一种新型邻苯二甲酸酯水解酶EstJ6及其编码基因与应用
阅读：656发布：2020-05-12
专利汇可以提供一种新型邻苯二甲酸酯水解酶EstJ6及其编码基因与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种来源于 土壤 宏基因组文库的新型邻苯二 甲酸 酯 水 解 酶基因，其核苷酸序列和 氨 基酸序列如SEQ ID NO.l和SEQ ID N0.2所示。将该酯酶基因连接到表达载体pET28a(+)后，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中实现异源表达。纯化后的重组酶(EstJ6)分子量为33.31kDa。EstJ6对邻苯二甲酸酯具有广泛的底物特异性，EstJ6不仅可以水解具有简单 侧链 的邻苯二甲酸酯，而且可以水解具有复杂且较长侧链的邻苯二甲酸二乙基己酯和邻苯二甲酸单乙基己酯。此外，定点突变实验表明EstJ6的催化三联体残基为S146-E240-H270，三者中任何氨基酸的突变都会导致EstJ6失去催化能 力 。本发明中的新型邻苯二甲酸酯水解酶，由于其特有的活性及酶学特性，使其可应用于食品工业、农业及 生物 技术等领域。，下面是一种新型邻苯二甲酸酯水解酶EstJ6及其编码基因与应用专利的具体信息内容。
1.一种新型邻苯二甲酸酯水解酶EstJ6，其特征在于，所述邻苯二甲酸酯水解酶EstJ6的氨基酸序列如SEQID No.2所示。
2.根据权利要求1所述的邻苯二甲酸酯水解酶EstJ6，其特征在于，所述邻苯二甲酸酯水解酶EstJ6的催化三联体残基为丝氨酸(S146)-谷氨酸(E240)-组氨酸(H270)。
3.编码权利要求1所述新型邻苯二甲酸酯水解酶EstJ6的基因estj6，其特征在于，所述基因estj6的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
4.权利要求3所述编码新型邻苯二甲酸酯水解酶EstJ6的基因estj6的宏基因组学筛选方法，其特征在于，所述宏基因组学筛选方法包括以下步骤：利用功能筛选法及亚克隆策略获得编码邻苯二甲酸酯水解酶的基因estj6。
5.根据权利要求4所述的宏基因组学筛选方法，其特征在于，所述宏基因组学筛选方法具体步骤为：
(1)利用底物平板筛选阳性克隆子；
(2)HPLC验证其邻苯二甲酸酯水解酶的活性；
(3)提取阳性克隆子质粒DNA，利用Sau3AI进行部分酶切，连接至载体pUC118并转化至大肠杆菌E.coli DH5a；
(4)使用相同的底物平板筛选阳性亚克隆，经测序和Blast比较，从而筛选获得编码邻苯二甲酸酯水解酶的基因estj6。
6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求3所述的基因estj6；
优选的，所述表达载体是将权利要求3所述新型邻苯二甲酸酯水解酶EstJ6的基因estj6克隆到pET28a(+)中所得。
7.含有权利要求6所述表达载体的重组微生物；
优选的，所述重组微生物以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主细胞。
8.一种重组邻苯二甲酸酯水解酶EstJ6的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：制备权利要求6所述的表达载体，用所述表达载体转化宿主细胞，培养转化体，从培养物中分离得到所述重组邻苯二甲酸酯水解酶EstJ6。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，具体步骤为：将权利要求3所述基因estj6进行PCR扩增，扩增产物经NcoI和HindIII双酶切，与pET28a(+)载体连接，得到pET28a(+)-etsj6表达载体，将该表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，培养转化体，经IPTG诱导，从培养物中分离纯化，获得重组邻苯二甲酸酯水解酶EstJ6；
优选的，用于PCR扩增基因estj6的特异性扩增引物为：
上游引物：5’-CATGCCATGGGCATGGCAAGTCCGCAACTA-3’(SEQ ID No.3)；
下游引物：5’-CCCAAGCTTCGCGGTGATCTGCCGGAC-3’(SEQ ID No.4)。
10.用于特异性扩增权利要求3所述基因estj6的特异性扩增引物，其特征在于，包括以下两条引物序列：
上游引物：5’-CATGCCATGGGCATGGCAAGTCCGCAACTA-3’(SEQ ID No.3)；
下游引物：5’-CCCAAGCTTCGCGGTGATCTGCCGGAC-3’(SEQ ID No.4)。
11.权利要求1所述的新型邻苯二甲酸酯水解酶EstJ6，或
权利要求3所述编码新型邻苯二甲酸酯水解酶EstJ6的基因estj6，或
权利要求6所述表达载体，或
权利要求7所述重组微生物，或
权利要求8或权利要求9所述重组邻苯二甲酸酯水解酶EstJ6的制备方法，或权利要求10所述用于特异性扩增基因estj6的引物在水解邻苯二甲酸酯类化合物中的应用；
优选的，所述邻苯二甲酸酯类化合物为具有C1-C9链的邻苯二甲酸二酯类化合物；
进一步优选的，所述邻苯二甲酸酯类化合物选自邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二戊酯、邻苯二甲酸二丙酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二己酯、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙基己酯、邻苯二甲酸单甲酯，邻苯二甲酸单乙酯，邻苯二甲酸单丁酯，邻苯二甲酸单己酯和邻苯二甲酸单乙基己基酯。
一种新型邻苯二甲酸酯水解酶EstJ6及其编码基因与应用
技术领域
背景技术
[0002] 邻苯二甲酸酯(PAEs)是一类有毒有机化合物，因其在塑料制造中被广泛用作添加剂或增塑剂而在环境中无处不在。其中六种(邻苯二甲酸二甲酯(DMP)，邻苯二甲酸二乙酯(DEP)，邻苯二甲酸二丁酯(DBP)，邻苯二甲酸二辛酯(DNOP)，邻苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)和邻苯二甲酸丁基苄酯(BBP))已经被美国环境保护局及其一些国际同行列为优先污染物。其中，DEHP在环境中占有很高的比例(约31％)。由于PAEs的大量使用导致严重的环境问题和多种疾病，包括呼吸系统疾病，儿童肥胖和神经心理障碍等。
[0003] 随着人们对PAEs潜在危害的全面认识，消除PAEs已引起广泛的关注。PAEs的微生物降解是目前最常用的方法，虽然已经分离和鉴定了许多降解PAEs的微生物，例如Enterobacter sp.，Agrobacterium sp.及Pleurotus ostreatus。然而，在这些微生物中具有DEHP降解活性的酶仍然未知。因此，寻找有效的新型邻苯二甲酸酯降解酶是非常关键的，特别是对DEHP的降解。
[0004] 研究表明，通过传统的培养技术发现新型酯酶的效率非常低，因为在现有实验条件下仅有极少数的微生物可被培养，超过99％的微生物都是不可培养的，极大限制了新型酶的开发与利用。宏基因组学作为一种不依赖于培养的技术，可以避免天然的缺陷，被认为是用于获取和研究微生物资源的最好方法之一。通过直接提取环境中可培养和不可培养微生物的所有DNA，构建宏基因组文库用于筛选新型酶，大大扩展了微生物资源的利用空间，是研究和开发不可培养微生物的有效方法。基于功能筛选的宏基因组策略已经成功应用于新型酶的发现，如阿魏酸酯酶、木聚糖酶和蛋白酶等，这些酶具有增强的酶学特性。
[0005] 本研究通过功能筛选从土壤宏基因组文库中分离出一种新的邻苯二甲酸酯水解酶基因estj6，对该基因进行异源表达，并对重组酶EstJ6进行纯化、酶学表征、同源建模及定点诱变。EstJ6将成为生物质降解和环境保护的有趣候选者，这说明了宏基因组策略在农业、食品工业和生物技术应用中开发新型酶基因的优势。
发明内容
[0006] 本发明从土壤宏基因组文库中筛选到一种新型邻苯二甲酸酯水解酶基因，并对该基因进行了异源表达，纯化后的重组酶(EstJ6)分子量大小为33.31kDa。系统发育分析表明EstJ6是第IV家族的新成员。生化表征表明，EstJ6在40℃和pH7.5下对DBP表现出最高的活性(128U/mg)。EstJ6对(C1-C9)邻苯二甲酸酯类化合物具有广泛的底物特异性，EstJ6不仅可以水解具有简单侧链的邻苯二甲酸酯，而且可以降解具有复杂且较长侧链的邻苯二甲酸二乙基己酯和邻苯二甲酸单乙基己酯。定点突变实验表明，EstJ6推定的催化三联体残基为S146-E240-H270。
[0007] 本发明的第一个目的在于提供一种新型邻苯二甲酸酯水解酶。
[0008] 本发明的第二个目的在于提供编码上述新型邻苯二甲酸酯水解酶基因。
[0009] 本发明的第三个目的在于提供上述基因的宏基因组学筛选方法。
[0010] 本发明的第四个目的在于提供含有上述新型邻苯二甲酸酯水解酶基因的表达载体。
[0011] 本发明的第五个目的在于提供含有上述表达载体的重组微生物。
[0012] 本发明的第六个目的在于提供一种重组邻苯二甲酸酯水解酶的制备方法。
[0013] 本发明的第七个目的在于提供用于新型邻苯二甲酸酯水解酶的基因的特异性扩增引物。
[0014] 本发明的第八个目的在于提供用于突变新型邻苯二甲酸酯水解酶关键氨基酸残基的引物。
[0015] 本发明的第九个目的在于提供上述的新型邻苯二甲酸酯水解酶EstJ6，或上述编码新型邻苯二甲酸酯水解酶EstJ6的基因estj6，或上述表达载体，或含有上述表达载体的重组微生物，或上述重组邻苯二甲酸酯水解酶EstJ6的制备方法，或上述基因estj6的特异性扩增的引物在降解邻苯二甲酸酯类化合物中的应用。
[0016] 本发明采取的技术方案如下：
[0017] 一种新型邻苯二甲酸酯水解酶EstJ6，所述邻苯二甲酸酯水解酶EstJ6的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示：
[0018] MASPQLQMALDAFKTMGEKMAQAGNDVKALRAVMEEMSGFPSAGETKCTPVNAGGVPAEWISGPGAADDRVILYVHGGGYVMGSIATHRETVARLSKASGARGLALDYRLAPEHPFPAAVDDATAAYRWLLSQNIKPAHIVIAGDSAGGGLTLATLIALRDAKVPLPAAGVCISPWTDMEGAGESMTTRAKADPVVQKQGLLGMAQLYLGGKDPKSPLAAPLHANLAGLPPLLIQVGDAETLLDDSIRVAEKAKKAGVKVDLEVWPEMPHVWHLFAPFLPEGQQAIDKIGKYVRQITA。
[0019] 进一步的，对所述的邻苯二甲酸酯水解酶EstJ6的关键氨基酸进行定点突变并对其进行活性验证，从而推定，所述邻苯二甲酸酯水解酶EstJ6的催化三联体残基为丝氨酸(S146)-谷氨酸(E240)-组氨酸(H270)。
[0020] 编码上述新型邻苯二甲酸酯水解酶EstJ6的基因estj6，所述基因estj6的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示：
[0021] ATGGCAAGTCCGCAACTACAGATGGCCCTTGATGCGTTCAAGACGATGGGCGAGAAAATGGCGCAGGCGGGAAATGACGTGAAAGCCTTGCGCGCTGTCATGGAAGAGATGTCTGGCTTTCCCTCAGCAGGGGAGACGAAGTGTACGCCGGTAAATGCTGGCGGCGTTCCTGCCGAATGGATTTCCGGTCCTGGTGCCGCGGATGATCGCGTGATCCTGTACGTACACGGCGGTGGCTATGTGATGGGTTCTATCGCTACTCACCGCGAGACGGTTGCTCGTCTGTCGAAAGCCTCGGGAGCGCGTGGTCTGGCGTTAGATTACCGCCTGGCCCCGGAGCATCCATTCCCCGCCGCGGTTGATGACGCGACGGCAGCGTATCGCTGGCTGCTCTCGCAAAATATTAAACCTGCCCACATTGTCATTGCCGGTGACTCTGCGGGCGGAGGGCTTACGCTGGCGACTCTCATCGCGTTACGGGACGCGAAGGTTCCCCTTCCCGCCGCGGGTGTGTGTATTTCACCGTGGACGGACATGGAAGGGGCTGGGGAGTCAATGACGACCAGGGCGAAGGCCGATCCCGTCGTGCAAAAGCAAGGACTGCTGGGTATGGCACAGCTCTACCTCGGCGGCAAAGATCCGAAGTCGCCGCTCGCCGCTCCACTGCACGCCAATCTCGCGGGACTCCCGCCGCTCTTGATTCAAGTGGGAGACGCCGAGACCTTGCTCGACGACTCCATTCGTGTTGCCGAAAAAGCCAAGAAAGCGGGCGTCAAAGTCGATCTCGAGGTTTGGCCGGAGATGCCCCACGTGTGGCACCTGTTCGCCCCGTTCCTGCCGGAAGGCCAGCAAGCGATCGACAAGATCGGGAAGTACGTCCGGCAGATCACCGCGTAA。
[0022] 上述编码新型邻苯二甲酸酯水解酶EstJ6的基因estj6的宏基因组学筛选方法，所述宏基因组学筛选方法包括以下步骤：利用功能筛选法及亚克隆策略获得编码邻苯二甲酸酯水解酶的基因estj6。
[0023] 进一步的，所述宏基因组学筛选方法具体步骤为，
[0024] (1)利用底物平板筛选阳性克隆子；
[0025] (2)高效液相色谱法(HPLC)验证其邻苯二甲酸酯水解酶的活性；
[0026] (3)提取阳性克隆子质粒DNA，利用Sau3AI进行部分酶切，连接至载体pUC118并转化至大肠杆菌E.coli DH5a；
[0027] (4)使用相同的底物平板筛选阳性亚克隆，经测序和Blast比较，从而筛选获得编码邻苯二甲酸酯水解酶的基因estj6。
[0028] 更进一步的，所述编码邻苯二甲酸酯水解酶的基因的宏基因组学筛选方法：
[0029] (1)利用底物平板筛选阳性克隆子：在培养基中加入过膜后的终浓度为1mM邻苯二甲酸二丁酯(DBP)作为筛选底物。将复制的文库进行适当稀释涂布，经培养后，观察筛选平板上是否出现相应的透明圈，并挑取能够产生透明圈的克隆子，即为筛选出的阳性克隆子。
[0030] (2)HPLC验证其邻苯二甲酸酯水解酶的酶活性：将其接种于含有0.1mM DBP的LB液体培养基中过夜摇菌，取部分发酵液用等体积正己烷萃取并用甲醇重溶后进行HPLC分析。通过DBP的残留量来判断克隆子是否具有邻苯二甲酸酯降解的酶活性。
[0032] (4)使用相同的底物筛选平板筛选阳性克隆。测定阳性亚克隆序列，获得邻苯二甲酸酯水解酶编码基因estj6。
[0033] 一种表达载体，所述表达载体含有编码上述新型邻苯二甲酸酯水解酶的基因estj6。
[0034] 进一步的，所述表达载体是将上述新型邻苯二甲酸酯水解酶EstJ6的基因estj6克隆到pET28a(+)中所得。
[0035] 含有上述表达载体的重组微生物；
[0036] 进一步的，所述重组微生物以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主细胞。
[0037] 一种重组邻苯二甲酸酯水解酶EstJ6的制备方法，包括以下步骤：制备上述的表达载体，用所述表达载体转化宿主细胞，培养转化体，从培养物中分离得到所述重组邻苯二甲酸酯水解酶EstJ6。
[0038] 进一步的，具体步骤为，利用引物：
[0039] 上游引物：5’-CATGCCATGGGCATGGCAAGTCCGCAACTA-3’(SEQ ID No.3)；和[0040] 下游引物：5’-CCCAAGCTTCGCGGTGATCTGCCGGAC-3’(SEQ ID No.4)扩增基因estj6，上下游引物下划线处分别表示NcoI和HindIII的酶切位点。将上述基因estj6的PCR扩增产物经NcoI和HindIII双酶切，连接至相同酶切的pET28a(+)载体中，得到pET28a(+)-etsj6连接产物，即上述表达载体，将该表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，培养转化体，经IPTG诱导，从培养物中分离纯化，获得重组邻苯二甲酸酯水解酶EstJ6；
[0041] 用于特异性扩增上述编码新型邻苯二甲酸酯水解酶的基因estj6的特异性扩增引物，包括以下两条引物序列：
[0042] 上游引物：5’-CATGCCATGGGCATGGCAAGTCCGCAACTA-3’(SEQ ID No.3)；
[0043] 下游引物：5’-CCCAAGCTTCGCGGTGATCTGCCGGAC-3’(SEQ ID No.4)。
[0044] 上述的新型邻苯二甲酸酯水解酶EstJ6，或
[0045] 上述编码新型邻苯二甲酸酯水解酶EstJ6的基因estj6，或
[0046] 上述含有编码新型邻苯二甲酸酯水解酶的基因estj6的表达载体，或
[0047] 含有上述表达载体的重组微生物，或
[0048] 上述重组邻苯二甲酸酯水解酶EstJ6的制备方法，或
[0049] 上述用于特异性扩增基因estj6的特异性扩增的引物在水解邻苯二甲酸酯类化合物中的应用；
[0050] 优选的，所述邻苯二甲酸酯类化合物为具有C1-C9链的邻苯二甲酸二酯类化合物；
[0051] 进一步优选的，所述邻苯二甲酸酯类化合物选自邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二戊酯(DPP)、邻苯二甲酸二丙酯(DPRP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二己酯(DHP)、邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)、邻苯二甲酸单甲酯(MMP)，邻苯二甲酸单乙酯(MEP)，邻苯二甲酸单丁酯(MBP)，邻苯二甲酸单己酯(MHP)和邻苯二甲酸单乙基己基酯(MEHP)中的任意一种。
[0052] 所述重组邻苯二甲酸酯水解酶的酶学性质表征：
[0053] 将异源表达所获得的重组酶纯化后，进行酶催化动力学分析，包括Km，Vmax，Kcat，Kcat/Km值的测定，及常规酶学性质的表征，包括底物特异性、最适温度及热稳定性、最适pH、不同金属离子、有机溶剂及表面活性剂的影响等。
[0054] 本发明的有益效果在于：
[0055] 本发明通过直接提取环境中可培养和不可培养微生物的所有DNA，构建宏基因组文库用于筛选新型酶，大大扩展了微生物资源的利用空间，提供了一种来源于土壤宏基因组文库的新型邻苯二甲酸酯水解酶基因estj6，其核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.l和SEQ ID NO.2所示。将该基因在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达，纯化后的重组酶(EstJ6)分子量大小为33.31kDa。EstJ6在40℃和pH 7.5下对邻苯二甲酸二丁酯表现出最高的活性(128U/mg)。EstJ6对(C1-C9)邻苯二甲酸酯类化合物具有广泛的底物特异性，EstJ6不仅可以水解具有简单侧链的邻苯二甲酸酯，而且可以降解具有复杂且较长侧链的邻苯二甲酸二乙基己酯和邻苯二甲酸单乙基己酯。定点突变实验表明EstJ6推定的催化三联体残基为S146-E240-H270。本发明提供的新型邻苯二甲酸酯水解酶EstJ6和其基因estj6为生物质降解和环境保护提供新的有效手段。附图说明
[0056] 图1.实施例1中邻苯二甲酸酯水解酶活性克隆子初筛。
[0057] 图2.实施例1中克隆子发酵液高效液相色谱图。
[0058] a：不含目的基因的对照组；b：实验组。
[0059] 图3.实施例3中SDS-PAGE检测纯化后的邻苯二甲酸酯水解酯酶EstJ6图谱
[0060] M：蛋白Marker；1：空载对照；2：粗酶液；3：5ug纯化后的酶EstJ6。
[0061] 图4.实施例4中邻苯二甲酸酯水解酶酶学表征的雷达图。
[0062] a：温度对EstJ6活性的影响；b：EstJ6的热稳定性；c：pH对EstJ6活性的影响；d：EstJ6的底物特异性；e：有机溶剂对EstJ6活性的影响；f：金属离子对EstJ6活性的影响；g：
表面活性剂对对EstJ6活性的影响。
表面活性剂对对EstJ6活性的影响。
[0063] 图5.实施例4邻苯二甲酸酯水解酶EstJ6对DEHP的降解途径推测。
[0064] a：DEHP及其降解产物(MEHP和PA)的总离子流色谱图；
[0065] b-d：DEHP及其降解产物(MEHP和PA)的质谱图；
[0066] e：EstJ6对DEHP降解的推定途径。
[0067] 图6.实施例4中邻苯二甲酸酯水解酶EstJ6的系统发育树。
[0068] 图7.实施例4中邻苯二甲酸酯水解酶EstJ6与相似蛋白质的氨基酸序列比对。其中保守基序用矩形框标注，保守氨基酸残基用圆圈标注，假定的催化三联体残基用实心圆圈标注。
[0069] 图8.实施例5中邻苯二甲酸酯水解酶EstJ6的同源建模。
具体实施方式
[0070] 以下结合具体实施例，进一步阐述本发明的操作方法。但是这些实施例仅用于详细说明本发明，而不是对本发明的限制。
[0071] 实施例1:土壤宏基因组文库中邻苯二甲酸酯水解酶基因的筛选
[0072] 1.底物平板法初筛阳性克隆子
[0073] 制备初筛筛选培养基，LB固体培养基高温高压灭菌后，待其冷却到适当温度(60℃)加入过膜除菌后的底物1mM邻苯二甲酸二丁酯(溶于DMSO)与100μg/mL氨苄青霉素，摇匀后倒平板。将cosmid文库菌液经适当稀释后涂布在筛选平板上，37℃培养1-2天，观察菌落周围透明圈的形成，即为阳性克隆子(图1)。
[0074] 2.复筛，HPLC验证其邻苯二甲酸酯水解酶的酶活性
[0075] 将初筛获得的单克隆接种于液体LB(含100μg/mL氨苄青霉素)培养基中在37℃培养过夜(12h)，以12,000×g、室温离心8min，弃上清液，以等体积无菌去离子水重悬菌体，以1％(v/v)接种于液体LB培养基(含0.1mM DBP及100μg/mL Amp)中，在37℃、180rpm下避光振荡温育12h。取出5mL培养液，加入等体积正己烷，剧烈震荡2min后放摇床180r/min充分混匀
30min。静置分层后取出有机相，取1mL有机相在超净台吹干，然后用1mL色谱级甲醇定容。过
0.22μm有机膜，HPLC分析DBP残留量。液相色谱条件：流动相为甲醇/水(95/5(含0.1％甲酸)，V/V)，流速为0.5mL/min，柱子采用Zorbax SB-C18色谱柱(4.6×150mm，5μm)，紫外检测器波长为242nm，柱温为35℃，进样量为20μL。
30min。静置分层后取出有机相，取1mL有机相在超净台吹干，然后用1mL色谱级甲醇定容。过
0.22μm有机膜，HPLC分析DBP残留量。液相色谱条件：流动相为甲醇/水(95/5(含0.1％甲酸)，V/V)，流速为0.5mL/min，柱子采用Zorbax SB-C18色谱柱(4.6×150mm，5μm)，紫外检测器波长为242nm，柱温为35℃，进样量为20μL。
[0076] 发酵液检测到DBP的降解并有新的物质产生表明筛选到具有邻苯二甲酸酯水解酶活性的克隆子(图2)。
[0077] 3.亚克隆
[0078] 复筛得到的阳性克隆子经过夜培养后提取质粒DNA，利用Sau3AI进行部分酶切，电泳后切胶回收1-5kb大小的DNA片段，连接至经BamHI酶切的载体pUC118中并转化至E.coli DH5a，使用相同的底物筛选平板筛选阳性亚克隆。
[0079] 4.阳性亚克隆序列测定及分析
[0080] 使用载体pUC118自带的M13引物序列进行测序，开放阅读框预测使用在线分析工具ORFFinder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)，BlastP程序检索预测蛋白的同源序列(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.Cgi)。将获得的邻苯二甲酸酯降解酶基因命名为estj6。
[0081] 实施例2:邻苯二甲酸酯水解酶的克隆
[0082] 1.PCR扩增
[0083] 利用引物：
[0084] 上游引物：5’-CATGCCATGGGCATGGCAAGTCCGCAACTA-3’(SEQ ID No.3)；和[0085] 下游引物：5’-CCCAAGCTTCGCGGTGATCTGCCGGAC-3’(SEQ ID No.4)扩增邻苯二甲酸酯水解酶基因estj6，上下游引物下划线处分别表示NcoI和HindIII的酶切位点。
[0086] PCR反应体系(25μL)：超纯水9.5μL，2×Taq Master Mix 12.5μL，上下游引物各1uL，阳性亚克隆质粒DNA lμL。PCR反应条件：94℃ 3min；94℃ 30s，63℃45s，72℃ lmin，35个循环；72℃ 10min。将PCR产物电泳，割胶回收，得到纯化的PCR产物。
[0087] 2.酶切
[0088] 将纯化回收的PCR产物进行双酶切，酶切时间3-4h。酶切体系为：NcoI 5uL，HindIII 5uL，l0XK Buffer 10uL，0.1％BSA 10uL，PCR产物5ug，无菌水加至100uL。割胶回收得到纯化的经双酶切的PCR产物。
[0089] 对pET28a(+)质粒DNA进行双酶切，酶切时间3-4h酶切体系为NcoI 5uL，HindIII 5uL，l0XK Buffer 10uL，0.1％BSA 10uL，pET28a(+)质粒DNA5ug，无菌水加至100uL。割胶回收得到纯化的经过双酶切的pET28a(+)载体。
[0090] 3.连接
[0091] 将经过双酶切的PCR产物和pET28a(+)载体按照10:1的摩尔比例进行连接。连接温度为l6℃，连接时间为12h。
[0092] 4.转化及筛选
[0093] 取10uL连接产物加入到100uL大肠杆菌DH5a感受态细胞中，冰上孵育30min，于42℃水浴锅热激45s，冰浴2min后加入900μL LB液体培养基，180rpm，37℃震荡培养1h。将菌液涂布于含有卡那霉素的LB平板中，37℃过夜培养后挑取单菌落。单菌落于5ml LB培养基中过夜培养后提取质粒，进行双酶切验证，酶切片段与基因大小相同的即为阳性克隆。将获得的阳性克隆进行测序，测序结果与EstJ6的核苷酸序列(如SEQ ID NO.l所示)比对，结果完全正确，确认得到带有estj6基因的pET28a(+)质粒，命名为pET28a-estj6。
[0094] 实施例3：邻苯二甲酸酯水解酯酶EstJ6的异源表达与纯化
[0095] 1.转化
[0096] 取实施例2得到的pET28a-esjt6质粒10uL加入到100uL大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，冰上孵育30min，于42℃水浴锅热激90s，冰浴2min后加入900uL LB液体培养基，180rpm，37℃震荡培养1h。将菌体重悬并涂布于含有卡那霉素的LB平板中，37℃过夜培养后挑取单菌落。
[0097] 2.诱导表达
[0098] 将重组菌接种至含有卡那霉素的5ml LB液体培养基中，37℃、180rpm培养12h。取1ml菌液接种至100ml新鲜LB培养基中，37℃、200rpm培养至OD 600nm为0.6左右，添加IPTG至其终浓度为0.5mM，于16℃、180rpm继续培养20h。
[0099] 3.纯化
[0100] 将诱导表达20h左右的菌液于4℃、15000rpm条件下离心15min收集菌体，PBS缓冲液重悬后超声破碎(冰水浴，超声l s间隔2s，30min)，于4℃、15000rpm条件下离心30min，取上清即得到粗酶液。将得到的粗酶液，过Ni-NTA纯化树脂预装柱进行纯化，经5～10倍体积的洗脱液(pH 8.0的PBS，分别含有20mM、50mM、100mM、250mM、500mM咪唑)清洗后，将蛋白从柱子上洗脱下来。纯化后的蛋白利用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测(图3)。
[0101] 实施例4:邻苯二甲酸酯水解酶EstJ6的酶学性质表征
[0102] 1.邻苯二甲酸酯水解酶EstJ6活性测定
[0103] 酶活力单位的定义：在最适条件下，每分钟转化1uM底物(DBP)所需的酶量定义为一个酶活力单位。
[0104] 2.最适温度及热稳定性
[0105] 使用10mM磷酸盐(PBS)pH7.5作为缓冲液，以邻苯二甲酸二丁酯(DBP)为底物，通过将酶(0.25ug/ml蛋白质)在含有1mM DBP作为底物的10mM PBS(pH7.5)中温育8min来研究EstJ6在16-80℃范围内的最佳温度，结果如图4a所示。在相同反应体系下，通过将酶置于30-60℃的温度下预孵育10-60min来分析EstJ6的热稳定性，结果如图4b所示。该酶的在40℃时具有最高活性，该酶在40℃反应1h仍能保持近90％的初始酶活；在25℃-50℃时，该酶的活性保持65％以上；当超过50℃时，酶活性快速降低，而当温度达到80℃时酶的活性完全丧失。
[0106] 3.最适pH
[0107] 在40℃条件下，以邻苯二甲酸二丁酯(DBP)为底物，通过将酶(0.25ug/ml蛋白质)在含有1mM DBP作为底物的10mM PBS(pH7.5)中温育8min来研究EstJ6在pH 3.0-11.0范围内的活性。结果如图4c所示。该酶在pH 7.5时酶活性最大；当pH为3.0-7.5时，EstJ6的活性逐渐增加；而pH值高于7.5时EstJ6的活性迅速下降。
[0108] 4.底物特异性
[0109] 根据上述酶活测定方法，比较EstJ6对不同底物的水解能力，结果如图4d所示。EstJ6能够水解具有C1-C9链的邻苯二甲酸二酯类化合物。其中在40℃和pH 7.5下EstJ6对DBP的催化活性最高，高达95％，随后是DPP(82％)、DPRP(75.68％)和DEP(68.81％)。尤其是，EstJ6对长而复杂的侧链的DEHP也有一定的活性(18％)。EstJ6的动力学参数如表1所示，Km值越低，Vmax值越高，Kcat/Km值越高，催化效率越高。EstJ6水解速率趋势为：DBP>DPP>DPRP>DEP>DHP>DMP。另外，通过HPLC分析了EstJ6对邻苯二甲酸单酯类化合物的底物特异性，结果表明，EstJ6还能够水解MMP，MEP，MBP，MHP和MEHP。
[0110] 表1 EstJ6的动力学参数
[0111]
[0112]
[0113] 5.有机溶剂、金属离子及表面活性剂对EstJ6活性的影响
[0114] 反应体系内分别加入25％和50％有机溶剂(EDTA、SDS、丙酮、DMSO、甲醇、乙腈、DMF、环己烷、异丙醇，乙醇)，1mM和5mM的金属离子(Mn2+、Ca2+、Fe3+、Mg2+、Cr2+、Cu2+、Ag+、Zn2+)，0.5％表面活性剂(Tween20、Tween40、Tween60、Tween80、Triton-100、SDS、CTAB)，以DBP为底物在最适条件下测定EstJ6酶活。加入3M的HCl(10％)终止反应，充分震荡后加入2倍体积的色谱级甲醇，取有机相过膜除杂，并使用HPLC定量底物残留量。以不添加金属离子或化学试剂时EstJ6的相对活性定义为100％，结果如图4e-g所示。1mM金属离子(Mn2+，Mg2+，Cu2+)，25％乙醇，0.5％(Tween20，Tween40和Triton-100)对EstJ6活性几乎没有影响；50％有机溶剂(EDTA，丙酮，DMSO，甲醇，乙腈，DMF，异丙醇和乙醇)，1mM金属离子(Cr+和Ag+)，5mM金属离子(Mn2+，Fe3+，Cr2+，Cu2+，Ag+，Zn2+)，SDS和CTAB会强烈抑制EstJ6的活性；1mM金属离子(Ca2+，Fe3+和Zn2+)，5mM金属离子(Ca2+和Mg2+)对EstJ6活性具有轻微抑制作用；而Tween60和Tween80对EstJ6的活性具有略微促进作用。
[0115] 6.EstJ6对DEHP生物降解途径推定
[0116] 以DEHP作为底物，测定了纯化的EstJ6对邻苯二甲酸酯的降解能力。在1mL 10mM PBS(pH7.5)反应体系中加入12ug/ml纯化的EstJ6以及1mM DEHP，混匀后在40℃温育12h，样品在超净台吹干并重新溶于色谱级甲醇。取有机相过0.22μm有机膜，并通过GC-MS进行分析。
[0117] GC-MS的条件如下：进样量为1uL，分流模式为20：1，流速为1mL/min。运行方法为：首先以60℃保持1min；然后以10℃/min的速度升至180℃保持10min；最后以15℃/min的速度升至220℃保持5min。
[0118] 使用GC-MS分析EstJ6对DEHP的降解，EstJ6通过裂解酯键有效地将DEHP水解成相应的MEHP和PA，如图5a-d所示，其中5a为DEHP降解后残留DEHP及其降解产物(MEHP和PA)的总离子流色谱图，5b-d为DEHP降解后残留DEHP及其降解产物(MEHP和PA)的质谱图。基于降解产物推定EstJ6对DEHP降解的途径，如图5e所示。在DEHP降解过程中，EstJ6通过中间产物MEHP介导DEHP向PA的水解。
[0119] 7.EstJ6系统发育树分析
[0120] 将EstJ6及其他已知类型的酯酶氨基酸序列利用MEGA6.0软件构建系统发育树(图6)。EstJ6含有该家族的三个特征基序(YXLHPE，HGGG和GDSAGG)，它还含有一个保守基序EXLLD，其不同于第IV家族其他成员的基序DPLXD。结果表明EstJ6属于酯酶Family IV家族的一个新成员。
[0121] 8.EstJ6多序列比对
[0122] 利用在线工具Clustal Omega对EstJ6及其同源序列进行多序列比对(图7)。EstJ6序列含有三个保守基序，分别为HGGG(76-79)，YXLAPE(108-113)和GDSAG(144-148)。其中，HGGG靠近活性位点，有助于形成氧阴离子洞参与催化过程。YXLAPE基序先前已报道，但其功能仍然未知。对于GX1SX2G，它是PAEs水解酶中的众所周知的五肽基序，在GX1SX2G基序中鉴定了参与催化三联体的丝氨酸残基(S)。这三个保守区域在酯酶/脂肪酶中非常常见。此外，EstJ6还含有一个保守基序EXLLD(240-244)，其不同于其他PAEs水解酶的保守基序DPLXD，EXLLD基序中的D和E可能是组成催化三联体的亚基。
[0123] 实施例5:EstJ6同源建模
[0124] 通过NCBI BLAST在PDB数据库中搜索EstJ6的同源模板用于建模。选择来自细菌激素敏感脂肪酶(HSL)家族的微生物酯酶(PBD：4XVC-A)的晶体结构作为模板，其序列同一性为53％，查询覆盖率为98％。
[0125] 如图8所示，EstJ6和微生物酯酶(PBD：4XVC-A)的三维结构的叠加表明它们属于丝氨酸水解酶超家族。它们具有α/β水解酶折叠，其中可以识别两个结构域，分别是催化结构域和覆盖活性位点入口的螺旋帽结构域。
[0126] 如图8所示，使用DBP作为配体，EstJ6作为受体进行了对接研究。DBP位于催化结构域和帽结构域之间，这表明底物结合口袋的位置，且在底物附近发现与其相互作用的氨基酸残基S146-E240-H270。
[0127] 实施例6：EstJ6保守氨基酸残基定点突变
[0128] 利用Trelief TM SoSoo克隆试剂盒(擎科科技有限公司，中国)对EstJ6的保守氨基酸进行定点突变(S146,E240,D244和H270)，突变引物如表2所示。活性实验结果表明S146A、E240A及H270A活性完全丧失，而D244A活性受到明显的抑制。此外，以DBP为底物，测定EstJ6和突变体的动力学参数(表3)。D244A突变体对DBP的催化活性为野生型酶的55％，其Km和Vmax值分别为0.756mM和27.549umol/min/mg。为了进一步验证催化三联体的其中一个碱基是由E而不是D组成，将E240进一步突变为D，结果表明，突变体E240D的活性(7％)几乎完全丧失。因此，推测EstJ6的催化三联体残基是S146-E240-H270，其不同于在第IV家族中具有邻苯二甲酸酯降解能力的其他成员的经典催化三联体(SDH)。
[0129] 表2 EstJ6定点突变的引物
[0130]
[0131] 表3野生型(EstJ6)和突变型EstJ6的动力学常数
[0132]
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