编码目的蛋白(例如EGY蛋白)的嵌合基因转化入植物细胞中，导致在启动子指导下受控表达目的蛋白。启动子可从不同的源获得，包括动物、植物、真菌、细菌和病毒。也可合成构建启动子。
[0259] 外源基因可通过合适的载体例如植物转化载体的手段引入本发明的植物中。植物转化载体可包含表达盒，其在转录的5’-3’方向包含启动子序列、目的基因(例如下调的硝酸盐还原酶)编码基因(任选包含内含子)和任选地3’非翻译的终止子序列，后者包含RNA聚合酶的终止信号和聚腺苷化酶的聚腺苷酸化信号。启动子序列可以以一个或多个拷贝存在，并且这样的拷贝可为相同的或如上所述的启动子序列的变体。终止子序列可从植物、细菌或病毒基因获得。例如，合适的终止子序列为豌豆rbcS E9终止子序列、衍生自根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂碱合酶基因的nos终止子序列和来自花椰菜花叶病毒的35S终止子序列。本领域技术人员可容易地意识到其它合适的终止子序列。
[0260] 表达盒可还包含基因表达增强机制以增加启动子强度。这种增强子元件的实例为衍生自豌豆质体蓝素基因的启动子的部分的增强子元件，其为国际专利申请号WO 97/20056 (通过引用结合到本文中)的主题。例如，合适的增强子元件可为衍生自根癌土壤杆菌胭脂碱合酶基因的nos增强子元件和来自花椰菜花叶病毒的35S增强子元件。这些调节区域可衍生自与启动子DNA序列相同的基因或可衍生自不同基因，来自普通烟草或其它有机体，例如来自茄科(Solanaceae)植物，或来自Cestroideae亚科。所有调节区域应能够在待转化组织的细胞中操作。
[0261] 启动子DNA序列可衍生自与本发明中使用的目的基因(例如启动子要指导的基因，例如编码植物修饰以增加LBD氮响应转录因子的活性或表达的基因)编码序列相同的基因或可衍生自不同的基因，来自普通烟草或另一种有机体，例如来自茄科植物，或来自Cestroideae亚科。当提及“嵌合基因”时，其意指编码目的基因(例如编码下调的硝酸盐还原酶的基因)的核酸序列衍生自与指导其表达的启动子序列不同的源(例如来自不同的基因，或来自不同的物种)。
[0262] 可将表达盒掺入基础植物转化载体，例如pBIN 19 Plus、pBI 101或本领域已知的其它合适的植物转化载体中。除了表达盒，植物转化载体将会包含转化过程所必需的序列。这些可包括土壤杆菌属vir基因、一个或多个T-DNA边界序列和选择性标志或鉴定转基因植物细胞的其它手段。
[0263] 术语“植物转化载体”意指能够体内或体外表达的构建体。优选地，将表达载体掺入有机体的基因组中。术语“掺入”优选地覆盖稳定掺入基因组中。
[0264] 用于转化植物的技术为本领域所熟知，包括，例如，土壤杆菌属介导的转化。构建遗传修饰的植物的基本原理为在植物基因组中插入遗传信息以便获得稳定维持插入的遗传物质。通用技术的综述可见于Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225)和Christon (AgroFood-Industry Hi-Tech 三月/四月1994 17-27)的文章中，其各自通过引用结合到本文中。
[0265] 通常，在土壤杆菌属介导的转化中，将携带外源目的DNA即嵌合基因的双元载体通过共培养土壤杆菌属与来自靶植物的外植体从适当的土壤杆菌属菌株转移至靶植物。转化的植物组织然后在选择培养基上再生，所述选择培养基包含选择性标志和植物生长激素。替代方案为花序浸渍法(Clough & Bent, 1998)，借此使得完整植物的花芽与包含嵌合基因的土壤杆菌属菌株的悬浮液接触，结籽之后，使转化个体发芽和通过在选择培养基上生长鉴定。通过土壤杆菌属直接转染植物为已经广泛使用的简单的技术，其在Butcher D. N.等人, (1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists (植物病理学家的组织培养方法)编辑: D. S. Ingrams和J.P. Helgeson, 203-208 (通过引用结合到本文中)中描述。
[0267] 使用弹道转化(包括碳化硅晶须技术)转化植物在Frame B R, Drayton P R, Bagnaall S V, Lewnau C J, Bullock W P, Wilson H M, Dunwell J M, Thompson J A & Wang K (1994)中教导。通过碳化硅晶须介导的转化产生能育的转基因玉米植物在The Plant Journal 6: 941-948)中教导，病毒转化技术在例如Meyer P, Heidmmm I & Niedenhof I (1992)中教导。使用木薯花叶病毒作为用于植物的载体系统在Gene 110: 213-217中教导。对植物转化的进一步的教导可见于EP-A-0449375中(其各自通过引用结合到本文中)。
[0268] 在进一步的方面，本发明涉及携带编码目的基因(例如编码EGY蛋白的基因)和将其引入有机体例如植物的基因组中的核苷酸序列的载体系统。所述载体系统可包含一个载体，但其可包含两个载体。在两个载体的情况下，载体系统通常被称为双元载体系统。双元载体系统在Gynheung Anetal, (1980), Binary Vectors, Plant Molecular Biology Manual A3, 1-19 (通过引用结合到本文中)进一步详细描述。
[0269] 一个广泛使用的用于转化植物细胞的系统使用来自根癌土壤杆菌的Ti质粒或来自毛根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的Ri质粒Anetal., (1986), Plant Physiol. 81, 301-305和Butcher D. N.等人, (1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists (植物病理学家的组织培养方法)编辑: D. S. Ingrams和J.P. Helgeson, 203-208 (其各自通过引用结合到本文中)。在植物中本发明的期需外源性基因的每一引入方法之后，进一步的DNA序列的存在和/或插入可为必需的。使用T-DNA用于转化植物细胞已经被深入研究和描述于EP-A-120516; Hoekema,载于: The Binary Plant Vector System Offset-drukkerij Kanters B. B., Amsterdam, 1985, V章; Fraley等人, Crit. Rev. Plant Sci., 4:1-46和Anetal., EMBO J (1985) 4:277-284 (其各自通过引用结合到本文中)中。
[0270] 用编码目的蛋白(例如EGY蛋白)的外源性基因转化的植物细胞可按照熟知的组织培养方法例如通过在供应有必需生长因子例如氨基酸、植物激素、维生素等的合适的培养基中培养细胞而生长和维持。
[0271] 关于本发明的术语“转基因植物”包括包含编码本发明的目的基因(例如编码EGY蛋白的基因)的外源性基因的任何植物。优选地将外源基因掺入植物的基因组中。
[0272] 术语“转基因植物”和“嵌合基因”不涵盖当在其天然启动子(也在其天然环境中)的控制下时在其天然环境中的天然核苷酸编码序列。
[0273] 在一个方面，本发明的核酸序列、嵌合基因、植物转化载体或植物细胞为分离的形式。术语“分离的”意指序列至少基本不含所述序列在自然中天然相关的和如在自然中存在的至少一种其它组分。
[0274] 在一个方面，本发明的核酸序列、嵌合基因、植物转化载体或植物细胞为纯化的形式。术语“纯化的”意指处于相对纯的状态，例如至少约90%纯，或至少约95%纯或至少约98%纯。
[0275] 如本文所使用的术语“核苷酸序列”指寡核苷酸序列或多核苷酸序列和其变体、同源物、片段和衍生物(例如其部分)。核苷酸序列可为基因组或合成或重组来源的，其可为双链的或单链的，无论代表有义或反义链。
[0276] 关于本发明的术语“核苷酸序列”包括基因组DNA、cDNA、合成DNA和RNA。优选地其意指DNA，更优选地编码本发明的cDNA序列。
[0277] 在优选的实施方案中，当关于本发明和当被本发明本身的范围包括时，核苷酸序列不包括当在其天然环境中时和当与同样在其天然环境中的其天然相关的序列连接时的本发明的天然核苷酸序列。为便于参考，我们应称该优选的实施方案为“非天然的核苷酸序列”。在这方面，术语“天然核苷酸序列”意指在其天然环境中的和当与其天然相关的完整启动子操作性连接时的完整核苷酸序列，所述启动子也在其天然环境中。然而，本发明的范围所包括的氨基酸序列可为在其天然有机体中表达核苷酸序列后分离的和/或纯化的。然而，优选地，本发明的范围所包括的氨基酸序列可由在其天然有机体中的核苷酸序列表达，但其中所述核苷酸序列不在其在该有机体中天然相关的启动子的控制下。
[0278] 通常，本发明的范围所包括的核苷酸序列使用重组DNA技术制备(即重组DNA)。然而，在本发明的备选的实施方案中，核苷酸序列可全部或部分使用本领域所熟知的化学方法合成(参见Caruthers MH等人, (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23和Horn T等人, (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232 - 通过引用结合到本文中)。
[0279] 编码具有如本文所定义的特定性质的蛋白或适合于修饰的蛋白的核苷酸序列可从产生所述蛋白的任何细胞或有机体鉴定和/或分离和/或纯化。本领域熟知用于鉴定和/或分离和/或纯化核苷酸序列的各种方法。例如，一旦已经鉴定和/或分离和/或纯化合适的序列，可使用PCR扩增技术制备更多的序列。
[0280] 作为进一步的例子，基因组DNA和/或cDNA文库可使用来自产生所述酶的有机体的染色体DNA或信使RNA构建。如果所述酶的氨基酸序列已知，可将标记的寡核苷酸探针合成和用于从制备自有机体的基因组文库鉴定编码酶的克隆。备选地，包含与另一个已知的酶基因同源的序列的标记的寡核苷酸探针可用于鉴定编码酶的克隆。在后一情况下，使用较低严格度的杂交和洗涤条件。
[0281] 在又进一步的备选方案中，编码所述酶的核苷酸序列可通过建立的标准方法例如Beucage S.L.等人, (1981) Tetrahedron Letters22, 第1859-1869页所描述的亚磷酰胺方法或Matthes等人, (1984) EMBO J. 3, p 801-805所描述的方法(通过引用结合到本文中)合成制备。在亚磷酰胺方法中，将寡核苷酸例如在自动化DNA合成仪中合成、纯化、退火、连接和克隆入合适的载体中。
[0282] 核苷酸序列可为混合的基因组和合成来源，混合的合成和cDNA来源或混合的基因组和cDNA来源的，通过按照标准技术连接合成的、基因组或cDNA来源(视情况而定)的片段而制备。每一连接的片段对应于完整核苷酸序列的不同部分。DNA序列也可通过聚合酶链反应(PCR)使用特定引物制备，例如如US 4,683,202或Saiki R K等人, (Science (1988) 239, 第487-491页) (通过引用结合到本文中)中所描述的。
[0283] 本发明的范围还包括具有如本文所定义的特定性质的酶的氨基酸序列。
[0284] 如本文所使用的，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。
[0285] 氨基酸序列可从合适的来源制备和/或分离，或其可合成制造或其可通过使用重组DNA技术制备。
[0286] 优选地当关于本发明时和当被本发明的本身范围包括时氨基酸序列不是天然的酶。在这方面，术语“天然的酶”意指在其天然环境中和当由其天然核苷酸序列表达时的完整的酶。
[0287] 本发明还包括使用与具有本文所定义的特定性质的多肽的氨基酸序列或编码这样的多肽的任何核苷酸序列具有一定程度的序列同一性或序列同源性的序列(后文称为“同源序列”)。此处，术语“同源物”意指与主题氨基酸序列和主题核苷酸序列具有一定同源性的实体。此处术语“同源性”可等于“同一性”。
[0288] 同源氨基酸序列和/或核苷酸序列和/或片段应提供和/或编码保留酶的功能活性和/或增强酶的活性的多肽。
[0289] 通常，同源序列将会包含例如与主题氨基酸序列相同的活性位点等或将会编码相同的活性位点。尽管也可在相似性(即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)方面考虑同源性，但在本发明的背景下优选在序列同一性方面表述同源性。
[0290] 在一个实施方案中，同源序列被理解为包括与主题序列相比具有一个或几个添加、缺失和/或取代的氨基酸序列或核苷酸序列。
[0291] 在一个实施方案中本发明涉及其氨基酸序列在本文中表示的蛋白或通过在亲本蛋白的氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或几个氨基酸例如2、3、4、5、6、7、8、9个氨基酸或更多个氨基酸(例如10个或超过10个氨基酸)从该(亲本)蛋白衍生和具有亲本蛋白的活性的蛋白。
[0292] 在一个实施方案中本发明涉及编码其氨基酸序列在本文中表示的蛋白或编码通过在亲本蛋白的氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或几个氨基酸例如2、3、4、5、6、7、8、9个氨基酸或更多个氨基酸(例如10个或超过10个氨基酸)从该(亲本)蛋白衍生和具有亲本蛋白的活性的蛋白的核酸序列(或基因)。
[0293] 同源性或同一性比较可通过眼睛，或更通常地，在容易获得的序列比较程序的帮助下进行。这些市售可得的计算机程序可计算两个或更多个序列之间的%同源性。
[0294] %同源性或%同一性可在连续的序列上计算，即一个序列与其它序列比对和一个序列中的每一氨基酸与其它序列中的相应氨基酸直接比较，一次一个残基。这称为“无缺口”比对。通常，这种无缺口比对仅在相对短的残疾数目上进行。
[0295] 尽管这是非常简单和一致的方法，其不能考虑，例如，在否则相同对的序列中，一个插入或缺失将会导致后面的氨基酸残基失去比对，因此潜在地导致当进行全局比对时%同源性大量减小。因此，多数序列比较方法经设计为产生最佳比对，其考虑可能的插入和缺失而不过度处罚总体的同源性分数。这通过在序列比对中插入“缺口”以尝试最大化局部同源性达到。
[0296] 然而，这些更复杂的方法为在比对中发生的每一缺口赋予“缺口处罚”，以致于对于相同数目的相同氨基酸，具有尽可能少的缺口的序列比对—反映两个比较的序列之间更高的亲缘关系—将会得到比具有许多缺口的比对更高的分数。通常使用“姻亲缺口成本”，其对于缺口的存在索取相对高成本和对于缺口中的各个随后的残基处以较小的处罚。此为最通常使用的缺口打分系统。高缺口处罚会当然产生具有更少缺口的最佳化的比对。多数比对程序允许修改缺口罚分。然而，当使用这样的软件用于序列比较时优选使用缺省值。
[0297] 因此计算最大%同源性首先需要产生最佳的比对，考虑缺口处罚。用于进行这样的比对的合适的计算机程序为Vector NTI (Invitrogen Corp.)。可进行序列比较的软件的实例包括，但不限于，例如BLAST包(参见Ausubel等人1999 Short Protocols in Molecular Biology, 第4版 – 第18章)、BLAST 2 (参见FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8和tatiana@ncbi.nlm.nih.gov)、FASTA (Altschul等人1990 J. Mol. Biol. 403-410)和AlignX。至少BLAST、BLAST 2和FASTA对于离线和在线搜索可用(参见Ausubel等人1999, 第7-58 - 7-60页)。
[0298] 尽管最终的%同源性可在同一性方面测量，比对过程本身通常不基于全有或全无配对比较。，一般使用成比例的相似性分数矩阵，其基于化学相似性或进化距离为每一成对比较赋予分数。通常使用的这样的矩阵的实例为BLOSUM62矩阵 – BLAST程序组的缺省矩阵。Vector NTI程序一般使用公共缺省值或如果提供，自定义的符号比较表(对于进一步的细节参见用户手册)。对于一些应用，优选使用Vector NTI包的缺省值。
[0299] 备选地，百分比同源性可使用Vector NTI (Invitrogen Corp.)中的多个比对特征，基于与CLUSTAL (Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73(1), 237-244，通过引用结合到本文中)类似的算法计算。
[0300] 一旦软件产生最佳比对，就有可能计算%同源性，优选地%序列同一性。软件通常作为序列比较的一部分进行此，产生数值结果。
[0301] 若当测定序列同一性时应使用缺口处罚，则优选地将下列参数用于成对比对：对于BLAST
缺口开口 0
缺口延伸 0
对于CLUSTAL DNA 蛋白
字长 2 1 K三联体
缺口处罚 15 10
缺口延伸 6.66 0.1
在一个实施方案中可以以如上定义的缺口处罚和缺口延伸设置使用，CLUSTAL。
缺口开口 0
缺口延伸 0
对于CLUSTAL DNA 蛋白
字长 2 1 K三联体
缺口处罚 15 10
缺口延伸 6.66 0.1
在一个实施方案中可以以如上定义的缺口处罚和缺口延伸设置使用，CLUSTAL。
[0302] 在一些实施方案中用于BLAST或CLUSTAL比对的缺口处罚可与以上详述的那些不同。技术人员会理解用于进行BLAST和CLUSTAL比对的标准参数可周期性改变，和会能够在那时基于对于BLAST或CLUSTAL比对算法所详述的标准参数选择适当的参数。
[0303] 合适地，关于核苷酸序列的同一性程度在至少20个连续的核苷酸上、优选地在至少30个连续的核苷酸上、优选地在至少40个连续的核苷酸上、优选地在至少50个连续的核苷酸上、优选地在至少60个连续的核苷酸上、优选地在至少100个连续的核苷酸上测定。
[0304] 合适地，关于核苷酸序列的同一性程度可在整个序列上测定。
[0305] 序列也可具有产生沉默变化和导致功能上相等的物质的氨基酸残基缺失、插入或取代。故意的氨基酸取代可基于残基在极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质上的相似性进行，只要保留物质的二级结合活性。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸，带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸，具有不带电的具有相似的亲水性值的极性头部基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
[0306] 保守取代可例如按照下表进行。第二列中同一块中和优选地第三列中同一行中的氨基酸可彼此取代：本发明还包括可能发生的同源取代(取代和置换二者在本文中均用于指现存氨基酸残基与备选的残基的互换)，即对等的取代，例如碱性对于碱性，酸性对于酸性，极性对于极性等。非同源取代也可发生，即从一个类别的残基到另一个类别的或备选地涉及包含非天然氨基酸例如鸟氨酸(后文称为Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(后文称为B)、正亮氨酸鸟氨酸(后文称为O)、吡啶基丙氨酸(pyriylalanine)、噻吩基丙氨酸、萘基丙氨酸和苯基甘氨酸。
[0307] 置换也可通过非天然氨基酸进行，包括：α*和α-二取代的*氨基酸、N-烷基氨基酸*、乳酸*、天然氨基酸的卤化物衍生物例如三氟酪氨酸*、对-Cl-苯丙氨酸*、对-Br-苯丙氨酸*、对-I-苯丙氨酸*、L-烯丙基-甘氨酸*、ß-丙氨酸*、L-α-氨基丁酸*、L-γ-氨基丁酸*、L-α-氨基异丁酸*、L-ε-氨基己酸#、7-氨基庚酸*、L-甲硫氨酸砜#*、L-正亮氨酸*、L-正缬氨酸*、对-硝基-L-苯丙氨酸*、L-羟脯氨酸#、L-硫代脯氨酸*、苯丙氨酸(Phe)的甲基衍生物例如4-甲基-Phe*、五甲基-Phe*、L-Phe (4-氨基)#、L-Tyr (甲基)*、L-Phe (4-异丙基)*、L-#Tic (1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸)*、L-二氨基丙酸 和L-Phe (4-苯甲基)*。为了上述讨论(关于同源或非同源取代)的目的，已将符号*用于指示衍生物的疏水性质，而#用于指示衍生物的亲水性质，#*指示两亲性质。
[0308] 变体氨基酸序列可包含合适的间隔基，其可插入所述序列的任何两个氨基酸残基之间，除氨基酸间隔基例如甘氨酸或β-丙氨酸残基之外还包括烷基例如甲基、乙基或丙基。进一步的变体形式涉及存在类肽形式的一个或多个氨基酸残基，将会被本领域技术人员很好地理解。为了避免怀疑，“类肽形式”用于指其中α-碳取代基在残基的氮原子而非α-碳上的变体氨基酸残基。用于制备类肽形式的肽的方法为本领域所已知，例如Simon RJ等人, PNAS (1992) 89(20), 9367-9371和Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4),
132-134 - 通过引用结合到本文中。
132-134 - 通过引用结合到本文中。
[0309] 用于本发明的核苷酸序列可在其中包含合成的或修饰的核苷酸。许多不同类型的对寡核苷酸的修饰为本领域所已知。这些包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯骨架和/或在分子的3’和/或5’末端添加吖啶或聚赖氨酸链。为了本发明的目的，应理解本文所描述的核苷酸序列可通过本领域可得的任何方法修饰。可进行这样的修饰以便增强本发明的核苷酸序列的体内活性或寿命。
[0310] 本发明还包括与本发明的核酸序列互补的序列或能够与本发明的序列或与其互补的序列杂交的序列。
[0311] 如本文所使用的术语“杂交”应包括“核酸链与互补链通过碱基配对结合的过程”以及如在聚合酶链反应(PCR)技术中进行的扩增过程。
[0312] 本发明还涉及可与本发明的核苷酸序列(包括本文所呈现的那些的互补序列)杂交的核苷酸序列。
[0313] 优选地，杂交在严格条件(例如50℃和0.2xSSC {1xSSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M柠檬酸钠 pH 7.0})下测定。
[0314] 更优选地，杂交在高度严格条件(例如65℃和0.1xSSC {1xSSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M柠檬酸钠pH 7.0})下测定。
[0315] 在一个方面用于本发明的序列为合成的序列 – 即已经通过体外化学或酶合成制备的序列。其包括，但不限于，以宿主有机体的最佳密码子使用制造的序列。
[0316] 术语“表达载体”意指能够体内或体外表达的构建体。
[0317] 优选地，将表达载体掺入合适的宿主有机体的基因组中。术语“掺入”优选地涵盖稳定掺入基因组中。
[0318] 本发明的核苷酸序列可存在于载体中，在载体中核苷酸序列与能够提供由合适的宿主有机体表达核苷酸序列的调节序列操作性连接。
[0319] 用于本发明的载体可如本文所描述地转化入合适的宿主细胞以提供本发明的多肽的表达。
[0320] 载体例如质粒、粘粒或噬菌体载体的选择将会常常取决于其要引入的宿主细胞。
[0321] 载体可在体外用于例如产生RNA或用于转染、转化、转导或感染宿主细胞。
[0322] 因此，在进一步的实施方案中，本发明提供通过将本发明的核苷酸序列引入可复制的载体中、将载体引入相容的宿主细胞中和在带来载体复制的条件下生长宿主细胞制造本发明的核苷酸序列的方法。
[0323] 载体可进一步包含使得载体能够在讨论中的宿主细胞中复制的核苷酸序列。这样的序列的实例为质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的复制起点。
[0324] 在一些应用中，用于本发明的核苷酸序列与能够提供核苷酸序列例如由选择的宿主细胞表达的调节序列操作性连接。例如，本发明涵盖包含本发明的核苷酸序列的载体，所述核苷酸序列与这样的调节序列操作性连接，即载体为表达载体。
[0325] 术语“操作性连接”指其中所描述的组分处于允许它们以其预期的方式起作用的关系中的并置。与编码序列“操作性连接”的调节序列以这样的方式连接以致于编码序列的表达在与控制序列相容的条件下达到。
[0326] 术语“调节序列”包括启动子和增强子和其它表达调节信号。
[0327] 术语“启动子”以本领域的正常含义使用，例如RNA聚合酶结合位点。
[0328] 编码本发明的酶的核苷酸序列的增强的表达也可通过选择异源调节区域例如启动子、分泌前导序列和终止子区域达到。
[0329] 优选地，本发明的核苷酸序列与至少启动子操作性连接。
[0330] 术语“构建体” – 与术语例如“缀合物”、“盒”和“杂合体”同义 – 包含直接或间接与启动子连接的用于按照本发明使用的核苷酸序列。
[0331] 间接连接的实例为在启动子和本发明的核苷酸序列中间提供合适的间隔基例如内含子序列，例如Sh1-内含子或ADH内含子。对于关于本发明的术语“融合的”也是如此，其包括直接或间接连接。在一些情况中，术语不涵盖与野生型启动子通常相关和当它们均在其天然环境中时的编码蛋白的核苷酸序列的自然组合。
[0332] 构建体可甚至包含或表达标志，其允许选择遗传构建体。
[0333] 用于转化植物的通用技术的综述可在Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225)和Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech 1994年3月/4月 17-27)的文章(各自通过引用结合到本文中)中找到。关于植物转化的进一步的教导可见于EP-A-0449375中。
[0334] 氨基酸在本文中使用氨基酸的名称、三字母缩写或单字母缩写提及。
[0335] 术语“蛋白”和“多肽”在本文中可互换使用。在本公开内容和权利要求中，可使用氨基酸残基的常规单字母和三字母代码。氨基酸的三字母代码如与IUPACIUB生物化学命名联合委员会(Joint Commission on Biochemical Nomenclature，JCBN)相符合定义。还应理解由于遗传密码的简并性，多肽可由多于一个核苷酸序列编码。
[0336] 其它术语定义可在说明书全文中出现。更详细地描述示例性的实施方案之前，应理解本公开内容不限于所描述的具体实施方案，因为这些当然可改变。还应理解本文所使用的术语仅为了描述具体实施方案的目的，不意在限制，因为本公开内容的范围将会仅受所附权利要求限制。
[0337] 用于转化植物的通用技术的综述可在Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225)和Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech 1994年3月/4月 17-27)的文章中找到。关于植物转化的进一步的教导可见于EP-A-0449375中。
[0338] 除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有本公开内容所属领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。Singleton,等人, DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY (微生物和分子生物学词典), 第20版., John Wiley和Sons, New York (1994), 和Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY (哈珀柯林斯生物学词典), Harper Perennial, NY (1991)为技术人员提供本公开内容中使用的许多术语的通用词典。
[0339] 本公开内容不受本文所公开的示例性的方法和材料限制，与本文所描述那些相似或相等的任何方法和材料均可用于实践或检验本公开内容的实施方案。数值范围包含定义范围的数字。除非另有说明，任何核酸序列均以5’-3’定向从左向右书写；氨基酸序列分别以氨基到羧基定向从左向右书写。
[0340] 当提供值的范围时，应理解也明确公开该范围的上限和下限之间的每一中间值至下限单位的十分之一，除非上下文另有清楚指示。任何所阐述值或所阐述范围中的中间值和任何其它所阐述值或所阐述范围中的中间值之间的每一较小的范围均被包含在本公开内容中。这些较小范围的上限和下限可独立地被包含在范围中或排除在范围外，并且其中任一界限、两个界限均不或两个界限被包含在较小范围中的每一范围也被包含在本公开内容内，在所阐述的范围中经受任何具体排除的界限。当所阐述的范围包含一个或两个界限时，排除任一或两个那些包含的界限的范围也被包含在本公开内容中。
[0341] 必须指出，如本文中和在所附权利要求中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物，除非上下文另有清楚指示。因此，例如，对“一种酶”的提及包括多种这样的候选剂和本领域技术人员已知的其相等物，等。
[0342] 如本文所使用的术语“包括”("comprising", "comprises"和"comprised of')与“包含”("including", "includes")或“含有”("containing", "contains")同义，为包括在内的或开放的，并且不排除额外的、非叙述的成员、元素或方法步骤。术语“包括”("comprising", "comprises"和"comprised of')也包括术语“由……组成”。
[0343] 仅因为其在本申请的提交日期之前的公开内容而提供本文所讨论的出版物。本文中任何内容均不应解释为承认这些出版物构成本文所附权利要求的现有技术。
[0344] 优点与本发明相关的关键优点为在经修饰以增加EGY蛋白表达或活性的植物中NUE和NUTL的改善。这样的优点可允许增加的可收获的产物中的生物量或修饰的植物在氮缺乏条件下改善的生长。
[0345] 与本发明相关的进一步的特别优点为减少从经修饰以增加EGY蛋白的活性或表达的烟草植物制备的烟草产品中的烟草特异性亚硝胺浓度(例如NNK和/或NNN)。
[0346] 现在将参考以下图和实施例仅以举例方式描述本发明。实施例
[0347] 实施例1 –鉴定黄色白肋 1 (Yb1)和黄色白肋2 (Yb2)基因座与其它市场类别的烟草栽培种相比，白肋烟草具有高度叶绿素缺陷，其在白肋烟草植物的茎、柄和叶中脉上最明显和随着植物年龄变得更显著。另外，白肋烟草具有增加的生物碱水平、减少的氮使用效率、减少的氮利用效率、增加的叶硝态氮和增加的烟草特异性亚硝胺(TSNA) – 特别是与烤制的烟草相比。白肋烟草的叶绿素缺陷表型由黄色白肋1 (Yb1)和黄色白肋2 (Yb2)基因座处的双纯合子隐性基因型(yb1yb1 yb2yb2)赋予，已经报道所述基因座分别位于染色体B和染色体O。建立正常的更绿色的表型仅需要两个基因座的任一处的单个显性等位基因。
[0348] Yb1和Yb2的精细作图使用30K Infinium SNP芯片将Yb1和Yb2基因座的等位基因同基因的三对系基因分型。
发现两个基因组区域对于所有三对几乎同基因的系显示多态性。通过用微卫星标志在Bindler等人(2011; Theor Appl Genet; 123: 219-230 – 通过引用结合到本文中)的高密度微卫星标志连锁图上共隔离分析，发现这些SNP标志位于普通烟草连锁群(LG) 5和24，其分别由祖先物种毛叶烟草(N. sylvestris)和绒毛状烟草(N. tomentosiformis)贡献。
将经估计跨越LG 5上1.33 cM的区域的两个SNP标志，和经估计覆盖LG 24上17.16 cM的区域的6个SNP标志转换为KASP标志(图2)用于使用BWDH8/NC1426-17//NC1426-17和BWDH16/NC1426-17//NC1426-17 BC1F1群体(预期其在一个Yb基因座隔离野生型等位基因和在备选的Yb基因座固定为隐性等位基因)对Yb1和Yb2基因座精细作图。将用8个KASP标志对两个作图群体的亲本系(BWDH8、BWDH16和NC1426-7)的基因分型用于推断BWDH8衍生的群体隔离LG
5上的标志，BWDH16衍生的群体隔离LG 24上的标志。
发现两个基因组区域对于所有三对几乎同基因的系显示多态性。通过用微卫星标志在Bindler等人(2011; Theor Appl Genet; 123: 219-230 – 通过引用结合到本文中)的高密度微卫星标志连锁图上共隔离分析，发现这些SNP标志位于普通烟草连锁群(LG) 5和24，其分别由祖先物种毛叶烟草(N. sylvestris)和绒毛状烟草(N. tomentosiformis)贡献。
将经估计跨越LG 5上1.33 cM的区域的两个SNP标志，和经估计覆盖LG 24上17.16 cM的区域的6个SNP标志转换为KASP标志(图2)用于使用BWDH8/NC1426-17//NC1426-17和BWDH16/NC1426-17//NC1426-17 BC1F1群体(预期其在一个Yb基因座隔离野生型等位基因和在备选的Yb基因座固定为隐性等位基因)对Yb1和Yb2基因座精细作图。将用8个KASP标志对两个作图群体的亲本系(BWDH8、BWDH16和NC1426-7)的基因分型用于推断BWDH8衍生的群体隔离LG
5上的标志，BWDH16衍生的群体隔离LG 24上的标志。
[0349] 用两个选择的LG 5 KASP标志筛查BWDH8/NC1426-17//NC1426-17 BC1F1群体中的384 BC1F1个体将一个Yb基因座的位置细化为离SNP标志Yb5-1 0.26 cM (图2)。用6个选择的LG 24 KASP标志筛查BWDH16/NC1426-17//NC1426-17 BC1F1群体中的384 BC1F1个体将另一个Yb标志的位置细化为SNP标志Yb24-4和Yb24-5之间的4.37间隔和远离标志Yb24-4
1.07 cM (图2)。为了鉴定具有潜在候选基因的支架，将与任一Yb基因座最密切相关的SNP标志序列与来自绘图普通烟草基因组序列的支架比对。对于LG 5鉴定具有总计79个预测基因的三个支架(3,876,640 bp)和对于LG 24鉴定具有总计223个预测基因的三个支架(8,
458,802 bp)。
1.07 cM (图2)。为了鉴定具有潜在候选基因的支架，将与任一Yb基因座最密切相关的SNP标志序列与来自绘图普通烟草基因组序列的支架比对。对于LG 5鉴定具有总计79个预测基因的三个支架(3,876,640 bp)和对于LG 24鉴定具有总计223个预测基因的三个支架(8,
458,802 bp)。
[0350] 进行对拟南芥属基因组装配(拟南芥属信息资源, TAIR) (www. arabidopsis.org)的序列相似性搜索以确定预测基因的潜在功能。经预测与氮同化作用、氮使用生理学或叶绿体活性相关的基因被认为黄色白肋表型之下的潜在候选基因。对于LG
5上的目的基因组区域鉴定两个这样的候选，对于LG 24上的目的区域鉴定4个这样的候选。
对应于6个目的基因的全长拟南芥属cDNA序列从TAIR和BLAST针对基因组序列数据查找K326 (Yb1Yb1Yb2Yb2)和TN90 (yb1yb1yb2yb2) (分别为GCA_00715075.1和GCA_00715135.1；
www.ncbi.nlm.nih.gov)获得。对于拟南芥属基因CJD1、FtsZ2-1、ChlAKR或RCA的普通烟草同源物，在K326和TN90绘图序列之间未发现差异。在CRTISO同源物中，对于TN90在第7个和第8个外显子之间鉴定到80 bp缺失，但这不引起氨基酸序列的预测改变。然而，在EGY1同源物中，相对于K326在TN90中鉴定到8 bp和111 bp缺失，前者经预测导致选择性剪接和预测的额外的外显子。
5上的目的基因组区域鉴定两个这样的候选，对于LG 24上的目的区域鉴定4个这样的候选。
对应于6个目的基因的全长拟南芥属cDNA序列从TAIR和BLAST针对基因组序列数据查找K326 (Yb1Yb1Yb2Yb2)和TN90 (yb1yb1yb2yb2) (分别为GCA_00715075.1和GCA_00715135.1；
www.ncbi.nlm.nih.gov)获得。对于拟南芥属基因CJD1、FtsZ2-1、ChlAKR或RCA的普通烟草同源物，在K326和TN90绘图序列之间未发现差异。在CRTISO同源物中，对于TN90在第7个和第8个外显子之间鉴定到80 bp缺失，但这不引起氨基酸序列的预测改变。然而，在EGY1同源物中，相对于K326在TN90中鉴定到8 bp和111 bp缺失，前者经预测导致选择性剪接和预测的额外的外显子。
[0351] 由于TN90和K326之间预测的引人注目的氨基酸序列差异，对EGY1 (乙烯依赖的向地性缺陷的黄绿蛋白1)同源物(后文称为NtEGY1)进行进一步调查。考虑普通烟草的同源四倍体性质，其中S和T基因组分别由毛叶烟草和绒毛状烟草贡献，将NtEGY1序列针对普通烟草基因组序列进行BLAST搜索以鉴定潜在的高度相似序列。具有89%核苷酸同一性的预测基因被鉴定为潜在同源物，并暂时命名为NtEGY2。来自K326和TN 90LC的NtEGY2序列的BLAST比较显示相对于K326在TN 90LC中的175 bp缺失接着许多其它5-10 bp的缺失和单个T核苷酸插入。
[0352] 将设计为仅扩增NtEGY1的区段和检测TN 90LC中的8 bp缺失的PCR引物EGY1-F和EGY1-R在K326、TN 90LC和两个作图群体的亲本(BWDH8、BWDH16、NC 1426-17)上检验。发现8 bp缺失存在于TN 90LC以及BWDH8中，但不在BWDH16中。针对该缺失对来自BWDH8/NC1426-17//NC1426-17 BC1F1群体(其1:1隔离正常:叶绿素缺陷表型)的1056 BC1F1植物的基因分型显示叶绿素缺陷和8 bp缺失之间完全的共隔离，因此高度提示NtEGY1为两个Yb基因座之一处的基因。
[0353] 为了确定野生型和突变体NtYb2 (NtEGY1)等位基因之间预测的氨基酸序列差异，从K326和TN 90LC将相应的cDNA链分离和测序。由于NtEGY1和NtEGY2之间高度的序列相似性，假定二者的cDNA同时扩增。PCR产物使用凝胶电泳分离，将片段克隆和测序。基于前者中9 bp插入的存在情况(其也基于GenBank中的基因组序列预测)区分对应于NtEGY1的cDNA与对应于NtEGY2的cDNA是可能的。
[0354] NtYb2 cDNA序列的分析显示在TN90中在碱基618处T→C取代、在碱基621处A → T取代和碱基623-630 (外显子2)的8 bp缺失，其引起移码和产生提前终止密码子，导致丢失C端330个氨基酸区域的截短的蛋白(图2)。
[0355] 在比较来自TN 90LC和K326的NtEGY2 cDNA序列中，所发现的唯一的差异为在TN 90LC的cDNA的碱基1448处(外显子9)插入T核苷酸。该插入引起移码和产生提前终止密码子，导致丢失C端42 aa区域的截短的蛋白。野生型NtEGY1和NtEGY2 cDNA经预测产生具有
97%氨基酸相似性的翻译蛋白(图2)。
97%氨基酸相似性的翻译蛋白(图2)。
[0356] 由于导致预测的截短NtEGY2蛋白的1 bp插入的鉴定，假设NtEGY2可能对应于NtYb1。将KASP引物EGY2_kasp设计为检测T插入。由于NtEGY 1和NtEGY2之间在1 bp插入邻近处极其高度的序列相似性，难以设计NtEGY2同源物特异性的引物。因此用引物EGY2-nF和EGY2-nR进行巢氏PCR，然后基因分型KASP标志。检验K326、TN 90LC和两个作图群体的亲本(BWDH8, BWDH16, NC 1426-17)上的所述标志后，确定TN 90LC和BWDH16携带突变。因此对来自BWDH16/NC1426-17//NC1426-17 BC1F1群体的总计1040个个体用所述标志基因分型，在1 bp插入存在和黄色白肋表型之间观察到完全的共隔离。这提供极其强的证据——NtEGY2也编码一个Yb基因座处的基因。
[0357] 实施例2 –黄色白肋基因座潜在的基因的证实为了提供进一步的确认NtEGY1和NtEGY2编码控制黄色白肋表型的基因，进行靶向突变和互补途径。对于靶向诱变，Yb1yb1 yb2yb2或yb1yb1 Yb2yb2基因型首先通过用TN 90LC杂交BWDH8和BWDH16建立。使用这些基因型以致于如果靶向突变的基因确实是位于Yb基因座中的基因，则仅单个Yb基因拷贝会不得不被中断以观察预测的表型。CRISPR-cas介导的诱变导致再生总计30株植物，其中正常的绿色表型经由诱导的突变转换为叶绿素缺陷表型。为了验证这些修饰的植物中Yb基因座的靶向突变，针对序列破坏验证靶向区域。对于NtYb1靶位点，再生的也显示叶绿素缺陷表型的所有15株植物还包含导致移码的小插入缺失或插入。对于NtYb2靶位点，再生的也显示叶绿素缺陷表型的所有15株植物还包含导致移码的小插入缺失或插入。
[0358] 对于互补实验，全长NtYb1和全长NtYb2野生型cDNA各自在花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S启动子控制下在白肋栽培种TN 90LC和‘黄色白肋’几乎同基因版本的烤制的烟草栽培种SC58 (SC58 yb1yb1yb2yb2)中表达。30个独立的初级35S:NtYb1转化子中的20个和30个独立的初级35S:NtYb2转化子中的20个显示黄色白肋表型互补。
[0359] 实施例3 – EGY1和EGY2有助于烟草中TSNA产生的水平a) 测定NtYb1对氮使用效率和氮利用效率的作用
将显示叶绿素缺陷表型的转基因互补的三个TN 90LC 35S:NtYb1 R0转化子自花授粉以产生三个R1家族，这些家族针对存在掺入的转基因和叶绿素缺陷表型进行隔离(表1)。在Oxford, NC, USA附近进行的重复田间实验中针对产量、N-USE、N-UTL和NO3-N将来自每一R1家族的白茎和绿茎分离子彼此比较和与非转基因对照植物比较。使用具有20个重复的随机化完全区组设计。
将显示叶绿素缺陷表型的转基因互补的三个TN 90LC 35S:NtYb1 R0转化子自花授粉以产生三个R1家族，这些家族针对存在掺入的转基因和叶绿素缺陷表型进行隔离(表1)。在Oxford, NC, USA附近进行的重复田间实验中针对产量、N-USE、N-UTL和NO3-N将来自每一R1家族的白茎和绿茎分离子彼此比较和与非转基因对照植物比较。使用具有20个重复的随机化完全区组设计。
[0360] 结果表明相对于非转基因TN 90LC对照，TN 90LC中NtYb1过表达增加植物产量、增加N-USE、增加N-UTL和降低NO3-N (图5)。
[0361] b) 测定NtYb1对烟草中TSNA积累的作用将10个绿茎TN 90LC 35S:NtYb1温室中生长的R0转化子与14株温室生长的TN 90LC的非转基因对照植物比较。发现与非转基因对照组相比，转基因35S:NtYb1基因型组积累更低水平的N-亚硝基去甲烟碱(NNN)和总TSNA (图6)。
[0362] 材料和方法Yb1和Yb2作图
将隐性yb1和yb2等位基因使用8个回交循环接着多代自花授粉从白肋烟草栽培种Ky
16转移至烤制的烟草(Yb1Yb1Yb2Yb2)栽培种SC58、NC95和Coker 139，以建立赋予叶绿素缺陷表型的yb1和yb2等位基因纯合性。将DNA使用改良的溴化十六烷基三甲铵程序(Afandor等人, 1993, Annu Rep Bean Improv Coop 36: 10–11)从6个基因型分离，和使用30 K Infinium iSelect HD BeadChip SNP芯片基因分型。鉴定包含区别邻近同基因系的多态性的基因组区域，对应的目的SNP标志转变为Kompetitive等位基因特异性PCR (Kompetitive Alle Specific PCR, KASP)标志(Semagn等人, 2014, Mol Breeding 33: 1-14)。
将隐性yb1和yb2等位基因使用8个回交循环接着多代自花授粉从白肋烟草栽培种Ky
16转移至烤制的烟草(Yb1Yb1Yb2Yb2)栽培种SC58、NC95和Coker 139，以建立赋予叶绿素缺陷表型的yb1和yb2等位基因纯合性。将DNA使用改良的溴化十六烷基三甲铵程序(Afandor等人, 1993, Annu Rep Bean Improv Coop 36: 10–11)从6个基因型分离，和使用30 K Infinium iSelect HD BeadChip SNP芯片基因分型。鉴定包含区别邻近同基因系的多态性的基因组区域，对应的目的SNP标志转变为Kompetitive等位基因特异性PCR (Kompetitive Alle Specific PCR, KASP)标志(Semagn等人, 2014, Mol Breeding 33: 1-14)。
[0363] 为了开发用于精细作图yb1和yb2二者的作图群体，将针对黄色白肋表型隔离的一组双单倍体(DH)系通过杂交白肋烟草栽培种Ky 14与烤制的烟草栽培种K 346、经由用非洲烟草(N. africana)授粉F1杂种分离单倍体植物和加倍所得到的单倍体植物的染色体数目产生。随后发现加倍的单倍体系BWDH6和BWDH8仅在一个基因座处对于显性Yb等位基因纯合，而发现系BWDH16在相对的Yb基因座处对于显性等位基因纯合。
[0364] 为了最终开发适合于精细作图Yb1和Yb2的子代，BWDH8和BWDH16 (Yb1Yb1yb2yb2或yb1yb1Yb2Yb2基因型)二者与白肋烟草育种品系NC1426-17 (yb1yb1yb2yb2)杂交。相应的F1杂种然后与NC1426-17回交以开发预期对于黄色白肋表型1:1隔离的子代。将来自各家族的大约1000个BC1F1子代在田间生长、针对叶绿素缺陷表型评分和用对应于发现与Yb1或Yb2紧密连锁的SNP的KASP标志基因分型。
[0365] 将发现与Yb1或Yb2紧密连锁的SNP标志与普通烟草绘图序列比对以鉴定可能包含Yb1或Yb2候选基因的支架。将预测涉及氮同化作用、氮使用生理学或叶绿素维持的基因考虑为黄色白肋表型下的潜在的候选基因。调查烤制的栽培种K326 (Yb1Yb1Yb2Yb2)和白肋烟草栽培种(yb1yb1yb2yb2)的GenBank序列在这些候选基因中的多态性。将引物设计为允许基因分型目的多态性和用于基因分型来自BWDH8/NC1426-17//NC1426-17和BWDH16/NC1426-17//NC1426-17 BC1F1群体的大约1200株植物，以测定目的多态性与控制黄色白肋表型的基因之间的连锁程度。
[0366] 分离和克隆yb1和yb2 cDNA使用RNeasy植物微试剂盒(Plant Mini Kit) (Qiagen)从K326 (Yb1Yb1Yb2Yb2)和TN
90 (yb1yb1yb2yb2)植物的6周龄植物的叶组织提取RNA。使用具有寡聚(dT)的用于RT-PCR的SuperScript第一链合成系统(First-Strand Synthesis System) (Invitrogen)合成cDNA。通过PCR从来自K 326和TN 90的第一链cDNA使用基于使用普通烟草绘图基因组序列信息预测的Yb1和Yb2序列设计的引物cYb-F和cYb-R扩增Yb候选基因的编码区域。由于Yb1和Yb2候选之间在5’或3’末端存在少数核苷酸差异，不可能设计特异于任一同源物的引物。因此将条带从琼脂糖凝胶切离和用Monarch DNA凝胶提取试剂盒(Gel Extraction Kit) (New England Biolabs)纯化。将片段使用零平端PCR克隆试剂盒(Zero Blunt PCR Cloning Kit) (Invitrogen)克隆入pCR-Blunt载体和转化入NEB 5-α感受态大肠杆菌细胞(New England Biolabs)。衍生自每一栽培种的个体克隆的测序使用载体引物进行，随后的分析显示Yb1和Yb2候选片段二者均被扩增。
90 (yb1yb1yb2yb2)植物的6周龄植物的叶组织提取RNA。使用具有寡聚(dT)的用于RT-PCR的SuperScript第一链合成系统(First-Strand Synthesis System) (Invitrogen)合成cDNA。通过PCR从来自K 326和TN 90的第一链cDNA使用基于使用普通烟草绘图基因组序列信息预测的Yb1和Yb2序列设计的引物cYb-F和cYb-R扩增Yb候选基因的编码区域。由于Yb1和Yb2候选之间在5’或3’末端存在少数核苷酸差异，不可能设计特异于任一同源物的引物。因此将条带从琼脂糖凝胶切离和用Monarch DNA凝胶提取试剂盒(Gel Extraction Kit) (New England Biolabs)纯化。将片段使用零平端PCR克隆试剂盒(Zero Blunt PCR Cloning Kit) (Invitrogen)克隆入pCR-Blunt载体和转化入NEB 5-α感受态大肠杆菌细胞(New England Biolabs)。衍生自每一栽培种的个体克隆的测序使用载体引物进行，随后的分析显示Yb1和Yb2候选片段二者均被扩增。
[0367] 分离Yb1和Yb2基因组DNA将基因组DNA使用改良的溴化十六烷基三甲铵程序从K326和TN90的植物分离。将每一候选基因的基因组DNA使用PCR用Q5高保真度(High-Fidelity) DNA聚合酶(New England Biolabs)在6个各自大约1250 bp的片段中扩增。为了确保期需基因的特异性扩增，引物设计为使得3’末端上最后的碱基对为Yb1和Yb2之间的SNP。将片段切离、纯化和克隆入pCR-Blunt。使用载体引物和对于更长的序列而言内部的基因序列引物进行测序。
[0368] 序列分析和生物信息学资源将DNA序列使用Vector NTI-AlignX (Thermo Fisher Scienfific, Walthmam, MA)比对。将个体基因组DNA片段使用Vector NTI-ContigExpress串联入完整的基因组序列。将基因组DNA序列内基因的预测用基于FGENESH隐马尔科夫(Markov)模型的基因结构预测程序 (www.softberry.com)进行。将cDNA序列用Spidey (www.ncbi.nlm.nih.gov/spidey)与基因组序列比对。将氨基酸比对使用MUSCLE (Edgar, 2004, Nucl Acids Res 32: 1792-97)进行。将Yb直向同源物通过使用Yb1或Yb2的全长氨基酸序列BLAST搜索NCBI数据库或Phytozyme数据库从不同的有机体鉴定。将所选择的结果的多序列比对使用ClustalOmega构建。将系统树使用PHYLIP (Felsenstein, 2005, PHYLIP (Phylogeny Inference Package)版本3.6. 由作者分发. Department of Genome Sciences, University of Washington, Seattle)重建和用R/ape (Paradis等人, Bioinformatics (2004) 20 (2):
289-290)可视化。
289-290)可视化。
[0369] 经由过表达Yb野生型cDNA验证基因功能具有XbaI和SacI克隆接头的Yb1和Yb2完整的野生型cDNA基于以上测定的K326 cNDA序列合成。将合成的野生型Yb候选基因的cDNA连接入pBI121用于在组成型CaMV 35S启动子控制下过表达所述基因的目的。标准的基于土壤杆菌属的转化用于将35S:NtYb1或35S:NtYb2引入白肋烟草栽培种TN 90LC和黄色白肋几乎同基因版本的烤制烟草栽培种SC58 (SC58 yb1yb1yb2yb2)。转化子在包含100 mg L-1卡那霉素和200 mg L-1特美汀的MS培养基上选择和使用特异于CaMV 35S启动子区域的PCR引物筛选。观察所得到的转基因植物的正常叶绿素产生表型的恢复。
[0370] 测定NtYb1对氮使用效率和氮利用效率的作用将显示叶绿素缺陷表型的转基因互补的3个选择的TN 90LC 35S:NtYb1 R0转化子自花授粉以产生3个针对存在掺入的转基因和叶绿素缺陷表型进行隔离的R1家族。在Oxford, NC, USA附近进行的重复田间实验中针对每植物的产量、NO3-N、N-USE和N-UTL将来自每一R1家族的白茎和绿茎分离子彼此比较和与非转基因对照植物比较。使用具有20个重复的随机化完全区组设计。实验单位由代表7个实验条目中的每一个的单一植物组成(表1)。行和行内植物间隔分别为117.8 cm和45.7 cm，实验由边界植物围绕。在移植的一周内每英亩施用
700 lbs 6-6-18肥料。第一次N施用20天后，每英亩施用75加仑液体21-0-0-24S。生产实践与北卡罗来纳用于市售晾制的烟草生产的那些一致。
700 lbs 6-6-18肥料。第一次N施用20天后，每英亩施用75加仑液体21-0-0-24S。生产实践与北卡罗来纳用于市售晾制的烟草生产的那些一致。
[0371] 表1.用以调查NtYb1过表达对氮使用效率和氮利用效率的影响的田间实验中的条目移植60天后，将个体植物在地面水平切割，记录地上生物量。将植物烘干，磨碎通过1-mm筛，按照Nelson和Sommers (Agron. J. 65:109-112;1973)分析总N和按照CORESTA推荐的36号方法(2011)分析NO3-N。N-USE和N-UTL按照Moll等人 (Agron. J. 74:562-564,
1982)和Sisson等人(Crop Sci. 31:1615-1620, 1991)使用下式计算：
N-使用效率(N-USE, g g-1) = (植物生物量, 克植物-1/单位N肥料, g植物-1)，和N-利用效率 (N-UTL, g g-1) = (植物生物量, g植物-1 / N-ACC, g植物-1)
-1
其中N-ACC = (植物生物量, g植物 x % N*10)/1000
数据使用标准方差分析进行分析，适当的单度对比陈述(contrast statement)使用SAS的PROC GLM进行以比较条目均值(SAS Institute, Cary, NC)。分析之前对NO3-N进行对数转换以减少误差方差的异质性。
1982)和Sisson等人(Crop Sci. 31:1615-1620, 1991)使用下式计算：
N-使用效率(N-USE, g g-1) = (植物生物量, 克植物-1/单位N肥料, g植物-1)，和N-利用效率 (N-UTL, g g-1) = (植物生物量, g植物-1 / N-ACC, g植物-1)
-1
其中N-ACC = (植物生物量, g植物 x % N*10)/1000
数据使用标准方差分析进行分析，适当的单度对比陈述(contrast statement)使用SAS的PROC GLM进行以比较条目均值(SAS Institute, Cary, NC)。分析之前对NO3-N进行对数转换以减少误差方差的异质性。
[0372] 测定NtYb1对烟草中TSNA积累的作用10个绿茎TN 90LC 35S:NtYb1 R0 转化子连同TN 90LC的14株非转基因对照植物在温室中生长。装盆大约70天后，将所有植物去顶以增强生物碱积累。去顶10天后，从每一植物收集最上方的两片叶并标记和晾制。5周晾制后，将叶磨碎通过1-mm筛并将样品使用气相色谱定量烟碱、去甲烟碱、新烟草碱和新烟碱，使用LC-MS定量TSNA、NNN、NNK、NAB和NAT。总TSNA计算为NNK、NNN、NAT和NAB的和。转基因35S::tYb1 TN 90LC组和非转基因TN 90LC组的TSNA均值使用简单t-检验(Steele等人, Principles and Procedures of Statistics, A Biometrical Approach (统计学原理和程序，生物统计方法); McGraw-Hill: NewYork, NY, 1997)比较。
[0373] 上述说明书中提及的所有出版物通过引用结合到本文中。对所描述的本发明的方法和系统的各种修饰和变更将会对本领域技术人员显而易见，而不脱离本发明的范围和精神。尽管已经联系特别优选的实施方案描述本发明，应理解如所要求保护的本发明不应过度限制于这样的特定的实施方案。实际上，对所描述的用于实施本发明的方式的各种修饰对生物化学和生物技术或相关领域技术人员显而易见，这些修饰意在落入所附权利要求的范围内。
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