权利要求

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は土壌病害防除剤およびその製造方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】現在、農薬による殺菌や化学肥料による栄養分のかたよりが自然本来の生態系をゆがめ、かえって有害な微生物の蔓延と生理障害を引き起こす事例が増大している。 病原菌によって著しく汚染された土壌は、
クロルピクリンや臭化メチルなどの土壌くん蒸剤で処理せざるを得ないのが実状である。 しかし土壌くん蒸剤の多くは、土壌中の微生物を非選択的に殺菌するため使用後は根圏微生物の生態系を破壊する。 また、人畜に毒性があり刺激臭のため、人家に近いところでは使用が困難である。

【０００３】一方、ゴルフ場においては、近年、減農薬ないし無農薬の社会的要請が年々高まってきている。

【０００４】そこで、今日では各種の農薬代替品の導入が試みられている。

【０００５】例えば、一般に有用微生物を直接土壌に施用してもなかなか土壌に定着しないことから有機物を原料として拮抗微生物を担持しようとする試みがイナワラ堆肥、オガクズ、ピートモス等で行われている。 しかし、有用微生物の定着が不十分なため、その効力は低かった。

【０００６】また、球形や円柱状に成形した活性炭や炭粒に、窒素、リン酸、カリ等の肥料成分を含浸させることにより、土壌中での微生物の増殖を企図する製品も見受けられる。 しかし、コスト高のわりにその効力は低く、持続期間も短い。

【０００７】さらに有用微生物を種子に粉衣して定着させる試みも行われているが、この方法でも植物が大きくなるとそれに見合うだけの有用微生物密度が保てず、効力は十分でない。

【０００８】病土に直接、拮抗微生物を導入する方法は、殺菌土壌を使った実験系では成功しても、上述のように自然土壌では殆ど失敗しており、その原因は在来菌による駆逐を主とする「環境不適応」と考えられる。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】結局のところ、これまでの土壌病害防除剤は著効を示すものが見当たらないのが現状である。

【００１０】このような実状から、土壌病原菌に対して優れた抑止効果を示し、かつ安価に生産できて、使用上安全であり使いやすい天然の土壌病害防除剤が切望されている。

【００１１】この発明は、このような要望に応えることのできる土壌病害防除剤およびその製造方法を提供することを目的とする。

【００１２】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するために、本発明の土壌病害防除剤は、対象とする栽培植物の根圏から分離され、かつその根圏土壌と前記栽培植物との加熱抽出液のみからなる貧栄養培地で選別された拮抗微生物が活性炭と炭粒との複合担体に担持されていることを特徴とするものである。

【００１３】また、本発明の土壌病害防除剤の製造においては、対象とする栽培植物の根圏から細菌および／または放線菌を分離し、分離された菌株を前記栽培植物と前記根圏土壌との加熱抽出液のみからなる貧栄養培地で選別して拮抗微生物を得、この拮抗微生物を活性炭と炭粒との混合物中に添加混合することを特徴とするものである。

【００１４】本発明においては、活性炭と炭粒との前記混合物中にクエン酸および／またはその金属塩を添加して、活性炭と炭粒との複合担体にクエン酸および／またはその金属塩を含浸させておくことが好ましい。

【００１５】また、前記貧栄養培地にもクエン酸および／またはその金属塩を添加することが好ましい。

【００１６】以下、本発明をより具体的に説明する。

【００１７】本発明の土壌病害防除剤は、担体として活性炭と炭粒とからなる複合担体を用いることを第一のポイントとする。 活性炭は主として本防除剤の原料の一つである微生物培養ブロスの悪臭防除、栄養源の吸着並びに徐放、農薬の流出防止を狙ったものである。 一方、炭粒は、主として拮抗微生物の「すみか」を与えるものである。

【００１８】活性炭の原料は石炭、ヤシ殻、木材、モミ殻等いずれを使っても当該防除剤の性能に変わりはないが、コスト面から安価な再生炭の篩下微粉末を使用することが好ましい。

【００１９】炭粒としてはオガクズ、ヤシ殻、バーク、
モミ殻等を炭化したもので、およそ長径５mm以下の粉末であればよい。

【００２０】活性炭と炭粒との重量混合比は、およそ９：１から１：９の範囲内で、これに適宜ピート、カニ殻、カキ殻、ゼオライト、パーライト等を加えることができる。 上記の混合担体の原料は、いずれも養分の保持、地温の上昇、保水性、透水性など土壌改良剤としても既に有効性が認められ、農業や園芸分野に古くから使われている安全な資材である。

【００２１】本発明においては、上記活性炭に、拮抗微生物および拮抗微生物の活性化剤として、あらかじめクエン酸またはその金属塩を吸着させておくことが好ましい。 天然の有機酸、特にクエン酸は、植物の成長促進効果を示すことも認められている（特開平４−４６１０４
号公報、実用バイオ農芸「自然と野生ラン」２月号増刊、Ｐ２６、１９９２−２−２０、新企画出版局）。 このクエン酸またはその金属塩は、最終製品中の含量が０．０５％（ｗ／ｗ）から０．５％（ｗ／ｗ）、とりわけ０．１％（ｗ／ｗ）近辺になるように活性炭に吸着させる。

【００２２】次に、本発明の最も重要特徴の一つである拮抗微生物の選別について説明する。

【００２３】本発明は、対象とする栽培植物の根圏から細菌や放線菌を分離すること、分離した菌株の選別培地は対象とする植物と根圏土壌との加熱抽出液のみからなる当該土壌環境に近似した培地で選別することを第二のポイントとする。 例えば、ゴルフ場のペンクロスベントグリーンを対象とする拮抗微生物の選別の場合、グリーンのソッドからマルトース−酵母エキス寒天培地またはグルコース−アスパラギン寒天培地上で細菌や放線菌を分離する。

【００２４】一方、ソッドを重量比でおよそ２倍量の水道水に懸濁し、１００〜１２０℃で３０分間加熱抽出する。 冷却後ガーゼ数枚を重ねて濾過し、室温でおよそ２
週間静置した後、再びガーゼを重ねて濾過する。 その濾液をｐＨ６．７からｐＨ７．０に希塩酸または希アルカリで調整した後、適宜試験管やフラスコに分注、綿栓し、１２０℃で２０分間加圧蒸気滅菌後、上記の細菌や放線菌の選別培地として供する。

【００２５】温度２０℃から３０℃にて、回転振盪培養機（毎分１２０〜１３０回転）で３日から６日にわたって培養した後、培養物をパルプ検定に供する。

【００２６】このようにして得られた拮抗微生物の中にはクエン酸嗜好性を有する微生物が多く、例えばゴルフ場のペンクロスベントグリーンを対象とする場合、上記のソッド加熱抽出液にクエン酸・一水和物を０．１〜
１．０％（ｗ／ｗ）添加した培地で旺盛な成育を示し、
かつ拮抗物質を産生する特徴がある。 この場合、クエン酸はナトリウムやカリウム等の金属塩とすることもできる。

【００２７】

【作用】本発明においては、活性炭と炭粒との複合担体を利用することにより、拮抗微生物の培養ブロスを濾過、洗浄等の前処理を施すことなく、直接に吸着、担持させて生産コストの低下、栄養源の吸着、培養ブロスの悪臭防除、さらには農薬の流出防止等を一挙に達成することができる。

【００２８】また、栄養源として、単に培養物のみでなく、拮抗微生物の特性から、天然有機酸の一つであり安価に市販されているクエン酸またはその金属塩を複合担体に担持させて使用することにより、土壌中における拮抗微生物の定着率は飛躍的に上昇する。

【００２９】さらに、対象とする土壌病害の根圏からその土壌の加熱抽出液のみからなる貧栄養培地で選別された拮抗微生物は、各種病害に対して著効を示し、同時に芝については発芽率を向上させる作用を有する。

【００３０】

【実施例】以下、本発明を実施例に基づき説明する。

【００３１】拮抗微生物の選別ペンクロスベントグリーンのソッドから本発明に従い上述のようにして得た培養物を、被験菌としてフザリウム属（Fusarium）、ヘルミントスポリウム属（Helminthosporium）、リゾクトニア属（Rhizoctonia ）、スクレロチニア属（Sclerotinia
）、ピシウム属（Pythium ）のそれぞれ１ないし１０
株を用い、ポテト−デキストロース寒天平板を使ってパルプ検定に供した。 阻止円径より拮抗能を判定し、さらに高次の選別を行った。 すなわち、微生物農材を施用しても外来菌の定着性が低い原因は、主として在来菌との競合、外来拮抗菌間の競合、土壌の物理化学性（ｐＨ、
栄養源、温度、酸素、水分等）の変化に対する耐性、紫外線や農薬に対する耐性等が考えられる。 高次選別手段として、これらのストレス全てに配慮して所与の環境に適応する可能性が大きい優良株を選別した。

【００３２】動植物に対する安全性については、ヒメダカによる急性毒性試験を行うことと並行して、各種植物例えば、ペンクロスベント、コウライ、ノシバ等に対して高濃度菌数条件下（１０ ¹⁰ 〜１０ ¹²生菌数／ml）での栽培試験を行い、対照区と比較して成育阻害がないことを確認した。

【００３３】以上の試験成績を細菌、放線菌それぞれ代表例について下記の表１、表２および表３に示す。

【００３４】なお、土壌より分離した放線菌には、作業の便宜上、記号ＷＳを冠して順次連続番号を付け、細菌には記号ＷＢを付してその後に連続番号を付けて、識別を容易にした。

【００３５】

【表１】

【表２】

【表３】

このようにして選別された拮抗微生物の数は細菌１０

株、放線菌５０株であった。 それぞれについて菌学的性質を検討した結果、細菌については、シュードモナス属（Pseudomonas ）、バチルス属（Bacillus）が優勢であったほか、これまでに報告例がないアゾモナス属（Azom

onas）１株が認められた。

【００３６】放線菌については、ストレプトミセス属（Streptomyces）が優勢であった。 単離された代表的なストレプトミセス属の２株とアゾモナス属の１株についてその性質を表４と表５に示す。

【００３７】尚、上述の方法は主にシャーリングとゴットリーブ（Shirling EB and D.Gottlieb: Methods fo
r characterization of Streptomyces species.Interna
tional Journal of Systematic Bacteriology 16,313-3
40,1966 ）、ワックスマン（Waksman SA: The Actiom
ycetes Vol.2:Classification,identification and des
cription of genera and species:The Williams and Wi
lkins Co.,Baltimore,1961）、ウイリアムス（Williams
ST :Bergey's Manual of Systematic Bacteriology
Vol.4,2451-2508:The Williams and Wilkins Co., Balt
imore,1989）およびブキャナンとギボンズ(Buchanan R.
E. and NE Gibbons: Bergey's Manualof Determinati
ve Bacteriology,8th edition, 748-829: The Williams
and Wilkins Co., Baltimore,1974 ）に従った。

【００３８】

【表４】

【表５】

＜実施例１＞ （活性炭と炭粒との複合担体利用による菌体入り芝草病害防除剤の製造）２ｍ

³混合槽内にヤシ殻活性炭の３２

メッシュ篩下微粉末１１０kg、オガ炭１２５kgおよびピートモス６０kgを入れ、１時間混合攪拌した。 混合担体はｐＨ８．４であった。

【００３９】一方、ペンクロスベントのソッドから前記の方法により分離した拮抗微生物ＷＳ６、５５、５８、
１３３、２４８、２９４（以上、放線菌）、ＷＢ５、３
３、５１、１０５（以上、細菌）をあらかじめＰＹＧ培地（培地１リットル中、ポリペプトン２０ｇ、酵母エキス１０ｇ、コーンスチープリカー２０ｇ、グルコース１
０ｇ、Ｋ ₂ ＨＰＯ ₄ ５ｇ、ＦｅＳＯ ₄・７Ｈ ₂ Ｏ ０．
５ｇ、ＭｇＳＯ ₄・７Ｈ ₂ Ｏ ０．５ｇ、ｐＨ６．７）
で培養しておき、この培養物１０リットル、コーンスチープリカー３．５ｇおよび水道水３００リットルを上記槽内に添加混合した。

【００４０】室温で７日間攪拌を続けて製品６００kgを得た。 製品を分析した結果、ｐＨ８．１、全生菌数４．
１×１０ ⁹ ／ｇ（湿潤質量）であった。

【００４１】＜実施例２＞ （クエン酸利用による菌体入り芝草病害防除剤の製造）
１０リットル容ポリバケツの中でクエン酸・１Ｈ ₂ Ｏ
５００ｇを水道水１．５リットルに溶解した。 これにヤシ殻活性炭の３２メッシュ篩下微粉末１kgを添加混練し、クエン酸吸着活性炭３kg（ｐＨ２．９７）を得た。

【００４２】一方、ペンクロスベントのソッド加熱抽出液にクエン酸０．３％（ｗ／ｖ）添加した培地（ｐＨ
６．７）で選別した拮抗微生物ＷＳ１８２、２２６（以上、放線菌）、ＷＢ、１２６（細菌）を実施例１と同様のＰＹＧ培地で培養して培養物７．５リットルを得た。
これをヤシ殻活性炭の３２メッシュ篩下微粉末４．５k
g、オガ炭４．５kg、ピートモス１．５kgおよび水道水２リットルと攪拌混合して、微生物吸着炭２０ｋｇ（ｐ
Ｈ７．５６）を得た。

【００４３】次いで、２ｍ ³混合槽内にカキ殻粉末３３
０kgおよびカニ殻粉末７０kgを仕込み、これに上記のクエン酸吸着活性炭３kgと微生物吸着炭２０kgを添加混合した。 １時間後、水道水６０リットルを数回に分けて添加混合し、その後、室温で２日間混合を続けて、製品４
８０kgを得た。

【００４４】製品を分析した結果、ｐＨ８．４、全生菌数２．５×１０ ⁹ ／ｇ（湿潤質量）であった。

【００４５】拮抗微生物の生産性におよぼすクエン酸添加の効果は、図１に示す通りである。 芝ソッドの加熱抽出液にクエン酸・１Ｈ ₂ Ｏを所定濃度に添加溶解してｐ
Ｈ６．７に調整した。 試験管に５ｍｌずつ分注後、１２
０℃、２０分加圧蒸気滅菌した。 ２０℃、４日、回転培養し、その培養物を適宜、滅菌水で希釈した後、R.sola
niＧＲ−９を、被験菌としてパルプ検定した。 土壌病害防除剤の生産菌株としては、クエン酸嗜好性の強い菌株を優先的に使用した（例：ＷＢ１０５，ＷＳ１３３，Ｗ
Ｓ３０７等）。

【００４６】＜実施例３＞ （リゾクトニア ソラニ クーン、表１中のＧＲ−５によるペンクロスベントのリゾクトニア病防除−湿式系） １）病原土壌の調製 ３００ml容広口三角フラスコに乾燥畑土２００ｇ（５メッシュ篩下）、米糠２０ｇ、蒸留水２５mlをいれて混合し、アルミホイールでカバーして加圧蒸気滅菌（１２０
℃、３０分）を行った。 冷後、上記病原菌の寒天平板培養物を植菌し、２５℃で２週間培養して、病原土壌とした。

【００４７】２）ペンクロスベントのマット芝の調製 麻の不織布（厚さ５mm）を５cm角に切り、ガラス製の大型ペトリ皿（１４．５cmφ×３cmＨ）内に６〜７枚ずつ並べて水道水に浸漬し、１２０℃で２０分間加圧蒸気滅菌した。 冷後、余分の水を流し去り、湿った不織布の表面にペンクロスベントの滅菌種子を播種（１ｇ／１００
ｃｍ ² ）した後、２５℃で１週間に亘り、照度４５００
ルックスにて１６時間日長の条件下で栽培し、マット芝として供試した。

【００４８】種子の滅菌は、７０％エチルアルコールで２分間種子を湿らせた後、有効塩素濃度として２％次亜塩素酸ナトリウムに５分間浸漬した。 滅菌水で数回洗浄した後、滅菌砂１０倍量に混ぜて使用した。

【００４９】３）リゾクトニア病防除試験 ガラス製の滅菌ペトリ皿（８．６cmφ×１．７cmＨ）に上記１の病原土壌１ｇと実施例１で製造した土壌病害防除剤１ｇおよび５ｇの２水準と、前記のソッド加熱抽出液（ｐＨ６．７）の滅菌液３０mlとを入れて静かに攪拌混合した。 これに上記２で調製したペンクロスベントのマット芝、１片ずつを浸漬して蓋をした。 ２５℃、照度４５００ルックス、１６時間日長の条件下でおよそ２か月発病抑制効果を試験した。 反復数は２連とした。 その結果を表６に示す。

【００５０】

【表６】

表６の結果からも明らかなように、無処理区は病原菌接種後１６日で激烈な病徴を示し、２１日には完全に枯死したのに対して、本剤施用区は２９日までほぼ健常な状態を維持し、２か月目に入ってようやく軽微な病徴が認められる程度に抑制された。

【００５１】＜実施例４＞ （ペンクロスベントのブラウンパッチ病防除−乾式系）
ケニスＳカップ（商品名）に滅菌山砂１００ｇ、滅菌米糠０．５ｇおよび硫黄華０．５ｇを入れて十分に攪拌混合後、滅菌水１５mlを入れ、１２０℃で１５分間加圧蒸気滅菌を行った。 冷後、実施例１で製造した菌体入り農材１ｇと病原土壌（実施例３に同じ）１ｇとを入れ、表層を攪拌後、ペンクロスベント（実施例３に同じ）を乾燥種子換算５０mg量播種し、透明な蓋で密閉して栽培した。 条件は温度２５℃、照度３０００ルックス、１６時間日長とした。 実験の反復数は１０カップとした。

【００５２】その結果を表７に示す。

【００５３】

【表７】

表７から明らかなように、菌体入り農材使用区は対照区と比べてリゾクトニア病抑制効果が明瞭であった。 このことは、培地表面に形成された接種リゾクトニアのコロニー数が当該農材の添加によって、激減する事実とも一致するものである。 さらに、当該農材の使用により種子の発芽率が向上することも認められた。

【００５４】

【発明の効果】以上説明してきたように、本発明の土壌病害防除剤は、特定の方法で選別された拮抗微生物が活性炭と炭粒とからなる複合担体に担持されていることにより、まず複合体自体による効果として、保水性、保肥性および透水性の向上、水や空気からの有害物質の除去、根が分泌する根酸等の分泌物の吸着と分解、並びに多孔性による空気量の保持により、作物成育および有用微生物の「すみか」として好適な環境を付与することができること等が挙げられる。 このうち特に、培養液の養分やクエン酸等の保肥性と、培養液の悪臭や農薬有害物質の除去とは活性炭の使用により達成され、拮抗微生物の「すみか」としての有用性は炭粒の使用により達成される。 このことは、実際に、選別された拮抗微生物を単独に上記複合体に担持させ、２５℃で１年間の保存試験を行った結果、いずれも生菌数の減少が認められなかったことからも明らかである。

【００５５】次に、対照とする栽培植物の根圏から分離され、かつその根圏土壌と前記栽培植物との加熱抽出液のみからなる貧栄養培地で選別された拮抗微生物に基づく効果として、例えば芝草の病害に対して、１平方メートル当たり２００〜３００ｇの施用で、芝草のリゾクトニア病、ピシウム病、スクレロチニア病、ヘルミントスポリウム病あるいはフザリウム病等に対して著効を示すことが挙げられる。 またこれと同時に、芝については発芽率を極めて有効に向上させることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】拮抗微生物の生産性におよぼすクエン酸添加の効果を示すグラフである。

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【手続補正書】

【提出日】平成４年１０月８日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２０

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２０】活性炭と炭粒との重量混合比は、およそ９：１から１：９の範囲内で、これに適宜ピートモス 、
カニ殻、カキ殻、ゼオライト、パーライト等を加えることができる。 上記の混合担体の原料は、いずれも養分の保持、地温の上昇、保水性、透水性など土壌改良剤としても既に有効性が認められ、農業や園芸分野に古くから使われている安全な資材である。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３２

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３２】動植物に対する安全性については、ヒメダカによる急性毒性試験を行うことと並行して、各種植物例えば、ペンクロスベント、コウライ、ノシバ等に対して高濃度菌数条件下（１０ ¹⁰ 〜１０ ¹²生菌数／ml）での栽培試験を行い、対照区と比較して生育阻害がないことを確認した。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３５

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３５】

【表１】

【表２】

【表３】

このようにして選別された拮抗微生物の数は細菌１０

株、放線菌５０株であった。 それぞれについて菌学的性質を検討した結果、細菌については、シュードモナス属（Pseudomonas ）、バチルス属（Bacillus）が優勢であったほか、これまでに報告例がないアゾモナス属（Azom

onas）１株が認められた。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３８

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３８】

【表４】

【表５】

＜実施例１＞ （活性炭と炭粒との複合担体利用による菌体入り芝草病害防除剤の製造）２ｍ

³混合槽内にヤシ殻活性炭の３２

メッシュ篩下微粉末１１０kg、オガ炭１２５kgおよびピートモス６０kgを入れ、１時間混合攪拌した。 混合担体はｐＨ８．４であった。

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５０

【補正方法】変更

【補正内容】

【００５０】

【表６】

表６の結果からも明らかなように、無処理区は病原菌接種後１６日で激烈な病徴を示し、２１日には完全に枯死したのに対して、本剤施用区は２９日までほぼ健常な状態を維持し、２か月目に入ってようやく軽微な病徴が認められる程度に抑制された。

【手続補正６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５４

【補正方法】変更

【補正内容】

【００５４】

【発明の効果】以上説明してきたように、本発明の土壌病害防除剤は、特定の方法で選別された拮抗微生物が活性炭と炭粒とからなる複合担体に担持されていることにより、まず複合体自体による効果として、保水性、保肥性および透水性の向上、水や空気からの有害物質の除去、根が分泌する根酸等の分泌物の吸着と分解、並びに多孔性による空気量の保持により、作物生育および有用微生物の「すみか」として好適な環境を付与することができること等が挙げられる。 このうち特に、培養液の養分やクエン酸等の保肥性と、培養液の悪臭や農薬有害物質の除去とは活性炭の使用により達成され、拮抗微生物の「すみか」としての有用性は炭粒の使用により達成される。 このことは、実際に、選別された拮抗微生物を単独に上記複合体に担持させ、２５℃で１年間の保存試験を行った結果、いずれも生菌数の減少が認められなかったことからも明らかである。

【手続補正７】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５５

【補正方法】変更

【補正内容】

【００５５】次に、 対象とする栽培植物の根圏から分離され、かつその根圏土壌と前記栽培植物との加熱抽出液のみからなる貧栄養培地で選別された拮抗微生物に基づく効果として、例えば芝草の病害に対して、１平方メートル当たり２００〜３００ｇの施用で、芝草のリゾクトニア病、ピシウム病、スクレロチニア病、ヘルミントスポリウム病あるいはフザリウム病等に対して著効を示すことが挙げられる。 またこれと同時に、芝については発芽率を極めて有効に向上させることができる。

【手続補正８】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 喜田 大三 東京都清瀬市下清戸４丁目640番地 株式 会社大林組技術研究所内 (72)発明者 辻 博和 東京都清瀬市下清戸４丁目640番地 株式 会社大林組技術研究所内 (72)発明者 千野 裕之 東京都清瀬市下清戸４丁目640番地 株式 会社大林組技術研究所内