一种蛹虫草高活性菌种选育方法
阅读：1060发布：2020-06-22
专利汇可以提供一种蛹虫草高活性菌种选育方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于蛹虫草栽培技术领域，公开了一种蛹虫草高活性菌种选育方法利用人工分离蛹虫草单孢子菌种，采用分子 生物 学方法区分蛹虫草基因交配型；通过筛选高产虫草素、腺苷等活性物质的单孢子菌种；经过营养 亲和性 筛选，选出一对不同基因交配型菌种 配对 进一步通过出草验证获得高产目标菌株。本发明改变了传统的通过改变培养基配方和简单的交配型配对的菌种选育技术，配对出草验证，突破了育种工作无量化考察参数的技术 瓶颈 ，该发明可用于蛹虫草退化菌株的复壮也可应用于高活性菌种的选育，摆脱了传统育种方式的盲目和无序性，对于蛹虫草工厂化生产稳定产量、抑制菌种退化、针对已退化菌种进行复壮、选育高活性菌种具有重要意义。，下面是一种蛹虫草高活性菌种选育方法专利的具体信息内容。
1.一种蛹虫草高活性菌种选育方法，其特征在于，所述蛹虫草高活性菌种选育方法利用人工分离蛹虫草单孢子菌种，采用分子生物学方法鉴定蛹虫草基因交配型；通过筛选高产多糖、腺苷、虫草素活性物质的单孢子菌种；并经过营养亲和性试验，选择一定活性物质代谢能力强并且营养亲和的一对不同基因交配型蛹虫草单孢子菌种，进一步通过出草验证获得子实体高产并且子实体中多糖的活性物质高的目标菌株。
2.如权利要求1所述的蛹虫草高活性菌种选育方法，其特征在于，所述利用人工分离蛹虫草单孢子菌种，采用分子生物学方法区分蛹虫草交配型，包括：通过对蛹虫草分生孢子进行单孢分离获得单孢菌株，利用PCR检测获得mat-alpha和mat-HMG两种交配型单孢株。
3.如权利要求1所述的蛹虫草高活性菌种选育方法，其特征在于，所述通过筛选高产活性物质的单孢子菌种，包括：利用对获得mat-alpha和mat-HMG两种不同交配型单孢株分别接种到摇瓶内，200rpm/min培养7天后测摇瓶菌丝中腺苷、虫草素活性物质，筛选高产活性成分的单孢子菌种保留。
4.如权利要求1所述的蛹虫草高活性菌种选育方法，其特征在于，所述进一步通过出草验证获得高产目标菌株，利用选育方法获得蛹虫草菌株菌种，包括：按照mat-alpha与mat-HMG菌株营养亲和性分析获得营养亲和的株，进一步通过该出草验证，获得一对成功配对，子实体产量高并且子实体富含虫草多糖、腺苷的活性物质的单孢子菌株。
5.如权利要求1所述的蛹虫草高活性菌种选育方法，其特征在于，所述基于蛹虫草交配型的蛹虫草高产栽培方法，具体包括：
蛹虫草单孢株的获得；
单孢株交配型的PCR检测及两种交配型的液体培养；
柞蚕蛹活体接种及子实体的培养；
米饭培养基接种及子实体的培养。
6.如权利要求5所述的蛹虫草高活性菌种选育方法，其特征在于，蛹虫草单孢株的获得，具体包括：
将蛹虫草原始菌株和传代多次的蛹虫草菌株接种到SDAY培养基上，22℃培养14天，取少量分生孢子于已加入无菌吐温80溶液三角瓶中，剧烈涡旋后过滤，用血球计数板计数孢悬液浓度，梯度稀释成100个孢子/mL的孢悬液；
用微量移液器取10μL孢子悬浮液滴加在40mm PDA培养基平板上中心位置；
22℃恒温箱培养24h至孢子刚萌发伸长，分析培养皿中孢子萌发情况，标记好萌发出芽管的单孢子位点，继续培养24h后，再依次分析培养皿中菌丝萌发情况，将只带有一个孢子且已正常萌发出和菌丝的培养皿培养基中心位置的培养基，用接种铲转接到90mm PPDA培养基平板上，22℃恒温箱继续培养至单菌落，为单孢株。
7.如权利要求5所述的蛹虫草高活性菌种选育方法，其特征在于，单孢株交配型的PCR检测及两种交配型的液体培养，具体包括：
利用氯化苄方法提取蛹虫草单孢株基因组，PCR检测其交配型；
分别取mat-alpha和mat-HMG单孢株接种到摇瓶中，避光22℃、200rpm/min，培养7d，收集菌丝体，采用HPLC法建成菌丝体中腺苷、虫草素和多糖的含量，分别各选10株mat-alpha和mat-HMG单孢株活性成分含量相对较高的菌种进一步进行营养亲和性分析；
分别取mat-alpha和mat-HMG单孢株点接到同一PPDA培养基平板上，相聚1.5-2cm，22℃恒温箱继续培养至两单孢子菌株菌落靠近，判断两菌株的营养亲和性，保留营养亲和性配对菌株。
8.如权利要求5所述的蛹虫草高活性菌种选育方法，其特征在于，柞蚕蛹活体接种及子实体的培养，具体包括：
将筛选得到的营养亲和的配对菌种斜面种子，分别接种1cm2的菌苔接种到摇瓶中，避光
22℃、200rpm/min，培养5d获得液体种子，用无菌注射器吸取混合菌液注射到柞蚕蛹体内，每个柞蚕蛹注射200Ul；
将注射好的柞蚕蛹放到无菌罐头瓶内，每瓶放2个；避光16℃培养15d，然后换做16℃避光7h、22℃光照17h培养5d，最后22℃光照培养45d。
9.如权利要求5所述的蛹虫草高活性菌种选育方法，其特征在于，米饭培养基接种及子实体的培养，具体包括：
2
将筛选得到的营养亲和的配对菌种斜面种子，分别接种1cm的菌苔接种到摇瓶中，避光
22℃、200rpm/min，培养5d获得液体种子，用移液器吸取混合菌液均匀喷洒到装有米饭培养基表面的培养瓶内，每瓶米饭培养基喷洒3ml；
将接种好的米饭培养基避光18℃培养15d，然后换做22℃光照17h培养6d，最后22℃光照培养40d。
一种蛹虫草高活性菌种选育方法
技术领域
[0001] 本发明属于蛹虫草栽培技术领域，尤其涉及一种蛹虫草高活性菌种选育方法。
背景技术
[0002] 目前，业内常用的现有技术是这样的：
[0003] 蛹虫草Cordyceps militaris，又名北冬虫夏草、北虫草，是一种能够寄生在鳞翅目昆虫的蛹及幼虫上的虫生真菌，与冬虫夏草同为麦角菌科虫草属，具有与冬虫夏草相似的活性成分和医疗保健功效，为我国传统滋补性中药，应用历史悠久。中医认为其入肺肾二经，既能补肺阴，又能补肾阳，主治肾虚，阳痿遗精，腰膝酸痛，病后虚弱，久咳虚弱，劳咳痰血，自汗盗汗等。《新华本草纲要》中记载，蛹虫草“全草：味甘、性平。有益肺肾、补精髓、止血化痰的功能”。《中华药海》中记载，蛹草“甘，平，入肺、肾二经。功效主治：(1)益肾补阳：本品甘平，补肾阳，益精髓，用治肾阳不足，髓海空虚，眩晕耳鸣，健忘不寐，腰膝酸软，阳痿早泻等症；(2)止血化痰：本品即补肾阳，有益肺阴，保肺益肾，秘精益气，对肺肾不足，久咳虚喘，劳嗽痰血者，有较好疗效”。《全国中草药汇编》记载：“蛹草(蛹虫草)的子实体及虫体也可作冬虫夏草入药”。
[0004] 现代医学研究认为蛹虫草有止咳、镇痛、降压、抗疲劳、抗菌、消炎、抗癌、增强免疫力、延缓衰老等多种重要的生理活性，被广泛认为是冬虫夏草的最佳替代品。因蛹虫草可在人工气候条件下批量栽培生产且其本身任何无毒副作用，于2009年被国家卫生部批准为新资源食品，后于2014年被国家卫生计生委批准为新食品原料，其主要质量指标为虫草素、多糖、硒等生物活性成分含量。由于国内亚健康人群日益增多，人民养生意识逐步增强，健康观念偏向“绿色、天然”，蛹虫草作为食用保健价值兼具的滋补类食用菌，拥有广泛的基础消费人群，并越来越受到消费者的青睐。
[0005] 蛹虫草是一种异宗配合的子囊菌,异核体所产生的有性后代中具有两种可亲和的交配型，即mat-alpha和mat-HMG两种交配型。研究表明，当菌株只含有其中一类交配型不能够完成有性生活史，只有当同时含有这两种交配型时才能完成有型生活史，具备形成具有子囊壳的子实体。因此，研究蛹虫草菌株在生长过程中所需的两种交配型的最优比例，对提高蛹虫草子实体产量、退化菌株的复壮和减缓菌株菌株退化具有重要意义。近年来，对蛹虫草交配型的报道和研究日益增多，但是有关蛹虫草两种交配型比例与菌株生长状况之间关系的研究报道很少。继2005年Yokoyama等成功获得蛹虫草的mat-alpha和mat-HMG两种交配型基因的全长序列后(序列号分别是AB194982和AB084257)，zhang等2013年利用子囊孢子弹射获得蛹虫草单孢株后，PCR检测单孢株的交配型，将不同交配型单孢菌株混合培养得到的子实体产量是单一交配型(mat-alpha或mat-HMG)菌株的 5倍。但是Zhang等利用子囊孢子弹射获得单孢株的方法比较繁琐，且准确度较低，同时Zhang等并没有找到高产子实体的两种交配型菌株的最优比例。黄勃等 (ZL201310578734.3)专利中对蛹虫草进行单孢分离获得单孢菌株，利用PCR检测获得mat-alpha和mat-HMG两种交配型单孢株，按照mat-alpha与mat-HMG 菌株1:12的质量比接种于柞蚕蛹上获得高产的子实体。但是该方法一方面没有考虑到并非所有的蛹虫草菌株mat-alpha与mat-HMG菌株的最佳接种质量比例都是 1:12，另一方面该方法尚未考虑到单孢子菌株的营养不亲和性，个别营养不亲和菌种配对时会导致蛹虫草不出草的事情，造成经济损失和资源的浪费。本发明对蛹虫草分生孢子进行单孢分离，获得两种不同交配型单孢株，并进行菌种活性物质产量和菌株间的营养亲和性分析，选择营养亲和并且菌丝体中活性成分含量高的mat-alpha与mat-HMG菌株配对制备液体种子作为蛹虫草栽培种，这一方法在国内外也未见有报道。
[0006] 综上所述，现有技术存在的问题是：
[0007] (1)现有技术中，蛹虫草菌株由于传代多次导致子实体产量迅速降低和菌种保存困难。没有考虑到可通过蛹虫草原始菌株中分离mat-alpha与mat-HMG两种基因型菌株，重新配对后可解决传代次数多、保存时间长导致的菌株退化问题；
[0008] (2)有的学者期望寻求一定的不同基因交配型菌株间的比例获得蛹虫草子实体的高产，但是他们没有考虑到不同的蛹虫草菌株mat-alpha与mat-HMG菌株的最佳接种质量比是不同的；
[0009] (3)现有的基于基因交配型的蛹虫草育种方法中尚未考虑到单孢子菌株的营养不亲和性，若菌株间营养不亲和，将会导致菌株间营养不亲和导致的不能通过有性生殖阶段长出蛹虫草子实体。
[0010] (4)现有技术中，有的学者开始通过分离得到单孢子菌株，并且选取两种交配型间的最佳比例，期望获得蛹虫草高产，但是忽略了蛹虫草子实体中活性物质的含量问题，不同的单孢子菌株代谢产生蛹虫草多糖、腺苷等活性物质的能力是不同的。
[0011] 解决上述技术问题的难度和意义：
[0012] 本发明可快速提高子实体产量和子实体中活性物质，同时克服了菌株传代多次导致子实体产量迅速降低和菌种保存困难的问题。
[0013] 本发明对蛹虫草分生孢子进行单孢分离，获得两种不同交配型单孢株，并进行菌种活性物质产量和菌株间的营养亲和性分析，选择营养亲和并且菌丝体中活性成分含量高的mat-alpha与mat-HMG菌株配对制备液体种子作为蛹虫草栽培种，这一方法在国内外也未见有报道。
[0014] 本发明，不仅从分离得到的单孢子菌株中筛选了高产多糖、腺苷等活性物质的单孢子菌株，并且从营养亲和的角度筛选了营养亲和的一对mat-alpha与 mat-HMG菌株作为目标菌种，经制备液体种子阶段，让一对菌株在液体种子培养阶段自然配对，再接入固体培养基，该方法不仅可获得蛹虫草子实体的高产，并且蛹虫草子实体中多糖、腺苷、虫草素等活性物质含量显著提高。
发明内容
[0015] 针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于蛹虫草交配型的蛹虫草高产栽培方法。本发明可以直接用于生产，是一种保证子实体和活性物质高产的新方法。本发明通过营养亲和配对筛选，获得营养亲和不同基因交配型菌种避免了盲目配对出现营养不亲和导致不出草或子实体产量下降的问题，2、通过考察单交配型菌种的活性物质代谢能力，有目的的选择高活性菌种，进一步配对出草验证，活性高产活性物质的菌株。该方法适用于退化菌株的复壮，也可应用于高活性菌株的选育。
[0016] 蛹虫草单孢子菌种是现有技术，被相关文献提及和相关单位保藏；
[0017] 信息为：蛹虫草单孢子菌种中文名称：蛹虫草(北冬虫夏草，北虫草)
[0018] 拉丁名称：Cordyceps militaris
[0019] 其它保藏中心编号：＝ACCC 50632
[0020] 来源历史：←食用菌中心
[0021] 收藏时间：2006/10/10
[0022] 资源归类编码：15152117101
[0023] 模式菌株：非模式菌株
[0024] 主要用途：研究。
[0025] 本发明是这样实现的，
[0026] 一种蛹虫草高活性菌种选育方法，所述蛹虫草高活性菌种选育方法利用人工分离蛹虫草单孢子菌种，采用分子生物学方法鉴定蛹虫草基因交配型；通过筛选高产多糖、腺苷、虫草素等活性物质的单孢子菌种；并经过营养亲和性试验，选择一定活性物质代谢能力强并且营养亲和的一对不同基因交配型蛹虫草单孢子菌种，进一步通过出草验证获得子实体高产并且子实体中多糖等活性物质较高的目标菌株。
[0027] 进一步，所述利用人工分离蛹虫草单孢子菌种(单孢子菌株分离参考汪黎明(2011)的方法)，采用分子生物学方法区分蛹虫草交配型，包括：本发明专利通过对蛹虫草分生孢子进行单孢分离获得单孢菌株，利用PCR检测获得 mat-alpha和mat-HMG两种交配型单孢株(单孢株的模板提取参照朱衡等(1994)。扩增体系和扩增条件参照Yokoyama et al.(2004)和谭琦等(2011)的方法，并略作改进)。
[0028] 进一步，所述通过筛选高产活性物质的单孢子菌种，包括：利用对获得 mat-alpha和mat-HMG两种不同交配型单孢株分别接种到摇瓶内，200rpm/min培养7天后测摇瓶菌丝中腺苷、虫草素活性物质，筛选高产活性成分的单孢子菌种保留。
[0029] 本发明不仅从分离得到的单孢子菌株中筛选了高产多糖、腺苷等活性物质的单孢子菌株，并且从营养亲和的角度筛选了营养亲和的一对mat-alpha与 mat-HMG菌株作为目标菌种，经配对制备液体种子栽培蛹虫草子实体，该方法不仅获得子实体高产，并且蛹虫草中多糖、腺苷、虫草素等活性物质含量高的方法。该发明专利规避了基于交配型育种时随机选择一对蛹虫草菌种mat-alpha与 mat-HMG菌株进行配对复壮菌种的盲目性，并且创造性的从提高子实体品质的角度，筛选了活性物质代谢能力强的菌株作为目标菌种，显著提高了蛹虫草子实体的品质，该技术打破了传统育种手段和提高蛹虫草子实体品质技术的瓶颈，可有效推动蛹虫草行业的发展，并且可为其他真菌的育种提供一定的理论支持。
[0030] 进一步，所述利用人工分离蛹虫草单孢子菌种，采用分子生物学方法区分蛹虫草交配型，包括：本发明对蛹虫草分生孢子进行单孢分离，获得两种不同交配型单孢株，并进行菌种活性物质产量和菌株间的营养亲和性分析，选择营养亲和并且菌丝体中活性成分含量高的mat-alpha与mat-HMG菌株配对制备液体种子作为蛹虫草栽培种，经固体栽培获得蛹虫草子实体的高产和高品质的蛹虫草子实体。
[0031] 进一步，所述通过筛选高产活性物质的单孢子菌种，包括：利用对获得 mat-alpha和mat-HMG两种不同交配型单孢株分别接种到摇瓶内，200rpm/min培养7天后测摇瓶菌丝中腺苷、虫草素活性物质，筛选高产活性成分的单孢子菌种保留。
[0032] 进一步，所述进一步通过出草验证获得高产目标菌株，利用选育方法获得蛹虫草菌株菌种，包括：按照mat-alpha与mat-HMG菌株营养亲和性分析获得营养亲和的株，进一步通过该出草验证，获得一对菌株配对成功配对，子实体产量高并且子实体富含虫草多糖、腺苷的活性物质的单孢子菌株。
[0033] 该发明专利不仅从分离得到的单孢子菌株中筛选了高产多糖、腺苷等活性物质的单孢子菌株，并且从营养亲和的角度筛选了营养亲和的一对mat-alpha与 mat-HMG菌株作为目标菌种，经配对制备液体种子栽培蛹虫草子实体，该方法不仅获得子实体高产，并且蛹虫草中多糖、腺苷、虫草素等活性物质含量高的方法。该发明专利规避了基于交配型育种时随机选择一对蛹虫草菌种mat-alpha与 mat-HMG菌株进行配对复壮菌种的盲目性，并且创造性的从提高子实体品质的角度，筛选了活性物质代谢能力强的菌株作为目标菌种，显著提高了蛹虫草子实体的品质，该技术打破了传统育种手段和提高蛹虫草子实体品质技术的瓶颈，适用于所有的蛹虫草菌株的育种，可有效推动蛹虫草行业的发展，并且可为其他真菌的育种提供一定的理论支持。
[0034] 进一步，所述基于蛹虫草交配型的蛹虫草高产栽培方法，具体包括：
[0035] 蛹虫草单孢株的获得；
[0036] 单孢株交配型的PCR检测及两种交配型的液体培养；
[0037] 柞蚕蛹活体接种及子实体的培养；
[0038] 米饭培养基接种及子实体的培养。
[0039] 进一步，蛹虫草单孢株的获得，具体包括：
[0040] 将蛹虫草原始菌株和传代多次的蛹虫草菌株接种到SDAY培养基上，22℃培养14天，取少量分生孢子于已加入无菌吐温80溶液三角瓶中，剧烈涡旋后过滤，用血球计数板计数孢悬液浓度，梯度稀释成100个孢子/mL的孢悬液；
[0041] 用微量移液器取10μL孢子悬浮液滴加在40mm PDA培养基平板上中心位置；
[0042] 22℃恒温箱培养24h至孢子刚萌发伸长，分析培养皿中孢子萌发情况，标记好萌发出芽管的单孢子位点，继续培养24h后，再依次分析培养皿中菌丝萌发情况，将只带有一个孢子且已正常萌发出和菌丝的培养皿培养基中心位置的培养基，用接种铲转接到90mm PPDA培养基平板上，22℃恒温箱继续培养至单菌落，为单孢株。
[0043] 进一步，单孢株交配型的PCR检测及两种交配型的液体培养，具体包括：
[0044] 利用氯化苄方法提取蛹虫草单孢株基因组，PCR检测其交配型；
[0045] 分别取mat-alpha和mat-HMG单孢株接种到摇瓶中，避光22℃、200rpm/min，培养7d，收集菌丝体，采用HPLC法建成菌丝体中腺苷、虫草素和多糖的含量，分别各选10株mat-alpha和mat-HMG单孢株活性成分含量相对较高的菌种进一步进行营养亲和性分析；
[0046] 分别取mat-alpha和mat-HMG单孢株点接到同一PPDA培养基平板上，相聚1.5-2cm，22℃恒温箱继续培养至两单孢子菌株菌落靠近，判断两菌株的营养亲和性，保留营养亲和性配对菌株。
[0047] 进一步，柞蚕蛹活体接种及子实体的培养，具体包括：
[0048] 将筛选得到的营养亲和的配对菌种斜面种子，分别接种1cm2的菌苔接种到摇瓶中，避光22℃、200rpm/min，培养5d获得液体种子，用无菌注射器吸取混合菌液注射到柞蚕蛹体内，每个柞蚕蛹注射200Ul；
[0049] 将注射好的柞蚕蛹放到无菌罐头瓶内，每瓶放2个；避光16℃培养15d，然后换做16℃避光7h、22℃光照17h培养5d，最后22℃光照培养45d。
[0050] 进一步，米饭培养基接种及子实体的培养，具体包括：
[0051] 将筛选得到的营养亲和的配对菌种斜面种子，分别接种1cm2的菌苔接种到摇瓶中，避光22℃、200rpm/min，培养5d获得液体种子，用移液器吸取混合菌液均匀喷洒到装有米饭培养基表面的培养瓶内，每瓶米饭培养基喷洒3ml；
[0052] 将接种好的米饭培养基避光18℃培养15d，然后换做22℃光照17h培养6d，最后22℃光照培养40d。
[0053] 综上所述，本发明的优点及积极效果为：
[0054] 本发明利用人工分离蛹虫草单孢子菌种，采用分子生物学方法区分蛹虫草交配型，通过筛选高产活性物质的单孢子菌种，进一步通过出草验证获得高产目标菌株，利用新的选育方法获得蛹虫草菌株高产菌种，该方法可保持蛹虫草子实体高产的目的。
[0055] 本发明通过对蛹虫草分生孢子进行单孢分离获得单孢菌株，利用PCR检测获得mat-alpha和mat-HMG两种交配型单孢株。
[0056] 本发明利用对获得mat-alpha和mat-HMG两种不同交配型单孢株分别接种到摇瓶内，200rpm/min培养7天后测摇瓶菌丝中腺苷、虫草素等活性物质，筛选高产活性成分的单孢子菌种保留。
[0057] 本发明通过按照mat-alpha与mat-HMG菌株营养亲和性分析获得营养亲和的株，进一步通过该出草验证，获得一对成功配对，子实体产量高并且子实体富含虫草多糖、腺苷等活性物质的单孢子菌株。
[0058] 本发明通过对分别保存并传代多次的mat-alpha与mat-HMG单孢子菌株，按照配对制备液体种子，接种到柞蚕蛹或者米饭培养基上，相对传代多次的混合菌株和原始菌种均具有较高子实体产量。
[0059] 本发明改变新型培养基配方和菌种选育技术通过营养亲和配对进行交配型菌株的复壮，以及交配型、蛹虫草代谢物的定向调控技术，该技术突破了育种工作无量化考察参数的技术瓶颈，摆脱了传统育种方式的盲目和无序性，对于蛹虫草工厂化生产稳定产量、抑制菌种退化具有重要意义，并通过开发蛹虫草高产栽培新技术可进一步提高蛹虫草的生物转化率和产品品质。
[0060] 本发明的优点还有，如下表1、表2.
[0061] 表1子实体产量
[0062]
[0063] 注：表中数字后不同字母表示各组数据间差异性极显著P＜0.05
[0064] 表2子实体生物活性成分分析
[0067] 图2是本发明实施例提供的22℃恒温箱培养24h至孢子刚萌发伸长，利用显微镜依次观察培养皿中孢子萌发情况，标记好萌发出芽管的单孢子位点图。
[0068] 图3是本发明实施例提供的利用氯化苄方法提取蛹虫草单孢株基因组，PCR 检测其交配型图。
[0069] 图4是本发明实施例提供的分别取mat-alpha和mat-HMG单孢株点接到同一 PPDA培养基平板上，相聚1.5-2cm，22℃恒温箱继续培养至两单孢子菌株菌落靠近，判断两菌株的营养亲和性，保留营养亲和性配对菌株图。
[0070] 图5是本发明实施例提供的蛹虫草培养图谱。
具体实施方式
[0071] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0072] 现有技术中，没有考虑到并非所有的蛹虫草菌株mat-alpha与mat-HMG菌株的最佳接种质量比例都是1:12；尚未考虑到单孢子菌株的营养不亲和性。
[0073] 本发明改变了传统的通过改变培养基配方和简单的交配型配对的菌种选育技术，本发明不仅通过营养亲和配对筛选，获得营养亲和不同基因交配型菌种，并且通过考察单交配型菌种的活性物质代谢能力，有目的的选择高活性菌种，进一步配对出草验证，该技术突破了育种工作无量化考察参数的技术瓶颈，该发明可用于蛹虫草退化菌株的复壮也可应用于高活性菌种的选育，摆脱了传统育种方式的盲目和无序性，对于蛹虫草工厂化生产稳定产量、抑制菌种退化、针对已退化菌种进行复壮、选育高活性菌种具有重要意义。
[0074] 本发明实施例提供的蛹虫草高活性菌种选育方法，利用人工分离蛹虫草单孢子菌种，采用分子生物学方法鉴定蛹虫草基因交配型；通过筛选高产多糖、腺苷、虫草素等活性物质的单孢子菌种；并经过营养亲和性试验，选择一定活性物质代谢能力强并且营养亲和的一对不同基因交配型蛹虫草单孢子菌种，进一步通过出草验证获得子实体高产并且子实体中多糖等活性物质较高的目标菌株。
[0075] 所述利用人工分离蛹虫草单孢子菌种(单孢子菌株分离参考汪黎明(2011) 的方法)，采用分子生物学方法区分蛹虫草交配型，包括：本发明专利通过对蛹虫草分生孢子进行单孢分离获得单孢菌株，利用PCR检测获得mat-alpha和 mat-HMG两种交配型单孢株(单孢株的模板提取参照朱衡等(1994)。扩增体系和扩增条件参照Yokoyama et al.(2004)和谭琦等(2011)的方法，并略作改进)。
[0076] 所述通过筛选高产活性物质的单孢子菌种，包括：利用对获得mat-alpha 和mat-HMG两种不同交配型单孢株分别接种到摇瓶内，200rpm/min培养7天后测摇瓶菌丝中腺苷、虫草素活性物质，筛选高产活性成分的单孢子菌种保留。
[0077] 图1，本发明实施例提供的蛹虫草高活性菌种选育方法，包括：
[0078] S101：蛹虫草单孢株的获得:
[0079] a、将蛹虫草原始菌株和传代多次的蛹虫草菌株接种到SDAY培养基上，22℃培养14天，取少量分生孢子于已加入无菌吐温80溶液三角瓶中，剧烈涡旋后过滤，用血球计数板计数孢悬液浓度，梯度稀释成100个孢子/mL的孢悬液。
[0080] b、用微量移液器取10μL孢子悬浮液滴加在40mm PDA培养基平板上中心位置(每个培养皿3ml培养基)。
[0081] c、22℃恒温箱培养24h至孢子刚萌发伸长，利用显微镜依次观察培养皿中孢子萌发情况，标记好萌发出芽管的单孢子位点(如图2所示)，继续培养24h 后，利用显微镜再依次观察培养皿中菌丝萌发情况，将只带有一个孢子且已正常萌发出和菌丝的培养皿培养基中心位置的培养基，用接种铲转接到90mm PPDA 培养基平板上，22℃恒温箱继续培养至单菌落，即为单孢株。
[0082] S102：单孢株交配型的PCR检测及两种交配型的液体培养:
[0083] a、利用氯化苄方法提取蛹虫草单孢株基因组，PCR检测其交配型(如图3 所示)。
[0084] b、分别取mat-alpha和mat-HMG单孢株接种到摇瓶中，避光22℃、 200rpm/min，培养7d，收集菌丝体，采用HPLC法建成菌丝体中腺苷、虫草素和多糖的含量，分别各选10株mat-alpha和mat-HMG单孢株活性成分含量相对较高的菌种进一步进行营养亲和性。
[0085] c、分别取mat-alpha和mat-HMG单孢株点接到同一PPDA培养基平板上，相聚1.5-2cm，22℃恒温箱继续培养至两单孢子菌株菌落靠近，判断两菌株的营养亲和性，保留营养亲和性配对菌株(如图4所示)。
[0086] S103：子实体的培养:
[0087] a、将筛选得到的营养亲和的配对菌种斜面种子，分别接种1cm2的菌苔接种到摇瓶中，避光22℃、200rpm/min，培养5d获得液体种子，用无菌注射器吸取混合菌液注射到柞蚕蛹体内，每个柞蚕蛹注射200uL。
[0088] b、将注射好的柞蚕蛹放到无菌罐头瓶内，每瓶放2个。避光16℃培养15d，然后换做16℃避光7h、22℃光照17h培养5d，最后22℃光照培养45d。
[0089] S104：米饭培养基接种及子实体的培养:
[0090] a、将筛选得到的营养亲和的配对菌种斜面种子，分别接种1cm2的菌苔接种到摇瓶中，避光22℃、200rpm/min，培养5d获得液体种子，用移液器吸取混合菌液均匀喷洒到装有米饭培养基表面的培养瓶内，每瓶米饭培养基喷洒3ml。
[0091] b、将接种好的米饭培养基避光18℃培养15d，然后换做22℃光照17h培养 6d，最后22℃光照培养40d。
[0092] 图5是本发明实施例提供的蛹虫草培养图谱。
[0093] 下面结合具体实施例及分析对本发明作进一步描述。
[0094] 实施例:
[0095] 本发明实施例提供的基于蛹虫草交配型的蛹虫草高产栽培方法，
[0096] 1、单孢株分离：在PDA(4％葡萄糖、1％蛋白胨、2％琼脂)平板上接种蛹虫草菌株，25℃恒温培养箱中培养2周，待充分产孢后取少量分生孢子于50ml 三角瓶中，加入20mL
0.05％(v/v)的无菌吐温80溶液，剧烈涡旋振荡配成孢子悬浮液，过滤去除未分散的孢子团和少量菌丝，用血球计数板计数孢悬液浓度，经梯度稀释后，配制成浓度为200个孢子/mL的孢悬液。将直径为5mm的无菌玻璃纸圆片放置于90mm PDA培养基平板上，每个平板放15个玻璃纸圆片。用微量移液器取5μL孢子悬浮液(平均为1个孢子/5μL)滴加在5mm的圆形玻璃纸中央，25℃恒温箱培养20h至孢子刚萌发伸长，利用倒置显微镜依次查看圆片上孢子萌发情况，将只带有一个孢子且已萌发出芽管的圆片做好标记。继续培养至35h、45h和60h后，分别再次检验原片上是否只带有一个萌发的孢子，将圆片转接至新的PDA培养基平板中央，每个平板接1个孢子，25℃恒温箱继续培养至单菌落，即为单孢株。
0.05％(v/v)的无菌吐温80溶液，剧烈涡旋振荡配成孢子悬浮液，过滤去除未分散的孢子团和少量菌丝，用血球计数板计数孢悬液浓度，经梯度稀释后，配制成浓度为200个孢子/mL的孢悬液。将直径为5mm的无菌玻璃纸圆片放置于90mm PDA培养基平板上，每个平板放15个玻璃纸圆片。用微量移液器取5μL孢子悬浮液(平均为1个孢子/5μL)滴加在5mm的圆形玻璃纸中央，25℃恒温箱培养20h至孢子刚萌发伸长，利用倒置显微镜依次查看圆片上孢子萌发情况，将只带有一个孢子且已萌发出芽管的圆片做好标记。继续培养至35h、45h和60h后，分别再次检验原片上是否只带有一个萌发的孢子，将圆片转接至新的PDA培养基平板中央，每个平板接1个孢子，25℃恒温箱继续培养至单菌落，即为单孢株。
[0097] 2、蛹虫草菌丝基因组DNA的提取:将冷冻干燥的蛹虫草菌丝用冻干机冷冻冻干后用枪头研磨成粉末，加入0.5mlDNA提取液，0.1ml 10％SDS和0.3ml氯化苄，剧烈震荡成乳状。在50℃的水浴锅内加热1h，其中隔10min要求水平震荡混合一次。加入0.3ml NaAC(3M.PH5.2)混匀，冰水15min，后离心(12000rpm， 4℃，10min)。取上清液600ul，加入氯仿异戊醇300ul，苯酚300ul，离心(12000rpm， 4℃，10min)。再取上清液600ul，加入氯仿异戊醇300ul，苯酚300ul，离心 (12000rpm，4℃，10min)。取上清加等体积氯仿异戊醇600ul，离心(12000rpm，4℃，10min)。取上清加入NaAC50ul，预冷异丙醇600ul，轻摇置于冰-20℃，过夜。
离心(12000rpm，4℃，10min)，取沉淀加1ml75％～80％乙醇，轻弹，抽提2次，离心(8000rpm，
5min)。取沉淀倒去乙醇，室温干15min.加50ul TE 缓冲液，震荡至完全溶解，-20℃备用。
离心(12000rpm，4℃，10min)，取沉淀加1ml75％～80％乙醇，轻弹，抽提2次，离心(8000rpm，
5min)。取沉淀倒去乙醇，室温干15min.加50ul TE 缓冲液，震荡至完全溶解，-20℃备用。
[0098] 2、PCR检测单孢株交配型：单孢株的模板提取参照朱衡等(1994)。扩增体系和扩增条件参照Yokoyama et al.(2004)和谭琦等(2011)的方法，并略作改进：10×Taq buffer，0.2mmol/L dNTPs，0.2μmol/L上下游引物(表2)和1.25 U Taq酶(宝生物工程有限公司，大连)，200ng DNA模板，加PCR水补齐至50μL； 94℃预变性5min，94℃变性30s，52℃退火30s，
72℃延伸45s，共计30个循环，最后72℃延伸补平10min。扩增产物用1％琼脂糖电泳检测。
72℃延伸45s，共计30个循环，最后72℃延伸补平10min。扩增产物用1％琼脂糖电泳检测。
[0099] 表2蛹虫草交配型基因的特异性引物
[0100]
[0101] 下面结合效果对本发明作进一步描述。
[0102] 本发明改变了传统的通过改变培养基配方和简单的交配型配对的菌种选育技术，本发明不仅通过营养亲和配对筛选，获得营养亲和不同基因交配型菌种，并且通过考察单交配型菌种的活性物质代谢能力，有目的的选择高活性菌种，进一步配对出草验证，该发明突破了育种工作无量化考察参数的技术瓶颈，该发明可用于蛹虫草退化菌株的复壮也可应用于高活性菌种的选育，摆脱了传统育种方式的盲目和无序性，对于蛹虫草工厂化生产稳定产量、抑制菌种退化、针对已退化菌种进行复壮、选育高活性菌种具有重要意义。
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