一种马蹄莲组培苗更新复壮和打破休眠的方法
技术领域
[0001] 本
发明涉及一种马蹄莲组培苗更新复壮和打破休眠的方法，属
植物组织培养技术领域。
背景技术
[0002] 马蹄莲(Zantedeschia spp)为天南星科(Araceae)马蹄莲属(Zantedeschia)多年生草本球根花卉，其花型独特、花色艳丽、花叶共赏，不仅可以用作切花和盆花，还可种植于庭院、公园等，具有极高的观赏和商业价值，受到众多消费者的青睐，享有21世纪“花卉之星”的美誉。
[0003] 马蹄莲分为白花马蹄莲(Zantedeschia)和彩花马蹄莲(Aestivae)两个组，白花组马蹄莲包括Z.aethiopica和Z.odorata两个种，彩花马蹄莲组包括Z.aethiopica、Z.pentlandi、Z.elliottiana、Z.jucunda、Z.rehmannii和Z.albomaculata六个种，其中彩色马蹄莲对软腐病菌Pectobacterium carotovora subsp.Carotovora(PCC)极其敏感，极易因PCC引起的软腐病危害而死亡。马蹄莲的常规繁殖方法有分球繁殖和
播种繁殖两种，繁殖系数低，在繁殖过程中易受环境因子的影响，尤其是分球繁殖的伤口易诱发软腐病，导致种性退化，产量和品质下降，很难保持马蹄莲原有的优良性状。马蹄莲组织培养技术，不仅繁殖系数高，可以在短期内获得大量整齐、均匀的健壮种苗，还可以离体保存资源，克服大田种植易受环境影响的不足。但马蹄莲组培苗随着继代次数增加退化严重，表现为植株茎秆瘦弱，不定芽分化减少或不分化，植株整体生长缓慢；白花种Z.odorata和彩色马蹄莲，尤其是Z.odorata，存在冬季休眠不生长的现象。因此，解决马蹄莲组培苗继代退化和冬季休眠问题，对促进马蹄莲种苗繁育、资源保存和更新复壮具有重要意义。
发明内容
[0004] 本发明要解决的技术问题是：马蹄莲种质资源离体保存和种苗组织培养快繁过程中，种苗容易出现生长缓慢、分化少或不分化等退化现象，白花种Z.odorata在秋冬季节休眠的问题。
[0005] 本发明的目的在于提供一种马蹄莲组培苗更新复壮和打破休眠的方法，克服马蹄莲组培苗继代繁殖过程中的退化和休眠问题，具体包括以下步骤：
[0006] (1)培养基配制：按MS基本培养基配方配制母液，向母液中加TDZ母液，使TDZ的在培养基中的浓度为0.008-0.015mg/L，向母液中加6-BA母液，使6-BA的浓度为0.05-0.20mg/L，然后加入
蔗糖28-35g/L和琼脂粉6.20-6.50g/L，混匀后按照培养基熬制方法进行熬制，培养基pH调至6.0-6.1之间，随后一边混匀一边加入到组培容器中，使容器内培养基厚度大于等于1.5cm；将分装好的培养基进行灭菌，取出冷却后放于组培室内保存备用。
[0007] (2)在无菌操作台内将枯萎的组培苗
叶片和根系
切除，将苗基部的小球切割成方形小
块，方块宽度大于等于5mm，随后留1.0-1.5cm茎秆，切除其余茎秆；将切好的植株基部放入TDZ溶液中浸泡8-12min后转接到步骤(1)所得培养基中，做好品种和时间标记，其中TDZ溶液的浓度为0.008-0.015mg/L。
[0008] (3)将做好标记的组培苗置于
温度为24±2℃，光照强度为74-76μmol.mL-2.s-1，光照时间为14-16h，黑暗时间为8-10h的组织培养室预培养70-74h；预培养结束后，调节温度为22±2℃，光照强度为68-72μmol.ml-2.s-1，光照时间为12-14h，黑暗时间为10-12h进行培养；培养30-40d后进行后续相关实验。
[0009] 优选的，本发明步骤(1)中TDZ的配制方法为：称取10mg TDZ溶于100ml蒸馏
水中，终浓度为0.1mg/mL，用0.2um的过滤膜在无菌操作台中进行过滤，灭菌结束后置于4-6℃
冰箱保存备用。
[0010] 优选的，本发明步骤(1)中6-BA的配制方法为：称取10mg 6-BA，酒精助溶后溶于100ml蒸馏水中，终浓度为0.1mg/mL，转入棕色瓶，置于4-6℃冰箱中保存备用。
[0011] 优选的，本发明步骤(1)中灭菌的条件为：在高压灭菌锅中灭菌20-25min。
[0013] (1)本发明所述方法利用TDZ和6-BA组合运用于马蹄莲组培苗的复壮，能在五周内看到明显的效果，不定芽明显增多，而且芽体较之前强健。
[0014] (2)可以全年获得Z.odorata材料供研究试验使用。
[0015] (3)保障马蹄莲种质资源的长期有效地保存，与现有方法相比，本发明方法可延长退化的马蹄莲组培苗2年以上正常生长。
[0016] (4)更新复壮马蹄莲组培苗，保证马蹄莲良种种苗的供应。
附图说明
[0017] 图1为TDZ对组培苗丛生芽诱导的影响(a:添加0.05mg/L的6-BA和0.008mg/L的TDZ；b:添加0.1mg/L的6-BA和0.01mg/L的TDZ；c:添加0.25mg/L的6-BA和0.03mg/L的TDZ)。
[0018] 图2为TDZ对组培苗不定根诱导的影响(a:添加0.05mg/L的6-BA和0.008mg/L的TDZ；b:添加0.1mg/L的6-BA和0.01mg/L的TDZ；c:添加0.25mg/L的6-BA和0.03mg/L的TDZ)。
具体实施方式
[0019] 下面结合具体
实施例本发明作进一步的详细说明，但本发明的保护范围并不限于所述内容。
[0020] 本发明实施例选择已产生退化现象的彩花马蹄莲组培苗和秋冬季进入休眠的Z.odorata组培苗作为研究材料，将退化或休眠的马蹄莲组培苗接种到含有适宜浓度的TDZ和6-BA的MS培养基中，促进已退化的马蹄莲组培苗恢复分化和强健生长的能
力，打破Z.odorata马蹄莲休眠，延长马蹄莲离体保存时期，进而为马蹄莲资源保存和种苗生产提供有效的技术支持。
[0021] 实施例1
[0022] 一种马蹄莲组培苗更新复壮和打破休眠的方法，具体包括以下步骤：
[0023] (1)TDZ母液和6-BA母液的配制：称取10mg TDZ溶于100mL蒸馏水中(终浓度为0.1g/mL)，用0.2μm的过滤膜在无菌操作台中进行过滤，灭菌结束后转入无菌的10mL离心管中，置于4℃冰箱保存备用；称取10mg 6-BA，酒精助溶后溶于100mL蒸馏水中(终浓度为
0.1g/mL)，转入棕色瓶，置于4℃冰箱中保存备用。
[0024] (2)培养基配制：按照MS基本培养基配方配制母液，向母液当中加TDZ母液，使TDZ浓度为0.01mg/L，向母液当中加6-BA母液，使6-BA浓度为0.1mg/L，然后加入蔗糖30g/L和琼脂粉6.25g/L，混匀后按照培养基熬制方法进行熬制，培养基pH调至6.0-6.1之间，随后一边混匀一边加入到250mL玻璃组培瓶中，使瓶内培养基厚度达到1.5cm；最后将分装好的培养基在高压灭菌锅中灭菌25min，取出冷却后放于组培室内保存备用。
[0025] (3)退化和休眠组培苗的切割方法：在无菌操作台内将枯萎的组培苗叶片和根系切除，将苗基部的小球切割成方形小块，使方块宽度大于5mm，随后留1cm茎秆，切除其余茎秆；将切好的植株基部放入TDZ溶液中(TDZ浓度与培养基中TDZ的浓度相同)浸泡10min，然后将组培苗基部方块全部插入对应的培养基中，每瓶接种三棵苗，做好品种和时间标记。
[0026] (4)接种后预培养：将做好标记的组培苗置于温度为24℃，光照强度为75μmol.mL-2.s-1，光照时间为16h，黑暗时间为8h的组织培养室预培养72h；预培养结束后，调节温度为-2 -122℃，光照强度为70μmol.mL .s ，光照时间为14h，黑暗时间为10h进行培养；培养35d后即可看到明显效果，之后进行后续相关实验。
[0027] 在条件相同的条件下，添加不同浓度的6-BA和TDZ，研究TDZ对马蹄莲不定芽的诱导情况和TDZ对马蹄莲不定根的诱导情况，效果表1和表2所示。
[0028] 表1 TDZ对马蹄莲不定芽的诱导情况
[0029]
[0030] 表2 TDZ对马蹄莲不定根的诱导情况
[0031]
[0032] 由图1、表1和图2、表2可知，在培养基中添加适宜浓度的TDZ和6-BA可以显著提高已退化马蹄莲组培苗的丛生芽诱导率和生根率，进而起到更新复壮和打破休眠的显著效果；和只添加6-BA或者只添加TDZ的相比，效果均达到显著水平。
[0033] 实施例2
[0034] 一种马蹄莲组培苗更新复壮和打破休眠的方法，具体包括以下步骤：
[0035] (1)TDZ母液和6-BA母液的配制：称取10mg TDZ溶于100mL蒸馏水中(终浓度为0.1g/mL)，用0.2μm的过滤膜在无菌操作台中进行过滤，灭菌结束后转入无菌的10mL离心管中，置于4℃冰箱保存备用；称取10mg 6-BA，酒精助溶后溶于100mL蒸馏水中(终浓度为
0.1g/mL)，转入棕色瓶，置于4℃冰箱中保存备用。
[0036] (2)培养基配制：按照MS基本培养基配方配制母液，向母液当中加TDZ母液，使TDZ浓度为0.01mg/l，向母液当中加6-BA母液，使6-BA浓度为0.1mg/l，然后加入蔗糖28g/L和琼脂粉6.4g/L，混匀后按照培养基熬制方法进行熬制，培养基pH调至6.0-6.1之间，随后一边混匀一边加入到250mL玻璃组培瓶中，使瓶内培养基厚度达到1.5cm；最后将分装好的培养基在高压灭菌锅中灭菌25min，取出冷却后放于组培室内保存备用。
[0037] (3)退化和休眠组培苗的切割方法：在无菌操作台内将枯萎的组培苗叶片和根系切除，将苗基部的小球切割成方形小块，使方块宽度大于5mm，随后留1.5cm茎秆，切除其余茎秆；将切好的植株基部放入TDZ溶液(浓度为0.01mg/l)中浸泡8min，然后将组培苗基部方块全部插入对应的培养基中，每瓶接种三棵苗，做好品种和时间标记。
[0038] (4)接种后预培养：将做好标记的组培苗置于温度为24℃，光照强度为74μmol.mL-2 -1.s ，光照时间为14h，黑暗时间为9h的组织培养室预培养70h；预培养结束后，调节温度为
22℃，光照强度为68μmol.mL-2.s-1，光照时间为12h，黑暗时间为11h进行培养；培养30d后即可看到明显效果，之后进行后续相关实验。
[0039] 本实施例中丛生芽分化状况和根分化状况均正常，丛生芽诱导率为85.36％，根诱导率为79.58％。
[0040] 实施例3
[0041] 一种马蹄莲组培苗更新复壮和打破休眠的方法，具体包括以下步骤：
[0042] (1)TDZ母液和6-BA母液的配制：称取10mg TDZ溶于100mL蒸馏水中(终浓度为0.1g/mL)，用0.2um的过滤膜在无菌操作台中进行过滤，灭菌结束后转入无菌的10mL离心管中，置于4℃冰箱保存备用；称取10mg 6-BA，酒精助溶后溶于100mL蒸馏水中(终浓度为
0.1g/mL)，转入棕色瓶，置于4℃冰箱中保存备用。
[0043] (2)培养基配制：按照MS基本培养基配方配制母液，向母液当中加TDZ母液，使TDZ浓度为0.01mg/L，向母液当中加6-BA母液，6-BA使浓度为0.1mg/L，然后加入蔗糖35g/L和琼脂粉6.5g/L，混匀后按照培养基熬制方法进行熬制，培养基pH调至6.0-6.1之间，随后一边混匀一边加入到250mL玻璃组培瓶中，使瓶内培养基厚度达到1.5cm；最后将分装好的培养基在高压灭菌锅中灭菌25min，取出冷却后放于组培室内保存备用。
[0044] (3)退化和休眠组培苗的切割方法：在无菌操作台内将枯萎的组培苗叶片和根系切除，将苗基部的小球切割成方形小块，使方块宽度大于5mm，随后留1.2cm茎秆，切除其余茎秆；将切好的植株基部放入TDZ溶液(浓度为0.01mg/l)中浸泡12min，然后将组培苗基部方块全部插入对应的培养基中，每瓶接种三棵苗，做好品种和时间标记。
[0045] (4)接种后预培养：将做好标记的组培苗置于温度为24℃，光照强度为76μmol.mL-2 -1.s ，光照时间为15h，黑暗时间为10h的组织培养室预培养74h；预培养结束后，调节温度为22℃，光照强度为72μmol.mL-2.s-1，光照时间为13h，黑暗时间为12h进行培养；培养40d后即可看到明显效果，之后进行后续相关实验。
[0046] 本实施例中丛生芽分化状况和根分化状况均正常，丛生芽诱导率为78.64％，根诱导率为73.87％。
