一种灰黄青霉及其应用
阅读：574发布：2020-05-23
专利汇可以提供一种灰黄青霉及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 具体公开了一种灰黄青霉(Penicillium griseofulvum)CF3，于2016年4月15日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2016195。公开了该灰黄青霉在防除寄生性 杂草 列当属杂草中的应用，该菌可显著抑制瓜列当 种子 萌发，同时改良 土壤 中 微 生物 区系，增加土壤中细菌的总数以及细菌数量与 真菌 数量的比值，降低土壤中真菌的总数，由此抑制了寄生性杂草瓜列当的萌发和生长，同时促进了 农作物 的生长，提高了农作物的产量。，下面是一种灰黄青霉及其应用专利的具体信息内容。
一种灰黄青霉及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 列当属(Orobanche spp.)植物包括200多个种，而其中的许多种为蔬菜和作物的根寄生杂草。由于缺少叶片和叶绿体，列当完全靠从寄主吸取水分和营养物质，因此对寄主植物造成严重危害。瓜列当(Phelipanche aegyptiaca Pers.)属于列当属植物，广泛分布于欧洲南部、地中海地区、非洲北部、亚洲南部和中国等地区，可寄生于茄科、豆科、伞形科和菊科等作物上。
[0003] 由于列当对农业生产造成的危害日益严重，且列当不断蔓延侵染新的地区，因此亟待寻找能够有效防除列当的措施。目前常用的防除措施包括农艺措施(如间作和轮作)、化学防除及培育抗性品种。然而，由于列当大部分生长阶段发生在地下，在其出土前对寄主的危害已经产生，因此上述防除措施均不能有效地防除列当。此外，一株列当通常可产生数万粒种子，可在土壤中长期存活，遇到寄主就会萌发，危害极大。因此，需要寻找新的有效防除列当的措施，而生物防治是一条有希望的途径。
[0004] 微生物应用于防除植物病害的研究很早，利用拮抗微生物防除植物土传病害已有被报道。由于植物土传病害和列当均首先通过侵染植物的根系进而在地下对植物造成危害，因此具有防除植物土传病害的微生物也可能具有防除列当的潜能。前期试验结果表明，拮抗真菌灰黄青霉具有抑制多种植物土传病害病原真菌的功能，对土传根系病害有良好防效，但目前尚无灰黄青霉具有防除列当功能的报道。
发明内容
[0005] 针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种灰黄青霉及其应用，该灰黄青霉可用于防除寄生杂草列当，为列当的防除提供新的有效的途径。
[0006] 为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现。
[0007] (一)一种灰黄青霉，具体为灰黄青霉(Penicillium griseofulvum)CF3，于2016年4月15日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO: M 2016195；保藏单位地址为中国.武汉.武汉大学，邮编430072。
[0008] 所述灰黄青霉的rDNA-ITS序列如SEQ ID No.1所示。
[0009] (二)灰黄青霉在防除寄生性杂草中的应用。
[0010] (三)灰黄青霉在防除列当属杂草中的应用。
[0011] (四)灰黄青霉在防除瓜列当中的应用。
[0012] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0013] 本发明提供的灰黄青霉显著抑制了瓜列当种子的萌发，同时改良了土壤中微生物区系，增加了土壤中细菌的总数以及细菌数量与真菌数量的比值，降低了土壤中真菌的总数，抑制了寄生性杂草瓜列当的萌发和生长，同时促进了农作物的生长，提高了农作物的产量。附图说明
[0014] 下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。
[0015] 图1为灰黄青霉的菌落形态图；其中，A1图为灰黄青霉在查氏琼脂培养基中的菌落正面形态图；A2图为灰黄青霉在查氏琼脂培养基中的菌落背面形态图；A3图为灰黄青霉在查氏酵母膏琼脂培养基中的菌落正面形态图；A4图为灰黄青霉在查氏酵母膏琼脂培养基中的菌落背面形态图；A5、A6图为分生孢子形态图；
[0016] 图2为灰黄青霉对瓜列当寄生的影响结果图；图中数据为3次重复值的平均值±SD。图中不同小写字母表示表示处理间数值经LSD检验并经Bonferroni校正差异显著(P<0.05)；
[0017] 图3为灰黄青霉对列当总干重和单株列当干重的影响结果图；图中数据为3次重复值的平均值±SD。图中不同小写字母表示表示处理间数值经LSD检验并经Bonferroni校正差异显著(P<0.05)。
具体实施方式
[0018] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域的技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。
[0019] 本发明提供了一种灰黄青霉，具体为灰黄青霉(Penicillium griseofulvum)CF3，于2016年4月15日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO: M 2016195，保藏单位地址为中国.武汉.武汉大学，邮编430072。
[0020] 灰黄青霉CF3的rDNA-ITS序列如SEQ ID No.1所示，具体如下：
[0021]
[0022] 菌落形态：由图1可以看出，在查氏琼脂培养基(Czapek′s agar，CZA)上25℃培养12d，CF3菌落正面(A1图)中心脐状突起，有细微同心环纹，质地绒状，分生孢子面呈灰蓝色，边缘呈白色，有少量黄褐色渗出液；菌落背面呈橘黄色(A2图)。CF3在查氏酵母膏琼脂培养基(Czapek yeast extract agar，CYA)上25℃培养7d后，菌落正面(A3图)有少量放射状皱纹，质地绒状，中心面轻微絮状，分生孢子面灰绿色，边缘白色，有淡黄色液珠形成；菌落背面黄褐色(A4图)。分生孢子梗垂直生于基丝，长20～40μm，有3～5个小梗，顶端生排列呈帚状分枝，分生孢子呈不分支链状(A5图)，分生孢子近球形或椭圆形，无色或绿色，直径2.5～
3.0μm(A6图)。
3.0μm(A6图)。
[0023] 本实施例所用的试验材料及其对试验材料的处理如下：
[0024] (1)灰黄青霉
[0025] 本实施例的灰黄青霉(Penicillium griseofulvum)CF3分离自中国西北特殊生境土壤中，由西北农林科技大学分离筛选提供。
[0026] (2)瓜列当
[0027] 瓜类当种子于2011年采集于中国新疆维吾尔自治区库尔勒市巴音郭楞蒙古自治州焉耆县受瓜列当侵染的西红柿田中。
[0028] (3)GR24
[0029] 一种人工合成的寄生植物种子萌发刺激物，由澳大利亚悉尼大学提供。
[0030] (4)西红柿种子
[0031] 盆栽试验中所用西红柿品种为“白果强丰”(产自天津蓟县蓟农种子站)。大田试验中所用西红柿品种为屯河737(由中粮屯河种业有限公司提供)。上述两个西红柿品种均为瓜列当的易感品种。
[0032] (5)瓜列当种子的表面消毒
[0033] 瓜列当钟子先后浸没于1.0％(w/v)的次氯酸钠溶液和75％的乙醇中分别超声处理3min，之后用无菌水冲洗干净后自然晾干。首先将直径为8mm的玻璃纤维滤纸摆放于事先放有2层湿润滤纸的直径为9cm的培养皿中，随后将已经风干的列当种子均匀撒于玻璃纤维滤纸片上，每个滤纸片上30-60粒种子。将上述培养皿封口后置于25℃的黑暗环境下培养4天待用。
[0034] 实施例1
[0036] 1、试验方法：
[0037] (1)灰黄青霉发酵液的制备
[0038] 灰黄青霉的发酵液采用公知的液态摇床培养的方式进行，原液(每毫升发酵液含3.5mg干菌丝)分别稀释10、102、103、104倍后备用。以不接种灰黄青霉的高氏1号液态培养基和PDA液态培养基分别作为对照，重复3次。
[0039] (2)种子萌发试验
[0040] 首先将直径为8mm的玻璃纤维滤纸片摆放于新的培养皿中，之后将20μL发酵液，1片已经预培养好的瓜列当种子片和20μL GR24(0.1mg L-1)依次加于玻璃纤维滤纸片上。添-1加无菌水和GR24(0.1mg L )代替发酵液的处理用于检测瓜列当种子仅在萌发刺激物的诱导下才能够萌发。随后将培养皿置于25℃黑暗环境下培养10天后，用解剖显微镜统计每片玻璃纤维滤纸上萌发的和总的列当种子数目。列当种子的发芽管伸出种皮即视为萌发。瓜列当种子萌发率(GR)按照公式(1)计算，瓜列当种子萌发率较对照降低的百分率(PR)按照公式(2)计算：
[0041] GR＝GN/TN×100％ (1)
[0042] GR：萌发率；GN：萌发瓜列当种子数；TN：瓜列当种子总数
[0043] PR＝(GF–GC)/GC×100％ (2)
[0044] PR：瓜列当种子萌发率较对照的降低率；GF：发酵液处理的瓜列当种子萌发率；GC：对照中瓜列当种子萌发率。
[0045] 2、试验结果：
[0046] 灰黄青霉发酵液抑制瓜列当种子萌发的试验结果见表1。无菌水和GR24分别可以诱导0.0％和86.6％的瓜列当种子萌发。灰黄青霉发酵液原液完全抑制了瓜列当的萌发，对瓜列当种子的萌发率有明显的抑制作用，而随着稀释倍数的增大，灰黄青霉对瓜列当种子的萌发率的抑制作用有明显降低。
[0047] 表1 灰黄青霉发酵液对瓜列当种子萌发的抑制结果
[0048]
[0049] 注：GLa,不加琼脂的高氏1号培养基。表中数据为3次重复值的平均值±SD。同行数据后不同小写字母表示处理与对照间数值经LSD检验并经Bonferroni校正差异显著(P<0.05)。
[0050] 实施例2
[0051] 灰黄青霉菌体甲醇浸提液对瓜列当种子萌发的抑制
[0052] 1、试验方法
[0053] (1)灰黄青霉菌体甲醇浸提液的制备
[0054] 称取0.050g灰黄青霉菌体置于1.5mL离心管中，随后加入1mL甲醇，超声处理30min后6000r min-1离心2min。上清液视为原液，稀释10和100倍后备用，3次重复。
[0055] (2)种子萌发试验
[0056] 按照上述发酵液抑制瓜列当种子萌发的试验方法进行，将发酵液替换为菌体甲醇浸提液即可，试验重复3次。
[0057] 2、试验结果
[0058] 灰黄青霉菌体甲醇浸提液抑制瓜列当种子萌发试验结果见表2。灰黄青霉的50.0mg/mL的菌体甲醇浸提液可抑制51.7％的瓜列当萌发，稀释至5.0mg/mL后，抑制率降至
10.4％，但仍具有抑制效果；当稀释至0.5mg/mL，已不能显著抑制瓜列当种子的萌发。
10.4％，但仍具有抑制效果；当稀释至0.5mg/mL，已不能显著抑制瓜列当种子的萌发。
[0059] 表2 灰黄青霉体甲醇浸提液对瓜列当种子萌发的抑制结果
[0060]
[0061] 注：表中数据为3次重复值的平均值±SD。同行数据后不同小写字母表示处理与对照间数值经LSD检验并经Bonferroni校正差异显著(P<0.05)。
[0062] 实施例3
[0063] 盆栽试验
[0064] 1、试验方法：
[0065] 盆栽试验于2014年5月至9月在中国宁夏回族自治区西北农林科技大学水土保持研究所固原生态试验站进行。
[0066] 根据室内试验结果，灰黄青霉被用于盆栽试验，以菌剂的形式接种于土壤中。灰黄青霉菌剂按照Xue等的2013年外文文献《Isolation and evaluation of rhizosphere actinomycetes with potential application for biocontrol of Verticillium wilt of cotton》的方法制备，菌剂中活孢子数目为1011g-1。盆栽所用土壤为黑垆土，首先将土壤与细沙按体积比1:1混匀，之后加入尿素(20mg kg-1)、过磷酸钙(50mg kg-1)、瓜列当种子(3.4mg kg-1)和灰黄青霉菌剂(1g kg-1)后充分混匀。分别称取8kg上述混合物加入高25cm、直径为20cm的塑料盆中。不加灰黄青霉菌剂的处理为对照，每个处理6盆重复。
[0067] 将西红柿种子播种于装有蛭石的穴盘后于25℃培养间内培养(光照：黑暗为12h:12h)并按需浇水。待西红柿出苗后，拔掉多余幼苗，使每个穴盘孔内保留一株西红柿幼苗。
至10cm高时，将西红柿幼苗拔出移栽到装有上述混合物的塑料盆中(每盆1株)并按需浇水和除草。
至10cm高时，将西红柿幼苗拔出移栽到装有上述混合物的塑料盆中(每盆1株)并按需浇水和除草。
[0068] 在快速生长期(移苗后70天)将各处理中的3盆打开采样，其余3盆于收获期打开(移苗后130天)。在两次采样时分别统计列当的出土数、总数，称量寄生列当的干重；测量西红柿的株高，称量西红柿地上部干重及产量。此外，根据公式(3)和(4)分别计算列当出土率(ER)及单株列当干重。
[0069] EA＝EN/AN×100％ (3)
[0070] EA：列当出土率；EN：出土列当数；AN：寄生列当总数
[0071] DWS＝DWA/AN (4)
[0072] DWS：单株列当干重；DWA列当总重；AN：寄生列当总数
[0073] 两次采样时，采用梯度稀释培养法分离西红柿根系土壤中高氏1号培养基，并统计灰黄青霉的总数并计算放线菌与真菌(A/F)、细菌与真菌(B/F)之间总数之比以及CF3在根区土壤中的定殖率。此外，还对各采样时期瓜列当各指标与西红柿根区土壤中微生物各指标之间的相关性进行计算。各指标与对照相比的增加率按照公式(5)计算：
[0074] IR＝(T-C)/C×100％ (5)
[0075] IR：处理数值与对照相比的增率；T：处理中的数值；C：对照中的数值[0076] 2、试验结果
[0077] 灰黄青霉对瓜列当寄生的影响结果如图2所示。由图2可知，施加灰黄青霉菌剂在收获期显著降低了瓜列当的出土数量，较对照组减少了76.2％；然而，灰黄青霉菌剂在两次采样时期均未显著降低瓜列当的寄生总数；此外，灰黄青霉还使瓜列当的出土率较对照组降低了85.3％。
[0078] 灰黄青霉对列当总干重和单株列当干重的影响结果如图3所示，由图可知，施加灰黄青霉菌剂在收获期对对瓜列当的总干重无显著影响，在快速生长期使单株瓜列当的干重较对照组降低了83.3％。
[0079] 灰黄青霉对西红柿在收获期生长及产量的影响见表3，由表3可知，施加灰黄青霉后，西红柿在收获期的产量为每盆346.8g，较对照组提高了51.6％；西红柿的株高较对照组增加了27.6％，但对西红柿茎叶干重无显著影响。
[0080] 表3 灰黄青霉对西红柿在收获期的生长及产量的影响
[0081]
[0082] 注：表中数据为3重复值的平均值±SD。同行数据后不同小写字母表示处理与对照间数值经LSD检验并经Bonferroni校正差异显著(P<0.05)。
[0083] 根区是植物和微生物相互作用十分强烈的区域。根区土壤中微生物的数量和种类能够反映植物的健康状态。灰黄青霉对西红柿根区土壤中微生物区系的影响见表4，由表4可知，在西红柿的快速生长期，灰黄青霉使土壤中的放线菌和细菌的数量较对照组分别增加了126.3％和142.4％，同时，在西红柿的快速生长期，灰黄青霉还显著增加了土壤中真菌的数量，增率为120.3％；在收获期，灰黄青霉显著增加了放线菌与真菌数量的比例(A/F)，较对照组增加了196.4％，同时使真菌的总数较对照组降低了54.2％。此外，灰黄青霉在快速生长期和收获期在西红柿根区土壤中的定殖率分别为54.2％和46.3％。
[0084] 表4 灰黄青霉对西红柿根区土壤中微生物区系的影响
[0085]
[0086] 注：A/Fa，放线菌数量与真菌数量的比值；B/Fb，细菌数量与真菌数量的比值。表中数据为3重复值的平均值±SD。同行数据后不同小写字母表示处理与对照间数值经LSD检验并经Bonferroni校正差异显著(P<0.05)。
[0087] 表5 瓜列当各指标与土壤中微生物各指标之间线性相关R值分布表[0088]
[0089] 注：A/Fa，放线菌数量与真菌数量的比值；B/Fb，细菌数量与真菌数量的比值。*、**和***分别表示P<0.05，P<0.01和P<0.001。
[0090] 瓜列当各指标与土壤中微生物各指标之间的线性相关R值分布见表5。由表可知，在收获期，瓜列当出土数和出土率与西红柿根区土壤中真菌总数呈显著正相关关系，R值分别为0.75(P<0.01)和0.59(P<0.05)；而与A/F(P<0.05)和B/F(P<0.001)呈显著负相关关系。瓜列当的总干重和单株干重与西红柿根系土壤中细菌的数量呈显著负相关关系，R值分别为-0.70(P<0.01)和-0.67(P<0.05)。此外，单株瓜列当干重还与西红柿根区土壤中B/F呈负相关关系(R＝-0.77,P<0.01)。然而，瓜列当各指标与西红柿根区土壤中微生物指标在快速生长期均无显著相关关系。上述实验结果表明，灰黄青霉在实验室条件下可显著抑制瓜列当的萌发；在盆栽试验中，可显著降低瓜列当的出土数同时促进西红柿的生长。
[0091] 盆栽试验结果表明，收获期西红柿根区土壤中细菌的总数及B/F的比值与瓜列当出土数量、出土率及生物量均成负相关关系；相反，收获期真菌的总数与瓜列当的出土数及出土率呈正相关关系，上述结果表明增加土壤中细菌的总数及B/F的比例，降低土壤中真菌的总数有助于防除瓜列当，这就表明改良土壤中微生物区系是灰黄青霉防除瓜列当的机制之一。
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