一种副干酪乳杆菌株LBP-YE01湿粉、其菌液及应用
阅读：978发布：2020-05-08
专利汇可以提供一种副干酪乳杆菌株LBP-YE01湿粉、其菌液及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 一种副干 酪乳 杆菌株LBP-YE01湿粉、其菌液及应用，属于 微 生物 发酵 培养领域。所述湿粉通过下述方法制备：在由大豆渣、糯米和矿泉 水 组成的菌体培养基中、在10℃-20℃的无菌条件下接种副干酪乳杆菌株LBP-YE01培养5天后再转入0℃-5℃的无菌环境中培养60天得到的菌和培养基的混合物即湿粉。所述菌液通过下述方法制备：将副干酪乳杆菌株LBP-YE01湿粉转入无菌培养罐中，加入矿泉水和麦芽糖，在42℃-45℃下培养48H后，过滤后得到菌液。上述湿粉、菌液作为鼻腔清洗液的应用。本发明具有以下优点：可消除鼻黏膜肿胀等 炎症 ，排脓引流、通气止痛；可 预防 病毒感冒、哮喘，愈后不易复发。，下面是一种副干酪乳杆菌株LBP-YE01湿粉、其菌液及应用专利的具体信息内容。
1.一种副干酪乳杆菌株LBP-YE01湿粉，其特征在于，所述副干酪乳杆菌株LBP-YE01湿粉通过下述方法制备：在由大豆渣、糯米和矿泉水组成的菌体培养基中、在10℃-20℃的无菌条件下接种副干酪乳杆菌株LBP-YE01培养5天后再转入0℃-5℃的无菌环境中培养60天得到的菌和培养基的混合物即副干酪乳杆菌株LBP-YE01湿粉；
所述大豆渣、糯米和矿泉水的重量百分比分别为：大豆渣70％、糯米20％和矿泉水
10％。
2.权利要求1所述的副干酪乳杆菌株LBP-YE01湿粉在制备治疗由病毒细菌、变应原以及免疫性失调引起的鼻腔黏膜的炎症药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：副干酪乳杆菌株LBP-YE01湿粉作为鼻腔清洗液的应用。
4.一种副干酪乳杆菌株LBP-YE01菌液，其特征在于，所述副干酪乳杆菌株LBP-YE01菌液通过下述方法制备：将权利要求1所述的副干酪乳杆菌株LBP-YE01湿粉转入无菌培养罐中，加入矿泉水和麦芽糖，在42℃-45℃下培养48H后，过滤后得到副干酪乳杆菌株LBP-YE01菌液；
所述副干酪乳杆菌株LBP-YE01湿粉、矿泉水和麦芽糖之间的重量份为副干酪乳杆菌株LBP-YE01湿粉1份、矿泉水3-30份和麦芽糖0.3-0.5份。
5.根据权利要求3所述的副干酪乳杆菌株LBP-YE01菌液，其特征在于：副干酪乳杆菌株LBP-YE01湿粉、矿泉水和麦芽糖之间的重量份为副干酪乳杆菌株LBP-YE01湿粉1份、矿泉水
5份和麦芽糖0.5份。
6.根据权利要求4或5所述的副干酪乳杆菌株LBP-YE01菌液，其特征在于：每毫升副干酪乳杆菌株LBP-YE01菌液中菌的数量>1.5×108CFU/g。
7.权利要求4～6中任一权利要求所述的副干酪乳杆菌株LBP-YE01菌液在制备治疗由病毒细菌、变应原以及免疫性失调引起的鼻腔黏膜的炎症药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：副干酪乳杆菌株LBP-YE01菌液作为鼻腔清洗液的应用。
一种副干酪乳杆菌株LBP-YE01湿粉、其菌液及应用
技术领域
背景技术
[0003] 绝大数鼻炎病毒感染为首要原因，或者在病毒感染的基础上引发细菌和真菌感染。已知有100多种病毒可引起鼻炎，最常见的是鼻病毒、流感和副流感病毒、腺病毒、冠状病毒及黏液和副黏液病毒。传播方式主要是经过呼吸道吸入，其次是污染体或事物进入机体。另外一些原因是鼻黏膜易感性，主要是抗原物质刺激黏膜组织中的肥大细胞、嗜碱性细胞引起释放化学介质的能力。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于公开了一种副干酪乳杆菌株LBP-YE01湿粉。
[0005] 本发明第二个目的在于公开了上述副干酪乳杆菌株LBP-YE01湿粉的应用。
[0006] 本发明第三个目的在于公开了一种副干酪乳杆菌株LBP-YE01菌液。
[0007] 本发明第四个目的在于公开了上述副干酪乳杆菌株LBP-YE01菌液的应用。
[0008] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0009] 一种副干酪乳杆菌株LBP-YE01湿粉，其中，所述副干酪乳杆菌株LBP-YE01湿粉通过下述方法制备：在由大豆渣、糯米和矿泉水组成的菌体培养基中、在10℃-20℃的无菌条件下接种副干酪乳杆菌株LBP-YE01培养5天后再转入0℃-5℃的无菌环境中培养60天得到的菌和培养基的混合物即副干酪乳杆菌株LBP-YE01湿粉；
[0010] 所述大豆渣、糯米和矿泉水的重量百分比分别为：大豆渣70％、糯米20％和矿泉水10％。
[0012] 上述技术方案所述的应用，其中，副干酪乳杆菌株LBP-YE01湿粉作为鼻腔清洗液的应用。
[0013] 一种副干酪乳杆菌株LBP-YE01菌液，其中，所述副干酪乳杆菌株LBP-YE01菌液通过下述方法制备：将权利要求1所述的副干酪乳杆菌株LBP-YE01湿粉转入无菌培养罐中，加入矿泉水和麦芽糖，在42℃-45℃下培养48H后，过滤后得到副干酪乳杆菌株LBP-YE01菌液；
[0014] 所述副干酪乳杆菌株LBP-YE01湿粉、矿泉水和麦芽糖之间的重量份为副干酪乳杆菌株LBP-YE01湿粉1份、矿泉水3-30份和麦芽糖0.3-0.5份。
[0015] 上述技术方案所述的副干酪乳杆菌株LBP-YE01菌液，其中，副干酪乳杆菌株LBP-YE01湿粉、矿泉水和麦芽糖之间的重量份为副干酪乳杆菌株LBP-YE01湿粉1份、矿泉水5份和麦芽糖0.5份。
[0016] 上述技术方案所述的副干酪乳杆菌株LBP-YE01菌液，其中，每毫升副干酪乳杆菌株LBP-YE01菌液中菌的数量>1.5×108CFU/g。
[0017] 上述技术方案所述的副干酪乳杆菌株LBP-YE01菌液在制备治疗由病毒细菌、变应原以及免疫性失调引起的鼻腔黏膜的炎症药物中的应用。
[0018] 上述技术方案所述的应用，其中，副干酪乳杆菌株LBP-YE01菌液作为鼻腔清洗液的应用。
[0019] 本发明中的副干酪乳杆菌株LBP-YE01的制备、分离和鉴定在申请日为2018年8月8日的申请号为“201810898195.4”、名称为“副干酪乳杆菌株LBP-YE01、其培养物、其菌液、传代菌株挑选和保藏方法及其应用”的申请文件中有记载；也可以按照以下方法进行制备、分离和鉴定：
[0020] 1、野外取样，在我国黑龙江省野外的树林内，在阴暗、潮湿的地方挑选到生成出金针菇的树木或者枯木。在金针菇的根部与树皮和土壤之间的混合培养基中采集100g左右的混合物(不是每次取样都会得到本发明的副干酪乳杆菌株，故而要大量采集、挑选。)[0021] 2、制备样液，此混合物置于1L的锥形瓶内，加入矿泉水500ml带回到微生物实验室内，在室温25℃左右充分搅拌(2H-3H)后，用200目滤布过滤后得到滤液于1L锥形瓶，将此滤液500ml置于100℃水中充分震荡15分钟。
[0023] 4、挑选、纯化在培养皿中观察菌落形态，副干酪乳杆菌在MRS培养基平皿内的形态(如图1所示)，找到此菌落后，用接种环挑取少量菌体至试管MRS斜面培养基上。
[0024] 5、纯培养试管MRS斜面在36±1℃恒温培养箱中，倒置培养72H获得纯培养。
[0025] 6、检测将获得的纯培养的试管MRS斜面送到专门的机构进行菌种测定，评测是否为副干酪乳杆菌种。
[0026] 7、扩培将获得的纯培养菌用接种环接种到大豆渣70％与糯米粉30％的混合培养基中，10-20℃培养20天，再转入0-5℃低温培养180天左右即可。
[0027] 本发明中副干酪乳杆菌株LBP-YE01的鉴定：
[0029] 2、申请人将本发明菌株LBP-YE01在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行保藏，保藏编号为CGMCC No.15360；同时经“中国科学院微生物研究所”进行G+C mol％含量测定，“中国科学院微生物研究所”出具的(2018)微检字第224号检测鉴定报告指出：送检菌种(菌株编号：LBP-YE01)基因组DNA的G+C mol％＝45.28％。由此可见本发明菌株的G+C mol％含量测定为相似度45.28％同一种的不同菌株其G+C mol％小于3％-4％，最高不超过5％。因此报告可说明同种不同株的副干酪乳杆菌。
[0030] 为了保证每一代菌株都有相同的效能，需要对传代菌株进行挑选和保藏，本发明中副干酪乳杆菌株LBP-YE01传代菌株挑选和保藏方法如下：
[0031] 从副干酪乳杆菌株LBP-YE01菌液中取10mL菌液于无菌试管内在100℃水浴中浸泡5分钟后，再移取1mL菌液至无菌平皿内，将冷却至48℃的MRS琼脂培养基倾注于平皿约
15ml，转动平皿混合均匀后在恒温培养箱36±1℃厌氧培养72H；
15ml，转动平皿混合均匀后在恒温培养箱36±1℃厌氧培养72H；
[0032] 培养完成后，取出平皿，在单个菌落中用接种环挑取菌落，采取斜面接种法接种6～10支无菌斜面MRS琼脂培养基试管，接种后的试管斜面放入36±1℃厌氧培养72H后采用标准的真空冷冻干燥保藏法保藏菌种；
[0033] 所述MRS琼脂培养基是通过下述方法制备：将蛋白胨10g、牛肉粉5g、酵母粉4g、葡萄糖20g、吐温80 1mL、K2HPO4·7H2O 2g、醋酸钠·3H2O 5g、柠檬酸三铵2g、MgSO4·7H2O 0.2g、MgSO4·4H2O 0.05g和琼脂粉15g加入到1000mL蒸馏水中，加热溶解，调节pH至6.2±
0.2，分装后121℃高温灭菌15min～20min。
0.2，分装后121℃高温灭菌15min～20min。
[0034] 传代菌株挑选和保藏中使用的斜面接种方法：斜面接种是从已长好的菌种平板上挑取少量菌种移植到一支新鲜斜面培养基上的一种接种方法。在菌种扩大培养和菌种保藏时常采用斜面接种法，斜面接种使用的接种工具为接种环。
[0035] 传代菌株挑选和保藏中使用的真空冷冻干燥保藏法：使微生物在低温(-70℃左右)下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分，使菌种始终处于低温、干燥、缺氧的条件下，是迄今为止最有效的菌种保藏方法。具体操作细则：所用的菌种要注意其纯度，不能有杂菌污染，用无菌吸管吸取2～3ml脱脂牛奶加到待保藏的菌种斜面内，用接种环将菌苔刮下，轻轻搅动，使其均匀的悬浮在牛奶内成菌悬液，注意切勿将琼脂刮到牛奶中。
[0036] 本发明具有以下有益效果：
[0037] 1、本发明的湿粉和菌液对各种由于病毒细菌、变应原以及免疫性失调引起的鼻腔黏膜的炎症，如慢性鼻炎、急性鼻炎、鼻咽部发炎、灼热感、鼻内发痒频打喷嚏、鼻噻、流鼻血等萎缩性鼻炎均有明显疗效，无痛、见效快，可迅速起到消除鼻黏膜肿胀等炎症，排脓引流、通气止痛作用。
[0039] 1.图1为副干酪乳杆菌在MRS培养基平皿内的菌落图。
[0040] 2.图2为在3000—4000倍的显微镜上观测的副干酪乳杆菌的形态。
[0041] 菌株保藏信息：本发明副干酪乳杆菌株LBP-YE01，分类命名为副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei，已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行保藏，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.15360，保藏日期为2018年2月27日。具体实施方式：
[0042] 为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体实施例对本发明一种副干酪乳杆菌株LBP-YE01湿粉、其菌液及应用作进一步的说明。
[0043] 实施例1：副干酪乳杆菌株LBP-YE01湿粉的制备：
[0044] 称取大豆渣70g、糯米20g和矿泉水10g混匀，制成菌体培养基；在15℃的无菌条件下在菌体培养基中接种副干酪乳杆菌株LBP-YE01，培养5天后再转入1℃的无菌环境中培养60天得到的菌和培养基的混合物即副干酪乳杆菌株LBP-YE01湿粉。
[0045] 实施例2：副干酪乳杆菌株LBP-YE01培养物的制备：
[0046] 本实施例与实施例1相同，区别在于：在10℃的无菌条件下在菌体培养基中接种副干酪乳杆菌株LBP-YE01，培养5天后再转入5℃的无菌环境中培养60天得到的菌和培养基的混合物即副干酪乳杆菌株LBP-YE01湿粉。
[0047] 实施例3：副干酪乳杆菌株LBP-YE01培养物的制备：
[0048] 本实施例与实施例1相同，区别在于：在20℃的无菌条件下在菌体培养基中接种副干酪乳杆菌株LBP-YE01，培养5天后再转入0℃的无菌环境中培养60天得到的菌和培养基的混合物即副干酪乳杆菌株LBP-YE01湿粉。
[0049] 实施例4：副干酪乳杆菌株LBP-YE01菌液的制备：
[0050] 将实施例1制备得到的副干酪乳杆菌株LBP-YE01湿粉转入无菌培养罐中，加入矿泉水和麦芽糖，在42℃下培养48H后，过滤后得到副干酪乳杆菌株LBP-YE01菌液；
[0051] 所述副干酪乳杆菌株LBP-YE01湿粉、矿泉水和麦芽糖之间的重量关系为副干酪乳杆菌株LBP-YE01湿粉1kg、矿泉水5kg、麦芽糖0.5kg。
[0052] 实施例5：副干酪乳杆菌株LBP-YE01菌液的制备：
[0053] 将实施例2制备得到的副干酪乳杆菌株LBP-YE01湿粉转入无菌培养罐中，加入矿泉水和麦芽糖，在45℃下培养48H后，过滤后得到副干酪乳杆菌株LBP-YE01菌液；
[0054] 所述副干酪乳杆菌株LBP-YE01湿粉、矿泉水和麦芽糖之间的重量关系为副干酪乳杆菌株LBP-YE01湿粉1kg、矿泉水15kg、麦芽糖0.4kg。
[0055] 实施例6：副干酪乳杆菌株LBP-YE01菌液的制备：
[0056] 将实施例3制备得到的副干酪乳杆菌株LBP-YE01湿粉转入无菌培养罐中，加入矿泉水和麦芽糖，在44℃下培养48H后，过滤后得到副干酪乳杆菌株LBP-YE01菌液；
[0057] 所述副干酪乳杆菌株LBP-YE01湿粉、矿泉水和麦芽糖之间的重量份为副干酪乳杆菌株LBP-YE01湿粉1kg、矿泉水20kg、麦芽糖0.3kg。
[0058] 以下通过具体实验例来说明本发明副干酪乳杆菌株LBP-YE01菌液在治疗鼻炎上所具有的有益效果：
[0059] 本发明的抑菌实验中的有害菌是我们最常见的有害细菌，鼻腔中也经常会吸入这些有害细菌，比如说金黄色葡萄球菌。其实绝大部分鼻炎的病因都是由于病毒感染或者病毒感染后引起细菌或真菌在鼻腔内黏膜感染导致的。本发明一种副干酪乳杆菌株LBP-YE01湿粉、其菌液作为鼻腔清洗液的治疗原理就是灭杀和抑制鼻腔内有害菌(金黄色葡萄球菌、革兰阴性细菌、厌氧球菌等)对鼻腔黏膜的感染，保护有益菌在鼻腔内生存，进而促进免疫系统正常工作达到治疗鼻炎的效果。
[0060] 试验例1：副干酪乳杆菌LBP-YE01菌液的抑菌性能测试：
[0061] 一、材料
[0062] 1、菌种：
[0063] 大肠癌埃希氏菌CMCC44496、沙门氏菌CMCC50041、金黄色葡萄球菌26003、单增李斯特菌54001、蜡样芽孢杆菌D1、宋内志贺氏菌ATCC29930、阪崎肠杆菌CMCC45401、铜绿假单胞杆菌CMCC10104
[0064] 2、培养基：
[0065] MRS培养基是通过下述方法制备：将蛋白胨10g、牛肉粉5g、酵母粉4g、葡萄糖20g、吐温80 1mL、K2HPO4·7H2O 2g、醋酸钠·3H2O 5g、柠檬酸三铵2g、MgSO4·7H2O0.2g、MgSO4·4H2O 0.05g和琼脂粉15g加入到1000mL蒸馏水中，加热溶解，调节pH至6.2±0.2，分装后121℃高温灭菌15min～20min。
[0066] 营养肉汤培养基
[0067] 成分：蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、蒸馏水1000mL，pH7.4。
[0068] 3、试剂：
[0069] 胃蛋白酶/胰蛋白酶/木瓜蛋白酶/过氧化氢酶(分析纯)，蛋白酶K(分析纯)，葡萄糖(分析纯)，蛋白胨/牛肉粉/酵母粉(生化试剂)，磷酸氢二钾/柠檬酸三铵(分析纯)，醋酸钠(分析纯)，硫酸镁/吐温80(分析纯)，硫酸锰(分析纯)。
[0070] 4、主要仪器与设备：
[0071] 数显酸度计PH350(上海精密科学仪器有限公司)，生物安全柜BSC-1000A2(苏净集团安泰公司)，DNP-9272型生化培养箱(上海申贤恒温设备厂)，Agilent 1260型高效液相色谱(美国安捷伦公司)，DSX-280B立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)。
[0072] 二、实验方法：
[0073] 1、预处理：
[0074] 1.1、指示菌液的设备：
[0075] 将指示菌接种于营养汤培养基中，37℃过夜培养，用于涂布，进行抑菌实验。
[0076] 1.2、供试菌发酵液的制备：
[0077] 将副干酪乳杆菌LBP-YE01接种于MRS液体培养基中，37℃培养24h，得到试验所用发酵液。
[0078] 1.3、供试菌无菌发酵滤液的制备：
[0079] 将1.2节中所得发酵液进行离心(4500r/min，10min)，上清液用0.22μm微孔过滤膜过滤除菌，所得滤液即为供试菌的无菌发酵滤液。
[0080] 1.4、供试菌菌体的制备：
[0081] 将1.3节中离心后所得菌体沉淀用无菌PBS洗涤3遍后重悬，得到实验所用的菌体悬液。
[0082] 2、抑菌活性测定：
[0083] 选用牛津杯法对副干酪乳杆菌LEB-YE01的发酵液、无菌发酵滤液及菌体进行抑菌活性测定，根据抑菌圈直径大小来评价抑菌效果。
[0084] 试验所选用的指示菌如下：单增李斯特54001，阪崎肠杆菌CMCC45401，金黄色葡萄球菌26003，沙门氏菌CMCC50041，宋内志贺氏菌ATCC29930，蜡样芽孢杆菌D1，大肠埃希氏菌CMCC44496，铜绿假单胞杆菌CMCC10104。
[0085] 3、无菌发酵过滤液的抑菌作用：
[0086] 以大肠埃希氏菌CMCC44496，金黄色葡萄球菌26003，单增李斯特54001，宋内志贺氏菌ATCC29930为指示菌，用无菌发酵滤液进行培养。为了测定发酵过程中产生的乳酸及MRS培养基pH的改变对致病菌活性的影响，用无菌发酵滤液(pH6.2)、MRS液体培养基(补充与无菌发酵滤液中相同量的乳酸)、MRS液体培养基来培养上述指示菌。利用高效液相色谱来测定无菌发酵滤液中乳酸的含量。指示菌过夜培养后以体积分数为1％的接种量接种到上述四种培养基中，37℃恒温培养，分别去0、1、2、3、4h取样，采用胰蛋白胨大豆琼脂培养基进行平板计数。
[0088] 样品分别在60、80和100℃水浴中处理20min，121℃高压蒸汽处理20min，设置空白对照。以大肠埃希氏菌CMCC44496，宋内志贺氏菌ATCC29930，金黄色葡萄球菌26003，单增李斯特54001，为指示菌，副干酪乳杆菌LBP-YE01为供试菌，采用牛津杯法进行抑菌活性测定。
[0089] 三、结果与分析:
[0090] 1、抑菌活性测定:
[0091] 由表1可以看出，副干酪乳杆菌LBP-YE01的发酵菌液及无菌发酵滤液对所有指示菌包括革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌均有较好的抑制作用，而菌体对所有指示菌均无抑菌作用。MRS液体培养基没有抑菌作用(结果未显示)。发酵菌液比无菌发酵滤液对所有指示菌有更强的抑菌效果。
[0092] 表1副干酪乳杆菌LBP-YE01抑菌活性测定
[0093]
[0094] 2、无菌发酵滤液的抑菌作用:
[0095] 副干酪乳杆菌LBP-YE01在MRS液体培养基中培养24h后，MRS液体培养基的pH值由6.2降低至3.62，乳酸的浓度达到157.34mM。为了考察发酵过程中产生的乳酸及MRS液体培养基pH的变化对致病菌的活性是否有影响，用无菌发酵滤液(pH6.2)及MRS液体培养基(补充有157.34mM的乳酸)分别培养致病菌。在无菌发酵滤液中作用1h后，大肠埃希氏菌CMCC44496，单增李斯特54001和宋内志贺氏菌ATCC29930的活菌数降低了1.7-1.9lgCFU/mL，金黄色葡萄球菌26003丧失活性。当无菌发酵滤液的pH植调整至6.2时，相同时间点致病菌的活菌数与MRS液体中相比无显著性差异(p>0.05)，说明无菌发酵滤液的抑菌活性与其pH植有关。
[0096] 补充有157.34mM乳酸的MRS液体培养基中的致病菌的活菌数较MRS液体培养基中显著降低，说明副干酪乳杆菌LBP发酵过程中产生的乳酸是产生抑菌活性的因素之一。
[0097] 补充有157.34mM乳酸的MRS液体培养基比无菌发酵滤液对四株致病菌有更强的抑制作用，可能是因为MRS液体培养基中非解离乳酸的量比无菌发酵滤液中多。
[0098] 3、热处理对无菌发酵滤液抑菌活性的影响:
[0099] 表2结果显示，无菌发酵滤液经过4种温度条件处理后，其对致病菌的抑菌活性与对照组相比无显著性差异(P>0.05)，说明副干酪乳杆菌LBP-YE01产生的抑菌物质对热不敏感。
[0100] 表2热处理对无菌发酵滤液抑菌活性的影响
[0101]
[0102] 四、实验结果表明：
[0103] 副干酪乳杆菌LBP-YE01的发酵液及无菌发酵滤液的抑菌谱广泛，对革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌均具有较好的抑菌活性。发酵过程中乳酸的产生及发酵液pH的降低是主要的抑菌因素。抑菌物质具有热稳定性。
[0104] 以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
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