技术领域
[0001] 本
发明涉及
微生物技术领域，具体是指一种己酸菌的常温保藏方法。
背景技术
[0002] 微生物菌种保藏技术是微生物领域一种
基础且重要的技术，在微生物实验及实际应用中必不可少。目前，常用的菌种保藏方法主要有传代培养保藏法、液体
石蜡覆盖保藏法、载体保藏法、寄主保藏法、冷冻保藏法等，这些方法普遍存在的一个特点就是需要低温或者超低温保藏菌株。在低温保藏菌株的过程中，使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，从而实现菌株较长时间的保藏。但目前这些低温或超低温保藏方法不可避免的存在以下几点问题：
[0003] (1)低温对菌株细胞壁和胞内溶质有一定的损伤，极大的降低了菌株的生命活
力和功能性活力。己酸菌这种对环境要求极为苛刻的菌种在低温保藏后存活率变得极低，很难通过活化实现菌株的再培养和复壮。
[0004] (2)低温保藏对设备要求高，例如液氮保藏法需购置超低温液氮设备，冷冻保藏法需使用-80℃超低温
冰箱。这种方法使得菌种保藏成本增加很多，同时也受到设备使用的限制。
[0005] (3)冷冻保藏的菌株再次使用时需要活化和复壮，对于厌
氧菌而言，操作过程更繁琐，而且易活化失败，耗时长，影响实验进度。
[0006] 己酸菌是浓香型白酒生产中非常重要的产酸微生物，由它代谢产生的己酸与大曲
发酵产生的酒精生成己酸乙酯，是浓香型大曲酒的主体
香味成分。目前，对于己酸菌的保藏方法主要有
冷冻干燥保藏、液体石
蜡油保藏、斜面试管保藏等。这些方法都需低温保藏，但没有
预防低温对细胞造成的损害，如果能够实现己酸菌的常温保藏，不仅可以避免在低温冷冻保藏过程中的细胞壁受损问题，还可以降低保藏成本和对技术设备的要求。
发明内容
[0007] 为解决己酸菌在低温冷冻保藏中存在的易受损、难活化、技术设备要求高等问题，本发明提供了一种全新的己酸菌的常温保藏方法，旨在通过改良培养基，添加保护剂，使用除氧剂的方式，最终实现己酸菌的常温保藏。本发明所提供的菌种保藏方法对于那些具有厌氧菌基本培养设施的实验室即可应用。它对技术设备要求低，投资小，保藏条件较温和，适宜在实验室中使用。
[0008] 为实现上述目的，本发明提供的厌氧菌株常温保藏的方法，主要包括以下步骤：无氧培养基的配制、待保藏菌液的富集、待保藏菌种的密封和常温保藏、保藏菌种的复苏：
[0009] 步骤1：无氧液体培养基的配方(改良ES培养基)
[0010] 根据待保藏厌氧菌生长所需要的营养成分配制新鲜的液体培养基，调到合适的pH值，排除培养基中的氧气，高温灭菌冷却后即可获得无氧液体培养基；
[0011] 改良ES培养基配方：
乙醇20ml，
硫酸铵0.5g，乙酸钠5g，
磷酸氢二
钾0.4g，
硫酸镁0.2g，
碳酸
钙10g，
酵母膏1g，窖泥浸提液20ml-30ml，还原剂0.5g-3g，刃天青0.03g-0.07g，蒸馏
水1000ml；调节pH至5-7：
[0012] ①所述窖泥浸提液是通过如下方法获得：新鲜老窖泥与去离子水按照
质量体积比1:5(w/v)混合均匀，放置2h，隔半小时搅拌一次，于10000r/min离心10min，吸取上清液即得窖泥浸提液。
[0013] ②乙醇单独灭菌，接菌前添加。
[0014] ③还原剂为L-半胱
氨酸
盐酸盐或Na2S。
[0015] ④碳酸钙须干热单独灭菌。
[0016] 步骤2：待保藏菌液的富集
[0017] 步骤1所配制的培养基、碳酸钙、乙醇经115℃高温灭菌20分钟，取出后在无菌操作台中操作，先加入碳酸钙，混匀，接入己酸菌，接菌量为培养液体积的10％，混匀，加入乙醇，混匀，用小锥形瓶盛装菌液，菌液添加至稍超出量程刻度线，目的是减少
瓶口空气残留，接菌后使用氮吹装置除氧。小锥形瓶用三孔胶塞密封，进气孔插入一根90°弯曲的玻璃
导管，外端口连接
橡胶管，夹带止气
阀，发酵栓孔插入发酵栓，出气孔插入同进气孔一样的装置，培养基进气端所连接的胶管需附加0.22μm的微孔空气滤膜，隔除空气中的微生物。氮吹除氧前先堵塞插在发酵栓孔的发酵栓，氮气从进气孔进，出气孔出，除氧结束后关闭两端的止气阀，接菌后的菌液放入34℃恒温
培养箱培养两天，得到富集菌液。
[0018] 步骤3：待保藏菌种的密封和常温保藏
[0019] (1)步骤1中窖泥经去离子水清洗离心，上清液用于配制培养基，窖泥取出放入105℃烘箱烘干6h。
[0020] (2)烘干的窖泥经机械磨粉过100目筛，用密封袋
包装，外层再用报纸包裹，121℃灭菌30分钟，取出放入30℃恒温培养箱放置一天，再重复以上操作进行二次灭菌。
抽取部分窖泥进行微生物培养，观察是否有活菌残留，若有，则进行第三次灭菌，重复操作。将灭菌处理的窖泥取适量加入经灭菌处理过的菌种保藏管，将步骤2富集培养的菌液离心弃去上清液，留下的菌株用接种环取菌加入窖泥，搅拌混匀，使窖泥将菌株包埋，并用工具
压实压紧，挤出空气。
[0021] (3)加入液体石蜡密封。
[0022] (4)将菌种保藏管置于密封袋中，加入除氧剂，抽
真空密封。
[0023] (5)除氧剂配方：焦性
没食子酸，碳酸钾，
活性炭的质量比例为1:2.5:2.5。
[0024] 步骤4：保藏菌种的复苏
[0025] 使用菌种时，将保藏管取出，直接将窖泥菌种接入液体培养基，按照步骤2除氧处理，恒温培养2d配成
种子液，备后续使用，无须多次传代再活化，可直接使用且仍保持原有性状和活力。
[0026] 与
现有技术相比，本发明的优点及有益效果如下：
[0027] (1)本发明除恒温培养箱外，不需要特殊的菌种保藏设备，实验操作简单易行。
[0028] (2)保藏的菌株取出后不需要多次传代培养，可直接使用，不仅节省了传代时间也简化了实验操作流程。保藏菌株可直接接入种子液富集培养，且活力依然旺盛。
[0029] (3)本发明对无氧液体培养基做了优化改良，并使用处理后的新鲜窖泥作为菌株保藏保护剂，窖泥将菌体
吸附，提供干燥无氧环境，泥土自身松软结构也会吸附菌株自身不耐受的副代谢产物，从而起到缓冲的效果让菌株在常温状态下代谢活力降到最低，从而延长常温保藏时间。
[0030] (4)己酸菌在一般厌氧培养基(ES培养基)上生长繁殖极其缓慢，若除氧条件不佳，
营养液配方不合适，生长约一周之后才开始产气，是正常己酸菌生长周期的两到三倍，优化改良后的培养基可明显缩短菌株生长周期。
附图说明
[0032] 图2为本发明的除氧发酵示意图。
[0033] 图中：1、进气孔，2、发酵栓孔，3、出气孔。
具体实施方式
[0034] 下面结合
实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式包括但不限于此。
[0035] 下述实施例中所用的材料：
[0036] 新鲜窖泥取自黄鹤楼酒业有限公司，菌种为实验室保藏的己酸菌。
[0037] 实施例1：
[0038] 1、取新鲜窖泥100g，加入去离子水500ml，混合均匀，放置2h，隔半小时搅拌一次，于10000r/min离心10min，吸取上清液即得窖泥浸提液。
[0039] 2、离心后的窖泥放入105℃烘箱烘干6h，机械磨粉过100目筛，用密封袋包装，外层再用报纸包裹，121℃灭菌30分钟，取出放入30℃恒温培养箱放置一天，再重复以上操作进行二次灭菌，取1g窖泥溶于100ml蒸馏水，再吸取1ml窖泥水溶液置于ES固体培养基上，培养皿涂布培养34℃2d，无微生物生长。窖泥菌种保护剂可以使用。
[0040] 3、称取硫酸铵0.5g，乙酸钠5g，
磷酸氢二钾0.4g，硫酸镁0.2g，酵母膏1g，窖泥浸提液20ml，L-半胱氨酸盐酸盐1g，刃天青0.03g，加蒸馏水定容到1000mL，混匀，使
试剂全部溶解，分装入100ml锥形瓶，每瓶装培养基100ml，调节pH＝5。单独称取碳酸钙10g，量取乙醇20ml，发酵栓，玻璃导管，三孔胶塞，0.22μm的微孔空气滤膜，止气阀，橡胶管，实验器材需用报纸包裹，同培养基一起灭菌，115℃，20min。
[0041] 4、灭菌结束后，将药品和器材放入无菌操作台，向液体培养基加入碳酸钙和乙醇，混匀，接菌。盖上胶塞，插入玻璃导管和发酵栓，保证
密封性良好。按照步骤2的操作进行氮吹除氧，待培养基
颜色由粉红色变为培养基颜色(黄褐色)则除氧干净。
[0042] 5、将种子液放入34℃恒温培养箱培养2d，富集培养，观察产气情况判断菌的长势。
[0043] 6、准备灭好菌的离心管，倒入菌液离心，弃去上清液。向菌种保藏管中加入处理过的窖泥粉末，接入菌种，倒入液体石蜡密封。放入密封袋，加入步骤3中的除氧剂，抽真空恒温保藏。
[0044] 7、保藏数月后按照步骤4进行菌种复苏，检测活力和性状。
[0045] 实施例2：
[0046] 1、取新鲜窖泥100g，加入去离子水500ml，混合均匀，放置2h，隔半小时搅拌一次，于10000r/min离心10min，吸取上清液即得窖泥浸提液。
[0047] 2、离心后的窖泥放入105℃烘箱烘干6h，机械磨粉过100目筛，用密封袋包装，外层再用报纸包裹，121℃灭菌30分钟，取出放入30℃恒温培养箱放置一天，再重复以上操作进行二次灭菌，取1g窖泥溶于100ml蒸馏水，再吸取1ml窖泥水溶液置于ES固体培养基上，培养皿涂布培养34℃2d，无微生物生长。窖泥菌种保护剂可以使用。
[0048] 3、称取硫酸铵0.5g，乙酸钠5g，磷酸氢二钾0.4g，硫酸镁0.2g，酵母膏1g，窖泥浸提液25ml，Na2S0.5g，刃天青0.05g，加蒸馏水定容到1000mL，混匀，使试剂全部溶解，分装入100ml锥形瓶，每瓶装培养基100ml，调节pH＝6。单独称取碳酸钙10g，量取乙醇20ml，发酵栓，玻璃导管，三孔胶塞，0.22μm的微孔空气滤膜，止气阀，橡胶管，实验器材需用报纸包裹，同培养基一起灭菌，115℃，20min。
[0049] 4、灭菌结束后，将药品和器材放入无菌操作台，向液体培养基加入碳酸钙和乙醇，混匀，接菌。盖上胶塞，插入玻璃导管和发酵栓，保证密封性良好。按照步骤2的操作进行氮吹除氧，待培养基颜色由粉红色变为培养基颜色(黄褐色)则除氧干净。
[0050] 5、将种子液放入34℃恒温培养箱培养2d，富集培养，观察产气情况判断菌的长势。
[0051] 6、准备灭好菌的离心管，倒入菌液离心，弃去上清液。向菌种保藏管中加入处理过的窖泥粉末，接入菌种，倒入液体石蜡密封。放入密封袋，加入步骤3中的除氧剂，抽真空恒温保藏。
[0052] 7、保藏数月后按照步骤4进行菌种复苏，检测活力和性状。
[0053] 实施例3：
[0054] 1、取新鲜窖泥100g，加入去离子水500ml，混合均匀，放置2h，隔半小时搅拌一次，于10000r/min离心10min，吸取上清液即得窖泥浸提液。
[0055] 2、离心后的窖泥放入105℃烘箱烘干6h，机械磨粉过100目筛，用密封袋包装，外层再用报纸包裹，121℃灭菌30分钟，取出放入30℃恒温培养箱放置一天，再重复以上操作进行二次灭菌，取1g窖泥溶于100ml蒸馏水，再吸取1ml窖泥水溶液置于ES固体培养基上，培养皿涂布培养34℃2d，无微生物生长。窖泥菌种保护剂可以使用。
[0056] 3、称取硫酸铵0.5g，乙酸钠5g，磷酸氢二钾0.4g，硫酸镁0.2g，酵母膏1g，窖泥浸提液30ml，Na2S2g，刃天青0.07g，加蒸馏水定容到1000mL，混匀，使试剂全部溶解，分装入100ml锥形瓶，每瓶装培养基100ml，调节pH＝7。单独称取碳酸钙10g，量取乙醇20ml，发酵栓，玻璃导管，三孔胶塞，0.22μm的微孔空气滤膜，止气阀，橡胶管，实验器材需用报纸包裹，同培养基一起灭菌，115℃，20min。
[0057] 4、灭菌结束后，将药品和器材放入无菌操作台，向液体培养基加入碳酸钙和乙醇，混匀，接菌。盖上胶塞，插入玻璃导管和发酵栓，保证密封性良好。按照步骤2的操作进行氮吹除氧，待培养基颜色由粉红色变为培养基颜色(黄褐色)则除氧干净。
[0058] 5、将种子液放入34℃恒温培养箱培养2d，富集培养，观察产气情况判断菌的长势。
[0059] 6、准备灭好菌的离心管，倒入菌液离心，弃去上清液。向菌种保藏管中加入处理过的窖泥粉末，接入菌种，倒入液体石蜡密封。放入密封袋，加入步骤3中的除氧剂，抽真空恒温保藏。
[0060] 7、保藏数月后按照步骤4进行菌种复苏，检测活力和性状。
[0061] 表1不同保藏时期菌种活力检测
[0062] 菌株/保藏时间 1个月 2个月 3个月 4个月 5个月 6个月己酸菌(个/ml) 3×107 0.7×107 0.1×107 4×105 0.5×105 0.9×104
