本发明涉及一种固氮菌肥的生产方法。特别是关于利用自生和共生固氮菌（固氮菌和根瘤菌）作为生产菌株，在带有搅拌装置的细菌培养器中，培养出高浓度的固氮菌菌液后，与草炭等吸附剂混合，并添加微量元素营养液（促进微生物固氮或根瘤形成及农作物需要的）而配制成含多种营养元素的固氮菌肥的生产方法。

据联合国粮食和农业协会报告（Skinner    KJ，1976），在1954-1974这20年内，全世界肥料消耗增加5倍，而氮肥则增加8倍，从520万吨增至4000万吨（Gasser    JKR（1982）Bhil.Trans.R.Soc.Lon.B，296，303-314），因此如何增加土壤中的含氮量成为解决农业生产的一个重要问题。

增加氮肥的工业生产与更好地利用和提高生物固氮能力，是为农业提供氮肥的两条重要途径。当今世界各国对于后一途径给予更大的重视，这是因为生物固氮具有经济、无污染等相对的优点。开发固氮生物的工作原理，人类便可掌握省力的杠杆，可以改造我们的氮肥工业，可以改造植物界的生产性能，可以倍增我们的供应。

某些微生物（如细菌，兰细菌）可以利用固氮酶来固定空气中的氮。这种酶的一个重要特性就是氧可以使之失去活性。这些微生物为合成NH3所利用的能量是：当微生物自生时，来自土壤中的碳水化合物;当微生物植物根际互生时，来自于根泌物;如果是共生关系，则直接来自于寄主植物。这种生物固氮估计每年为1.75亿公吨，相当于每年地球上固氮总量的70%。

为了节约土壤中的肥料和氮素，增加固氮部分和减少吸收部分是很重要的。可惜的是，当植物具有NO3和N2两种氮素来源时，它会优先选择NO3，因而减少固氮。

在公知技术中，固氮菌肥的制造方法多为固体固氮菌肥的制造方法，其工艺流程复杂，难于操作，亦有采用液体培养法制造固氮菌肥，但培养菌数较低，且制造的固氮菌肥多为单纯性固氮菌肥，施用效果不太理想。

本发明的目的在于提供一种工艺流程简单，操作方便，且制成含有多种营养元素的固氮菌肥的生产方法，用该方法生产的固氮菌肥使用合理搭配的微生物菌种，使之充分发挥菌种之间、菌种与作物和土壤生态环境之间的"菌类共荣效应"、"养分协调效应"、"生物固氮效应"的作用，在施用固氮菌肥后对维持土壤肥力有良好的影响。

本发明主要是通过以下措施来达到：分别制备固氮菌菌液、微量元素营养液及吸附剂，再通过按一定比例的混合、搅拌、包装工序，其特征在于：    1）生产固氮菌肥所需用的菌种主要有自生固氮的固氮菌属细菌（Azotobacter），共生固氮的根瘤菌属根瘤菌（Rhizobium）等细菌。2）在菌肥生产过程中增加了加微量元素营养液工序，使制造的固氮菌肥含有多种微量元素（能促进微生物固氮或根瘤形成，及农作物需要的）。

生产固氮菌肥所需用的菌种主要有固氮菌属的褐球固氮菌（Azotobacter    chroococcum    如ACCC    10001，10003，10007）、维涅兰德固氮菌（Azotobacter    vinelandii    Lipman如ACCC10087，10088），根瘤菌属的大豆根瘤菌（Rhizobium    japonicum    如ACCC    15005，15006，15060）、豇豆根瘤菌（Rhizobium    vigna如ACCC    14082，14074，14114）等菌（中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心，中国农业菌种目录，1991年版，中国农业科技出版社，1-6）。这些菌株可由中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物保藏中心（中国农业科学院土壤肥料研究所内）或其他有关单位获得。

褐球固氮菌（Azotobacter    chroococcum）作为固氮菌属的模式中。依B.E.布坎南和N.E.吉本斯等人描述的：细菌为大卵圆细胞，2×5微米，常 成对，周生鞭毛运动。形成孢囊和荚膜粘液。不产生水溶性的色素，但在琼脂培养基上的生长物具有特征性的非水溶性褐色素。利用淀粉、甘露醇但不利用鼠李糖。最适生长温度20-30℃，pH的生长范围5.5-8.5。DNA中的G+C含量为65-66克分子%（B.E.布坎南和N.E.吉本斯等，伯吉细菌鉴定手册（第八版）（R.E.Buchanan    and    N.E.Gibbons"Bergey’s    Manual    of    Determinative    Bacteriology"Eighth    Edition），科学出版社，1984，331）。本发明中的褐球固氮菌（Azotobacter    chroococcum）ACCC    10001，10003及10007菌株应符合以上所描述的特征。维涅兰德固氮菌（Azotobacter    vinelandii    Lipman）。依B.E.布坎南和N.E.吉本斯等人描述的：细菌为大的、卵圆形杆菌，常成对，周生鞭毛运动。形成孢囊及丰富荚膜粘液。荚膜粘液中含有葡萄糖醛酸的聚合物产生水溶性的荧光色素，在紫外光下呈绿色。不利用淀粉，而能利用甘露醇和鼠李糖。DNA中的G+C含量为66克分子%〔B.E.布坎南和N.E.吉本斯等，伯吉细菌鉴定手册（第八版）（R.E.Buchanan    and    N.E.Gibbons    "Bergey’s    Manual    of    Determinative    Bacteriology"Eighth    Edition），科学出版社，1984，331〕。本发明中的维涅兰德固氮菌（Azotobacter    vinelandii    Lipman）ACCC10087，10088菌株应符合以上所描述的特征。

根瘤菌属细菌（Rhizobium）依B.E.布坎南和N.E.吉本斯等人描述的：该属群Ⅱ的细菌，以极生或亚极生鞭毛运动。在酵母浸出液培养基上生长慢。菌落圆形，点状、不透明、很少见半透明的、白色、凸起和颗粒状组织;在酵母膏甘露醇无机盐琼脂培养基上生长5-7天的菌落直径不超过1毫米。振荡液体培养3-5天或更长的时间后、仅有中度的混浊。最适生长温度20-30℃，pH的生长范围5.5-8.5。DNA中的G+C含量为61.6-65.5克分子%（B.E.布坎南和N.E.吉本斯等，伯吉细菌鉴定手册（第八版）（R.E.Buchanan    and    N.E.Gibbons"Bergey's    Manual    of    Determinative Bacteriology"Eighth    Edition），科学出版社，1984，344-345〕。本发明中的大豆根瘤菌（Rhizobium    japonicum）    ACCC    15005，15006及15060菌株、豇豆根瘤菌（Rhizobium    vigna）ACCC    14074，14082及14114菌株应符合以上所描述的特征。

本发明所用的培养基，分为种子用的琼脂斜面培养基（种子培养基）和生产用培养基，其培养基的配方分别如下。

琼脂斜面培养基（种子培养基）配方：

葡萄糖    5克

甘油    5克

酵母片    10片

磷酸二氢钾    0.5克

硫酸镁    0.2克

氯化钠    0.1克

碳酸钙（或硫酸钙0.2克）    3克

1%钼酸铵    1毫升

1%柠檬酸铁    1毫升

1%硫酸锰    1毫升

琼脂    15～20克

水    1000毫升

pH    5.5-8.0

将酵母片10克加适量水煮沸30分钟，过滤后加水至1000毫升，再将其他原料一并加入、加热至琼脂溶化即可。将配制好的培养基分装於试管中，经120℃，30分钟高压灭菌（若采用常压灭菌，可用带蒸笼的锅灭菌，蒸1小时间隔24小时，再蒸1小时间隔24小时，再蒸1小时）灭菌后趁热将试管斜放，制成琼脂斜面培养基。

生产用培养基配方：

蔗糖    5克

甘油    5克

黄豆    100克

10%过磷酸钙（或钙镁磷肥溶液）    10毫升

琼脂    1克

10%草木灰水上清液    2毫升

水    1000毫升

pH    5.5-8.0

将黄豆100克加水500毫升煮沸1小时，过滤取汁。琼脂先加适量水加热溶化，再将其他原料加入，混合均匀即可。将配制好的培养基分装於三角瓶或生产用的培养容器中，经120℃，30分钟高压灭菌（若采用常压灭菌，可用带蒸笼的锅灭菌，蒸1小时间隔24小时，再蒸1小时间隔24小时，再蒸1小时）。

微量元素营养液的配方（克/毫升）为：氧化钴0.1-1%、氧化锆0.1-1%、硫酸钛1-5%、柠檬酸铁1-5%、硫酸锌1-10%、钼酸铵0.1-1%、硫酸高铈0.1-1%，余量为水（依据不同地区土壤微量元素的含量及所种植作物的要求可增加相应的微量元素）。

本发明的详细描述详细：

固氮菌菌液的制备：选取生产菌种（一种采用由1株固氮菌和1株根瘤菌组成一组生产菌种）将其分别接种到种子培养基中，经25-30℃培养至菌苔形成。再将种子培养物分别接种到三角瓶装生产用培养基中，经25-30℃振荡培养5-10天即为二级种子。将二级种子培养物等量混合后按1-3%的种子量接种到生产用培养液（在带搅拌装置的培养器中）经25-30℃搅拌（100-200转/分钟）培养5-10天（菌数达 30-50亿个或以上/毫升）。

吸附剂的制备：将原料草炭中的泥沙、杂物清除干净。装入高压灭菌锅中，经120℃高压30分钟消毒。

微量元素营养液的制备：按以上配方制取后经120℃，30分钟高压灭菌。

亦可将吸附剂和微量元素营养液先混合（在带搅拌装置的容器内），以每分钟250-500转的速度，搅拌5-10分钟，直至搅拌均匀，，再经120℃，30分钟高压灭菌。

固氮菌肥的配制：

加菌液工序：将消毒后的草炭放入容器内，待其温度降至35℃以下时，加入培养好的固氮菌菌液。加入量为草炭重量的10%（毫升/克）。

加微量元素营养液工序：将微量元素营养液加入已加菌液的草炭内，加入量为草炭重量的15%（毫升/克）。

搅拌工序：草炭加入菌液、营养液后（在带搅拌装置的容器内），以每分钟250-500转的速度，搅拌5-10分钟，直至搅拌均匀，即为固氮菌肥。

以上生产的固氮菌肥按需要量分装后出厂。

实施例1

琼脂斜面培养基配法：称取葡萄糖5克，甘油5克，酵母片10片，磷酸二氢钾0.5克，硫酸镁0.2克，氯化钠0.1克，碳酸钙3克（或硫酸钙0.2克），1%钼酸铵1毫升，1%柠檬酸铁1毫升，1%硫酸锰1毫升，琼脂15克（15-20克），水1000毫升。将酵母片10克加适量水煮沸30分钟，过滤后加水至1000毫升，再将其他原料一并加入、加热至琼脂溶化即可pH调整到6.0（pH范围可在5.5-8.0之间）。将配制好的培养基 分装於试管中（约占1/3），经120℃，30分钟高压灭菌（若采用常压灭菌，可用带蒸笼的锅灭菌，蒸1小时间隔24小时，再蒸1小时间隔24小时，再蒸1小时）灭菌后趁热将试管斜放，制成琼脂斜面培养基。

实施例2

生产用培养基配制：称取蔗糖0.5公斤，甘油0.5公斤，黄豆10公斤，10%过磷酸钙（或钙镁磷肥溶液）1000毫升，琼脂0.1公斤，10%草木灰水上清液200毫升，水100千毫升。将黄豆10公斤加水50千毫升煮沸1小时，过滤取汁;琼脂先加适量水加热溶化，再将其他原料加入，混合均匀调整pH至7.0（pH范围可在5.5-8.0之间）。将配制好的培养基分装於三角瓶或生产用的培养容器中，经120℃，30分钟高压灭菌（若采用常压灭菌，可用带蒸笼的锅灭菌，蒸1小时间隔24小时，再蒸1小时间隔24小时，再蒸1小时）。

实施例3

固氮菌种子培养物的制备-由中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物保藏中心（中国农业科学院土壤肥料研究所内）取得的经鉴定合格的褐球固氮菌（Azotobacter    chroococcum如ACCC    10001，10003，10007）、维涅兰德固氮菌（Azotobacter    vinelandii    Lipman如    ACCC10087，10088），根瘤菌属的大豆根瘤菌（Rhizobium    japonicum如ACCC    15005，15006，15060，）、豇豆根瘤菌（Rhizobium    vigna如ACCC    14082，14074，14114）等菌株的培养物分别划线涂布接种到琼脂斜面培养基上，经28℃（25-30℃）培养至菌苔形成而成种子培养物。一般采用由1株固氮菌和2株根瘤菌组成一组生产菌种。

二级种子培养物的制备-再将种子培养物（由1株固氮菌和1株根瘤菌组成一组生产菌种）分别接种到若干瓶三角瓶装生产用培养基（500毫升三角瓶装200毫升生产用培养基）中，经25℃振荡培养10天即为二 级种子。

固氮菌菌液的制备-将二级种子培养物等量混合后按1%的种子量接种1000毫升种子液到100千毫升生产用培养基（在装有经消毒处理的生产用培养基并带搅拌装置的培养器中）经25℃搅拌（100转/分钟）培养10天（菌数达30-50亿个/毫升）即停止培养。

实施例3

吸附剂的制备：将原料草炭中的泥沙、杂物清除干净。装入高压灭菌锅中，经120℃高压30分钟消毒。

实施例4

微量元素营养液的制备：按以下配方制取。

分别称取氧化钴750克（范围：0.1-1克/100毫升）、氧化锆750克（范围：0.1-1克/100毫升）、硫酸钛4500克（范围：1-5克/100毫升）、柠檬酸铁4500克（范围：1-5克/100毫升）、硫酸锌9000克（范围：1-10克/100毫升）、钼酸铵750克（范围：0.1-1克/100毫升）、硫酸高铈750克（范围：0.1-1克/100毫升），加到适量的水中，待完全溶解后加水补足到150千毫升（可依据不同地区土壤微量元素的含量及所种植作物的要求增加相应的微量元素）。

实施例5

固氮菌肥的配制：

加菌液工序：将消毒后的草炭750公斤放入带搅拌装置的容器内，待其温度降至35℃以下时，加入培养好的固氮菌菌液100千毫升，即按草炭重量的10%（毫升/克）加入菌液。

加微量元素营养液工序：按草炭重量的15%（毫升/克）的量，将微量元素营养液150千毫升加入已加菌液的草炭内。

搅拌工序：草炭加入菌液、营养液后（在带搅拌装置的容器内），以每分钟250-500转的速度，搅拌5-10分钟，直至搅拌均匀，即为固氮菌肥，该菌肥含固氮菌和根瘤菌3-5亿个菌/克，含杂菌数＜10个/克，不含霉菌。

以上生产的固氮菌肥按需要量分装后出厂。

实施例6

固氮菌肥的施用方法：每亩施用量为500-1000克，果树、林木为5000-10000克。拌种：先用适量清水润湿种子，然后将本肥均匀地拌和在种子上，要随拌随播。浸种：将本肥放入盛有适量清水的容器内，充分搅拌后，再将种子放入容器内，待浸好后，涝出晾干，及时播种。穴施、条施：将本肥均匀地撒入穴、条沟内和种子附近或植株的根部。蘸根：将本肥调至稀糊状，浸蘸秧苗根部，随蘸随载。施用时要及时覆土，避免阳光照射与干燥。

本肥适用于麦子、水稻、玉米、高粱、红薯、大豆、花生、芝麻、棉花、烟叶、亚麻、甘蔗、瓜果、蔬菜、果树、林木、花卉、草、药材等多种植物，适用于各种土壤。

实施例7

促进作物幼苗早发增根：水稻用本发明生产的固氮菌肥拌种后播种20天具一个分蘖的苗占80%，二个分蘖的苗占10%，无分蘖的苗占10%;百株鲜重25·8g重，干重15·0g。用本发明生产的固氮菌肥拌种的在插秧后35天，单株分蘖16·7个，单株白根16条，黄根15条，叶龄12·5叶;对照单株分蘖15·2个，单株白根7条，黄根21条，叶龄11·8叶;用本发明生产的固氮菌肥拌种的在插秧后85天，单株分蘖10个，叶龄13叶，幼苗发育4-5期，对照单株分蘖9个，叶龄12叶，幼苗发育3-4。结果表明本菌肥期促进作物幼苗早发增根的效果相当明显。

实施例8

对土壤微生物区系和养份的影响

用本发明生产的菌肥拌种处理的土壤经100天生长作物后（一个生长季），0-20cm土层中土壤微生物总数较对照土层增多1·67倍，固氮菌数量增多9·7倍（见表1）。从土壤速效养份减价的变化情况看，NO3，P2O5和K2O无明显增减（见表2），说明本发明生产的菌肥对土壤肥力的维持有良好的影响。

表1    施用本发明生产的菌肥对土壤微生物区系的影响

土壤微生物数量(×106个/克土)

总数    细菌    固氮菌

对照组    96.8±9.8    90.8±9.5    1.5±1.2

试验组    258.2±16.1    237.7±15.4    16.0±2.8

表2    施用本发明生产的菌肥对土壤养份的影响

土壤速效养份含量(mg/kg)

NO3P2O5K2O

对照组    5.0    20.0    280

试验组    5.0    21.5    300