폴레이트-키토산-융합-ＰＥＩ 공중합체 및 이를 이용한 유전자 전달체{Folate-Chitosan-graft-PEI Copolymer and Gene Delivery Carrier by using the same}

본 발명은 폴레이트-키토산-융합-PEI 공중합체 및 이를 이용한 유전자 전달체에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 폴레이트-키토산(FC)과 저분자량 PEI로 제조된 FC-g-PEI 공중합체와 이를 이용한 FC-g-PEI/DNA 유전자 전달 복합체에 관한 것이다.

다양한 핵산-기재 분자, 예를 들어, AS-ODN(antisense oligodeoxynucleotides), 리보자임 및 siRNA(small interfering RNA)를 이용하는 PTGS(Post-transcriptional gene silencing) 연구방법이 암을 포함한 다양한 유전병 및 감염 질환을 치료하는데 있어 치료적 잠재력으로 인하여 많은 주목을 받고 있다.

포유류의 세포에서, RNAi(RNA interference)는 shRNA(short hairpin-shaped RNA)를 세포 내에서 발현시킬 수 있는 합성 siRNA 또는 DNA 벡터의 트랜스펙션에 의해 유도될 수 있다. 합성 siRNA는 일시적인 효과를 나타내는 반면, shRNA 발현 벡터를 이용하면 보다 영속성 있는 억제(knock-down) 효과가 얻어진다.

siRNA 또는 shRNA 치료법의 개발에 있어서 주요한 애로사항은 이들 거대분자를 표적 세포, 조직 또는 기관으로 전달하는 것이다. siRNA 자체는, RNA 포스포디에스테르(phosphodiester) 주쇄의 강한 음이온 전하로 인해, 세포막을 자유롭게 통과할 수 없다. 따라서 siRNA 자체를 세포 내 작용 위치에 용이하게 접근시키기 위한 전달 시스템이 필요하게 된다.

최근의 임상 시험에 있어 모든 유전자 치료법 프로토콜에서 재조합 바이러스 벡터를 이용하고 있지만, 안전성의 관점에서 비-바이러스 대체수단에 대한 탐구가 이루어지고 있다. 비-바이러스 벡터들 중, 폴리에틸렌이민(polyethylenimine; PEI)이 플라스미드를 콜로이드성 입자로 효과적으로 응축시킴으로써, 그의 완충 능력으로 인해, in vitro 및 in vivo에서 모두 다양한 세포를 효과적으로 감염시킬 수 있다는 사실이 보여진 바 있다.

이와 같이 PEI는 바이러스성 벡터 보다 많은 중요한 이점을 제공하는 비바이러스성 유전자 전달 시스템에 사용되고 있다. PEI의 높은 트랜스펙션 효율이 그의 완충 능력에 관계된다고 여겨지고 있다. 그러나 독성이 중대한 관심사이다. 통상적으로 PEI의 트랜스펙션 효율 및 세포독성은 그의 분자 크기에 직접적으로 연관이 있고, 분자 크기가 클수록 트랜스펙션 활성 및 세포독성이 크다. PEI의 세포독성 메카니즘에 대한 이해는 아직까지 부족한 실정이다. 하나의 가설은 PEI가 세 포 표면에 응집하여 중요한 막 기능을 손상시킨다는 것이다. 또 다른 가능성은 PEI가 단독 또는 DNA와의 복합체로서 결정적인 세포내 과정들을 방해한다는 것이다. 반대로, 키토산은 in vitro 높은 투여량에서 용량의존적 독성이 관찰되긴 하였지만, 비바이러스성 유전자 전달을 위해 독성이 낮고 생체적합성 양이온성 중합체라는 사실이 보도된 바 있다.

그러나 많은 연구에서 통상적인 PEI의 독성과 관련하여 분자량에 따라 분자량이 큰 PEI 일수록 보다 큰 세포독성을 갖는다는 문제점이 나타나고 있다.

유전자 치료법의 진보에 있어 중요한 단계는 효과적인 표적화 유전자 전달 시스템의 개발에 있으며, 수용체-매개 유전자 전달이 유망한 유전자 전달 기법이다. 본 발명자들은 종래 연구를 통해 대한민국 등록특허 제10-0926096호에서 재조합 베큘로바이러스 벡터 표면에 폴레이트-폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol) 결합체를 수식하여 바이러스성 유전자전달체를 제조한 바 있고, 대한민국 등록특허 제10-0860416호에서 폴리카프로락톤 다이아크릴레이트와 폴리에틸렌이민을 기초로 한 생분해성 폴리에스텔아민을 이용한 새로운 유전자 전달체를 제조한 바 있으며, 유전자 전달체로 키토산-융합-PEI(chitosan-graft-PEI; CHI-g-PEI)를 제조하였다. 상기 CHI-g-PEI는 낮은 세포독성과 높은 트랜스펙션 효율을 나타내었다. 그러나 상기 시스템은 세포 특이성이 제한되었다.

이에 본 발명자들은 세포 특이성이 개선된 유전자 전달체를 개발하고자 예의 연구를 거듭한 결과 폴레이트-키토산-융합-PEI(folate-chitosan-graft-PEI; FC-g-PEI) 공중합체를 개발하고 본 발명에 이르게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 신규한 유전자 전달체로서 폴레이트-키토산-융합-PEI(folate-chitosan-graft-PEI; FC-g-PEI) 공중합체를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 상기 FC-g-PEI를 이용한 유전자 전달체를 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적은 암세포-표적화 중합체 shRNA 전달 전달체로서 폴레이트-키토산-융합-PEI(folate-chitosan-graft-PEI; FC-g-PEI) 공중합체를 합성하고, 이를 이용하여 FC-g-PEI/shRNA 복합체의 생리화학적 특성을 분석하고, 또한 세포독성, 트랜스펙션 효율 및 암세포 특이성을 조사한 결과 FC-g-PEI/Akt1 shRNA의 에어로졸 전달은 우레탄 유도 폐암 마우스 모델에서 Akt 신호 경로를 통해 폐 종양발생을 억제하였음을 확인함으로써 달성되었다.

본 발명은 하기 화학식 1의 폴레이트-키토산-융합-PEI(folate-chitosan-graft-PEI; FC-g-PEI) 공중합체를 제공한다.

<화학식 1>

상기 식에서,

K는 20 내지 200의 정수이고,

X는 1 내지 10의 정수이며,

M는 10 내지 100의 정수이고,

PEI는 폴리에틸렌이민이다.

상기와 같이 본 발명에서는 유전자 전달능과 암세포 특이성을 모두를 얻고, PEI 25K 단독에서 보다 독성을 낮추기 위하여, FC와 저분자량 PEI를 이용하여 FC-g-PEI 공중합체를 제조하였다.

본 발명에 따른 FC-g-PEI 공중합체는 과요오드산 산화 FC와 PEI의 아민기를 이민 반응시켜 제조되었다. 도 1b에 도시한 바와 같이, PEI의 양성자 피크(-HCH ₂ CH ₂ -)가 3.3±0.5 ppm에서 나타났고, 이는 PEI가 FC 사슬에 연결되었음을 나타낸다. FC-g-PEI의 분자량(24.61 kDa)은 PEI 25K의 분자량에 거의 근접한 것이다.

본 발명은 또한 FC-g-PEI 공중합체를 이용하여 제조된 FC-g-PEI/DNA 유전자 전달 복합체를 제공한다.

본 발명에 따른 FC-g-PEI 공중합체로 제조된 유전자 전달 복합체에 있어서, 전달 가능한 유전자는 포유류의 세포 또는 조직에 전달하고자 하는 모든 유전자를 포함한다. 예를 들어 siRNA 또는 shRNA, 또는 Akt1 shRNA일 수 있다.

중합체 유전자 전달체의 선행요건 중 하나는 유전자 축합능이다. 도 3a에 도시한 바와 같이, FC-g-PEI 중합체는 우수한 shRNA 결합 능력을 나타내었다. 대조군 shRNA 자체와는 반대로, 복합체 중의 shRNA는 DNase I로부터 보호되었으며(도 2d 참조), 이는 보다 완전한 shRNA가 세포로 전달되었음을 의미한다.

본 발명에 따른 모든 복합체가 80nm 미만의 균일한 입도 분포를 나타내었고, N/P 비가 증가함에 따라 입도가 감소하는 경향이 있었다(도 2b 및 2c 참조). shRNA와 FC-g-PEI 공중합체의 자가결합 시에, 복합체의 표면 전하가 보다 높은 N/P 비에서 양성이 될 때까지 높은 shRNA의 음성 전하가 빠르게 중성화되었다(도 2c 참조).

본 발명에서는 FC-g-PEI 처리군이 PEI 25K에 비해 유의적으로 보다 높은 세포 생존력이 발견되었다. 또한 본 발명에서는 PEI 25K/DNA 복합체(þ35.2 4.3 mV, N/P 비 7)에서 보다 FC-g-PEI/DNA 복합체에서(17.53.8 mV, N/P 비 14) 낮은 제타 포텐셜의 수가 보다 많았음을 밝혀냈다.

따라서 본 발명에 따른 FC-g-PEI가 생체적합성 키토산과 저분자량 PEI (PEI 1800Da)를 이용하고, 과요오드산 산화 FC와의 반응으로 PEI의 1차 아민을 차폐시킴으로써 보다 낮은 독성을 갖고 있다고 여길 수 있다. 본 발명에 따른 FC-g-PEI는 in vitro에서 폴레이트 수용체-매개 메카니즘을 통해 수용체 유전자를 성공적으로 전달하였다(도 4 참조).

한편, 본 발명에서는 폐암 유전자 치료법에서 에어로졸 유전자 전달 전달체로서 FC-g-PEI의 잠재성 또한 연구하였다. 에어로졸 유전자 전달이 두 가지 이점, 즉 직접적인 접근성이 있으며 폐 내에 비침습성으로 집적된 유전자의 비율이 높다는 점에서, 폐암 유전자 치료법을 위해, 에어로졸 유전자 전달 기술의 개발에 많은 노력이 집중되어 왔다. 폐암을 포함하는 몇몇 암에서 종종 폴레이트 수용체가 상승되며, 최근 들어 폐암이 세계에서 가장 빈번하게 진단되는 고형암일 뿐만 아니라 전세계적으로 가장 일반적인 암 사망 원인이 되고 있다. 더욱이, 키토산이 점막점착 특성을 갖고 있음이 보고된 바 있다. 본 발명에 따른 FC-g-PEI/DNA (GFP) 복합체는 폐에서 훌륭한 GFP 발현을 보여주었고, 이는 FC-g-PEI가 안전하고 효율적인 유전자 전달체가 될 수 있는 잠재성이 있음을 보여주는 것이다.

NSCLC(Non-small-cell lung cancer)이 모든 폐암의 85%를 차지하고 있으며, NSCLC 중 대략 90%가 Akt 경로의 조직적 활성화에 관련이 있다. 따라서 Akt1이 폐암 치료법에 있어 우수한 잠재적 표적 유전자이다. 실제로, 최근의 연구에서 shRNA를 이용한 Akt1 단백질의 하향조절이 in vitro에서 폐암 세포 성장을 유의적으로 감소시킬 수 있다는 사실이 보고되었다.

본 발명에서는, FC-g-PEI가 Akt1 shRNA를 폐에 성공적으로 전달하였고, 폐암 발생을 유의적으로 억제하였다(도 6b 및 표 1 참조). 이를 종합하면, 상기 데이터는 FC-g-PEI를 에어로졸-투여 폐암 유전자 치료법에서 우수한 shRNA 전달체로 사 용할 수 있다는 사실을 강력하게 제시하는 것이다.

따라서 본 발명은 FC-g-PEI/Akt1 shRNA 유전자 전달 복합체를 유효성분을 함유하는 폐암 치료용 에어로졸 조성물을 제공한다.

상기한 바와 같이 본 발명에 따른 FC-g-PEI 공중합체는 shRNA와의 복합체 형성능이 우수하여 효과적인 암세포 표적 shRNA 전달체로서의 역할을 할 수 있고, in vitro 및 in vivo에서 세포독성이 낮고, 증진된 유전자 전달 효율과 암세포 특이성을 나타내며 에어로졸 유전자 전달 시스템에 적절한 생리화학적 특성을 지녀서 안전하고 효과적인 에어로졸 유전자 전달체로서 FC-g-PEI/Akt1 shRNA의 에어로졸 전달이 유망한 폐암 치료 및 예방 수단을 제공할 수 있다.

이하에서 본 발명의 바람직한 실시형태를 실시예를 참고로 보다 구체적으로 설명한다. 하지만 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

키토산, 분지 PEI 25K, 폴산(folic acid), NHS(N-hydroxysuccinimide), DCC(N,N0-dicyclohexylcarbodiimide), 우레탄 및 과요오드화 칼륨은 시그마-알드리치사(Sigma-Aldrich; St. Louis, MO, USA)에서 입수하였다. DMEM 배지(Dulbeco's modified eagle medium)는 깁코 BRL사(Gibico BRL; Paris, France)에서 구입하였고, FBS(fetal bovine serum)는 하이클론사(HyClon; Logan, Utah, USA)에서 구입하였다. Akt1 1차 항체는 산타 크루즈 바이오테크놀로지사(Santa Cruz Biotechnology; Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다. 분지 PEI 1800Da는 와코사(Wako; Osaka, Japan)에서 구입하였다. pcDNA3.1-그린 형광 단백질(green fluorescent protein; GFP) 벡터(6.1 kb)는 인비트로겐사(Invitrogen; Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였다. shRNA (Akt1) 발현 벡터 시스템은 종래의 방법에 따라 구축하였다[Xu CX, Jere D, Jin H, Chang SH, Chung YS, Shin JY, et al. Poly(ester amine)-mediated, aerosol-delivered Akt1 small interfering RNA suppresses lung tumorigenesis. Am J Respir Crit Care Med 2008;178:60-73.].

모든 데이터는 평균 +/- SE로 나타내었고, 처리군 간의 통계적 편차는 통계적 분석 시스템 통계 소프트웨어 팩키지 버전 6.12(SAS Institute, Cary, NC, USA)를 이용하여 ANOVA(one-way analysis of variance) 및 던컨 다중 범위 시험법(Duncan's multiple range test)으로 분석하였다.

실시예 1 : FC-g-PEI 공중합체의 제조

도 1a에 도시한 바와 같이, 종래의 방법(Mansouri S, Cuie Y, Winnik F, Shi Q, Lavigne P, Benderdour M, et al. Characterization of folate-.chitosan-.DNA nanoparticles for gene therapy. Biomaterials 2006;27:2060-.5.)에 따라 키토산과 폴리산을 이용하여 FC(Folate-Chitosan)를 합성하고, 이를 이용하여 하기 화학 식 1의 FC-g-PEI 공중합체를 합성하였다.

<화학식 1>

우선, FC (1 mM)와 과요오드화 칼륨(10 mM)를 별도로 아세트산 나트륨 완충액(pH 4.5)에 용해시켰다. 각 용액을 N2로 탈기시키고, 4℃까지 조정한 후 혼합하였다. 혼합물을 48 시간 동안 반응시키고, 에틸렌 글리콜(10% v/v)을 가하여 반응을 중단시켰다. 상기 반응 용액을 3 일 동안 NaCl (0.2 M, pH 4.5)로 투석한 후(Spectra/Por membrane: MWCO¼ 3500), 3일 동안 탈이온수로 투석하였다. 4℃에서 3일 동안 자기 교반하면서, PEI 1800Da (20 mmol)를 과요오드산 산화(periodate oxidized) FC 용액(10 mmol)과 반응시켰다. 반응 용액을 수소화붕소 나트륨(1 g NaBH4/g FC)으로 처리하고, NaCl (0.2 M, pH 4.5)로 투석한 후 (MWCO:2,000-4,000), 4℃에서 탈이온수로 투석하여 미반응 PEI 1800Da를 제거하였다. 투석 후 얻어진 FC-g-PEI 공중합체를 동결건조하였다.

실시예 2 : FC-g-PEI/shRNA 복합체의 제조

상기 실시예 1에서 제조한 FC-g-PEI 공중합체에 shRNA를 축합시켜 FC-g-PEI/shRNA 복합체를 제조하였다.

N/P 비는 고분자의 아민그룹과 유전자의 인산기그룹의 비율을 나타낸다. FC-g-PEI용액에 같은 양의 DNA용액을 교반하면서 섞어주면 정전기적 작용으로 FC-g-PEI/DNA 복합체가 만들어지게 된다. 이때 넣어주는 고분자의 양을 조절하면 N/P 비(0.5-50)를 적절히 조절할 수 있다.

실험예 1 : FC-g-PEI 공중합체와 FC-g-PEI/shRNA 복합체의 특성

상기 실시예 1에서 제조한 FC-g-PEI 공중합체의 구성을 1H NMR(Avance600, Bruker, Germany)로 분석하였다(도 1b 참조).

도 1b에 나타낸 바와 같이, D2O에서 FC-g-PEI 공중합체의 1H NMR 스펙트럼에서 δ = 2.0 (-CH3, 키토산, 6.8 (=CH-, 폴산), 및 3.3-2.5(-NHCH ₂ CH ₂ -, PEI 에틸렌)을 나타났고, 이는 PEI가 FC 사슬에 연결되었음을 나타낸다. FC-g-PEI의 분자량(24.61 kDa)은 PEI 25K의 분자량에 거의 근접한 것이다.

GPC-MALS(gel permeation chromatography column with multi-angle laser scattering)(Dawn Eos, Wyatt, USA)를 이용하여 690 nm 레이저 파장에서 FC-g-PEI 공중합체의 분자량을 측정하였다.

키토산 메톡시기의 양성자와 폴산의 양성자 할당에 의해 FC 중 폴레이트기의 화학적 조성이 4몰%로 측정되었다.

이어서, 1% 아가로스겔 전기영동에 의해 FC-g-PEI 공중합체와 shRNA 축합능을 평가하였다.

자외선 조사에 의해 shRNA 감속도를 관찰하고 Cam2com 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. EF-TEM (LIBRA 120, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 FC-g-PEI/shRNA (Akt1) 복합체의 형태를 관찰하였다. 25℃에서 ELS 8000(electrophoretic light scattering spectrophotometer 8000, Otsuka Electronics, Osaka, Japan)을 이용하여 90 및 20 산란각에서 상기 복합체의 크기 및 표면 전하를 측정하였다. 전기영동을 이용하여 상기 복합체에서 DNA 보호 및 방출률을 측정하였다.

도 2a에 도시한 바와 같이, FC-g-PEI/DNA N/P 비가 약 1일 경우 shRNA의 이동이 완전하게 지연되었다. 또한 도 2b에 잘 형성된 구형의 컴팩트한 구조를 갖는 FC-g-PEI/DNA 복합체의 대표적인 형태를 나타내었다. 모든 복합체는 80nm 이하의 크기를 가졌고, 상대적으로 균일한 입도 분포가 관찰되었다. 다양한 N/P 비에서 FC-g-PEI/DNA 복합체의 제타 포텐셜을 도 2c에 나타내었다. 복합체가 완전히 형성될 수 없는 N/P 비 0.1에서, 제타 포텐셜은 음의 값이었다(23.33.4 mV). N/P 비가 증가함에 따라, 제타 포텐셜이 양의 값으로 빠르게 증가하였다(17.53.8 mV, N/P 비 14). 도 2d에 도시한 바와 같이, 대조군으로서 shRNA 자체와는 반대로 복합체 중 shRNA가 DNase I으로부터 보호되었다.

실험예 2 : 세포 생존력 분석 및 in vitro 트랜스펙션 효율

KB (human epidermal carcinoma, Korean Cell Line Bank, Seoul, South Korea) 세포 과발현 폴레이트 수용체를 RPMI 1640 (Gibco BRL, cat. SH30027.01)에서 배양하였다. 트랜스펙션 2주 전에 배양 배지를 폴레이트가 없는 RPMI 1640(Gibco BRL, cat. 27016)로 교체하여 폴레이트 수용체 과발현을 유발시켰다.

A549 (human lung carcinoma) 및 HeLa (human cervix epithelial carcinoma) 세포를, 10% FBS, 스트렙토마이신 100 mg/mL, 및 페니실린 100 U/mL가 포중된 DMEM 배지에서 배양하였다. 세포를 37℃ 습윤 5% CO2 환경에서 배양하였다. 종래의 방법(Jiang HL, Kim YK, Arote R, Nah JW, Cho MH, Choi YJ, et al. Chitosan-graft-polyethylenimine as a gene carrier. J Control Release 2007;117:273-80.)에 따라 in vitro 생존력 분석 및 트랜스펙션 효율 연구를 평가하였다.

세포독성 시험을 위해, 배양 배지 0.2mL에서 1 X 10 ⁴ cells/well 초기 밀도로 96-웰 플레이트에 세포를 접종하고, 24시간 동안 배양한 후, 여과된 중합체를 가하였다.

상기 세 가지 상이한 세포주에서 FC-g-PEI 공중합체는 PEI 25K에 비해 낮은 세포독성을 나타내었다(도 3 참조).

FC-g-PEI 공중합체 처리 세포는 최고 농도 (50 mg/mL)에서도 보다 우수한 세포 생존율을 나타낸 반면(KB, A549 및 HeLa 세포주에서 각각 41.9, 62.3 및 58.6%), PEI 25K-처리 세포의 생존율은 농도 증가에 따라 현저히 감소하였다(중합체 농도 50 mg/mL에서, KB, A549 및 HeLa 세포주에서 각각 6.1, 14.6 및 14.3%).

트랜스펙션 효율 연구를 위하여, 성장 배지 1mL에서 1.5 X 10 ⁵ cells/well의 초기 밀도로 24-웰 플레이트에 KB 세포를 접종하였다. 이를 18시간 동안 배양한 후, 배지를 무혈청 배지 또는 중합체/pGL3 (1 mg) 복합체 함유 배지로 교체하고, 추가로 4시간 동안 배양하였다. 이어서, 배지를 신선 배지로 교환한 후, 37℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 제조자의 프로토콜에 따라 루시페라아제 분석을 수행하였다.

최적 N/P 비를 결정하기 위하여, 다양한 농도의 N/P로 제조한 FC-g-PEI/DNA (pGL3) 복합체를 이용하여 KB 세포를 트랜스펙션시켰다(도 4a 참조). FC-g-PEI/DNA의 최대 트랜스펙션 효율이 N/P 비 14에서 관찰되었고, N/P 비가 더 증가함에 따라 감소하는 경향이 있었다. 도 4b에 N/P 비의 함수로서 PEI/DNA, FC-g-PEI/DNA 및 CHI-g-PEI/DNA 복합체의 트랜스펙션 효율을 나타내었다. FC-g-PEI/DNA 복합체의 트랜스펙션 효율이 각각 PEI/DNA 및 CHI-g-PEI/DNA 복합체의 12.2 및 6.9배임이 밝혀졌다.

FC-g-PEI의 폴레이트 수용체-매개 트랜스펙션을 확인하기 위해, 폴레이트-농후 레귤러 배지 또는 무폴레이트 RPMI 1640 배지 상에서 폴레이트-양성 KB 세포주를 이용하여 루시페라아제 수용체 분석을 수행하였다.

폴레이트-농후 레귤러 배지를 무폴레이트 RPMI 1640 배지로 교체함으로써 KB 세포에 폴레이트 수용체의 과별현이 유도되었음이 보고된 바 있다. 도 4c에 도시 한 바와 같이, 무폴레이트 RPMI 1640 배지에서 FC-g-PEI의 루시페라아제 활성이 고도로 증진되었으며, 이는 FCg-PEI가 수용체-매개 엔도사이토시스에 의해 KB 세포를 트랜스펙션시켰음을 지시하는 것이다.

실험예 3 : in vitro Akt1 shRNA 전달을 위한 우수한 전달체로서 FC-g-PEI

SDS-PAGE에서 단백질 30μg을 분리하고, 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼다. 막을 5% 탈지유 함유 TTBS에서 1시간 동안 블록킹시키고, 4℃로 5% 탈지유에서 상응하는 1차 항체와 함께 밤새 배양한 후, 실온으로 3시간 또는 4℃로 밤새도록 호스래디쉬 퍼옥시다아제에 컨쥬게이트시킨 2차 항체와 함께 배양하여 면역블롯팅을 수행하였다. 이를 세척 후, 형광 이미지 분석기 LAS-3000 (Fujifilm, Tokyo, Japan)로 밴드를 분석하였다. 소프트웨어(Multi Gauge version 2.02 software; Fujifilm, Tokyo, Japan)를 이용하여 웨스턴 블롯 분석을 정량화하였다.

도 5에 도시한 바와 같이, MTT 분석을 이용하여, 스크램블된 shAkt-처리 군에 대하여 각각 CHI-g-PEI 및 FC-g-PEI에서 86.1 및 83.3%의 세포 생존력이 관찰되었다. 이와는 반대로, 스크램블된 shAkt에 대하여 PEI 25K에서는 단지 65.1%의 세포 생존력이 관찰되었고, 이는 표준 PEI 25K 보다 FC-g-PEI의 세포독성이 보다 낮음을 지시하는 것이다. 반면에, shAkt-처리군에 대한 인간 피부 악성종양 세포의 세포 생존율은 세 가지 중합체 전달체에서 유의적으로 감소하였고, PEI 25K 및 CHI-g-PEI 군(대조군의 각각 53.1 및 48.9%)에 비해 FC-g-PEI 군(대조군의 43.6%)에서 세포 생존율이 더 감소하였다. FC-g-PEI가 보다 효과적인 Akt1 shRNA 전달체 인지 여부를 확인하기 위해, 웨스턴 블롯 분석법을 이용하여 FC-g-PEI, PEI 25K 및 CHI-g-PEI의 트랜스펙션 효율을 비교하였다. 도 5b에 도시한 바와 같이, PEI 25K 및 CHI-g-PEI에 비해 FC-g-PEI에서 Akt1 발현이 보다 감소하였으며, 이는 FC-g-PEI가 보다 효과적인 Akt1 shRNA 전달체임을 지시하는 것이다.

실험예 4 : In vivo 에어로졸 전달 연구

5주령 수컷 C57BL/6 마우스와 6중령 수컷 A/J 마우스를 중앙 래보레토리 애니멀사(Joongang Laboratory Animal Inc.; Seoul, Korea)에서 구입하였다. 마우스를 온도와 상대 습도 각각 23.2℃ 및 50.20%와 12시간 명암 주기로 실험용 동물 시설에서 보관하였다. 유전자 전달을 위해, 마우스를 코만 노출시키는 챔버에 넣고, 종래의 방법(10,14)에 기반한 에어로졸에 노출시켰다. C57BL/6 마우스를 네 개의 군(군 당 마우스 3 마리)으로 임의로 나누고, GFP 발현 플라스미드를 이용하여 유전자 전달체로서 FC-g-PEI의 효율을 조사하였다. 처리군을 전달체(PEI or FC-g-PEI)가 있거나 또는 있지 않은 GFP 발현 플라스미드 DNA 함유 에어로졸에 노출시키고, 나머지 한 군은 미처리군으로 이용하였다. 2일 후, 마우스를 살처분하여, GFP 신호를 검출하기 위해 폐를 수집하였다. 본 발명에 사용된 모든 방법은 서울대학교 동물 보호 및 사용 위원회(Animal Care and Use Committee at Seoul National University)의 승인을 받았다(SNU-080527-1).

폐암 치료법을 위한 shRNA 에어로졸 전달 전달체로 FC-g-PEI의 이용가능성을 조사하였다. 폐암을 유발시키기 위해, 6주령 수컷 A/J 마우스에 종래의 방 법(Kisley et al.)에 기술된 바에 따라 0.9% 염수 또는 염수에만 용해시킨 우레탄을 1회 복막주사하였다(체중 g 당 1 mg) 우레탄 주입 6주 후, 마우스를 세 개의 군(군 당 마우스 4 마리)으로 분류하고, 상기에 기술한 방법으로 에어로졸에 노출시켰다. 대조군은 미처리 상태로 남겨두고, 다른 군은 증류수 중 2.8 mg FC-g-PEI 및 1 mg DNA (스크램블 또는 Akt1 shRNA)를 함유한 에어로졸에 노출시켰다. 마우스를 4주 동안 1주에 2회 에어로졸에 노출시켰다. 실험 말미에, 마우스를 살처분하였다. 사체를 해부하는 동안, 종래 방법(Singh et al.)에 기술된 바에 따라 폐 표면의 종양 병변을 현미경으로 계수하였다. 동시에, 폐를 PBS로 관류시키고, 좌측 폐엽을 수집하여 10% 중성 완충 포르말린으로 고정시켜 조직병리학 조사를 수행하였다. 추가 연구를 위해 잔여 폐를 80℃로 보관하였다.

폐 조직을 10% 중성 완충 포르말린에 고정시키고, 파라핀으로 처리한 후, 4mm로 절단하였다. 조직학적 분석을 위하여, 조직 절다면을 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하였다. 종래 방법(Nikitin et al.)에서 기술한 바에 따라 폐 병변을 분류하였다.

도 6a에 도시한 바와 같이, 다른 세 가지 군에서 보다 FC-g-PEI/GFP 복합체-노출군에서 GFP 신호가 지배적이었다. 단백질 키나아제 B로 알려진 Akt1은 폐암을 포함하는 많은 암에서 과발현되는 종양유전자이다. FC-g-PEI가 Akt1 shRNA를 폐에 유의적으로 전달하였다(도 6b 참조). 트랜스펙션된 Akt1 shRNA가 종양 수를 감소시켰고(도 6c 및 표 1 참조), 종양 진행을 유의적으로 억제하였다(도 6d 및 표 1 참조). 이러한 결과는 FC-g-PEI가 in vivo에서 shRNA 전달 전달체로서 효과적으로 작용함을 명확히 지시하는 것이다.

<표 1>

우레탄 유도 폐암 모델 마우스의 폐에서 종양 빈도

+++, 폐포 상피 과형성 등급이 적절함

++, 폐포 상피 과형성 등급이 가벼움

a, b, c 열 내에서 처리군 간의 평균의 표준편차(P<0.05)를 나타냄. CON(대조구); SCR(스크램블 대조군); shAkt1(Akt1 shRNA).

도 1a는 본 발명에 따른 FC-g-PEI 공중합체의 합성 과정을 개략적으로 나타낸 도이다.

도 1b는 본 발명에 따른 FC-g-PEI 공중합체의 NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다.

도 2는 본 발명에 따른 FC-g-PEI/shRNA 복합체의 특성을 나타낸 도로서, (a) 다양한 N/P 비에서 상기 복합체의 아가로스 젤 전기영동 결과, (b) FC-g-PEI/shRNA의 EF-TEM 이미지 및 입도 분포, (c) 다양한 N/P 비에서 상기 복합체의 입도 및 표면 변화, (d) shRNA의 보호 및 방출 분석 결과를 나타낸 것이다.

도 3은 세 가지 상이한 세포주 (a) KB, (b) A549 및 (c) HeLa에서 다양한 농도의 본 발명에 따른 공중합체의 세포 독성 결과를 나타낸 도이다.

도 4는 본 발명에 따른 공중합체의 트랜스펙션 연구 결과를 나타낸 도로서, (a) KB 세포에서 다양한 N/P 비에서 FC-g-PEI/DNA (pGL3) 복합체의 트랜스펙션 효율, (b) KB 세포에서 기능적 N/P 비에서 중합/DNA 복합체의 트랜스펙션 효율, (c) 폴레이트-풍부 정규 배지와 무-폴레이트 배지에 대한 경쟁 분석 결과를 나타낸 도이다.

도 5는 (a) KB 세포에서 FC-g-PEI/Akt1 shRNA 복합체의 세포 생존력 결과 및 (b) Akt1 단백질에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 도이다.

도 6은 에어로졸 유전자 전달 전달체로서 FC-g-PEI 공중합체의 효율을 나타낸 도로서, (a) 유전자 전달체로서 FC-g-PEI 공중합체의 전달 효율을 FC-g-PEI/GFP 복합체를 이용하여 평가한 결과, (b) FC-g-PEI/Akt1 shRNA의 에어로졸 전달이 우레탄-유도 폐암 모델 마우스에서 폐 종양 진행을 저해한 결과, (c) 다양한 가시 구역에서 나타낸 폐 사진(화살표 및 점선원) 및 (d) 조직학적 특성을 나타낸 도이다. CON: 대조구; SCR: 스크램블 대조구; shAkt1: Akt1 shRNA. X100 배율, 눈금 막대는 100 mm임.