裂殖壶菌及其高密度发酵生产DHA的方法
阅读：608发布：2022-10-06
专利汇可以提供裂殖壶菌及其高密度发酵生产DHA的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一株裂殖壶菌，该菌株为裂殖壶菌（Shizochytrium sp.）WZU6961，保藏于中国 微 生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.6369。本发明还公开了上述裂殖壶菌高 密度 发酵 生产DHA的方法。以裂殖壶菌WZU6961高密度发酵生产DHA，得到的发酵液中生物量浓度92.4~103.2g/L，生物量中DHA含量20.9%~21.9%，DHA生产率达到7.2~8.5g/(L·d)，高于 现有技术 ，有利于裂殖壶菌发酵生产DHA的产业化。，下面是裂殖壶菌及其高密度发酵生产DHA的方法专利的具体信息内容。
1.一株裂殖壶菌，其特征在于，该菌株为裂殖壶菌（Shizochytrium sp.）WZU6961，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 6369。
2.权利要求1所述的裂殖壶菌高密度发酵生产DHA的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）种子活化：a、将所述裂殖壶菌WZU6961转接入活化培养基的琼脂平板，加人工海水封盖，活化，得封盖海水；b、取步骤a得到的封盖海水转接入活化培养基，培养；c、取步骤b得到的菌种液，转接入活化培养基，培养；d、取步骤c得到的菌种液，转接入活化培养基，培养，得活化菌种；
2）种子培养：将步骤1）得到的活化菌种转接入种子培养基，通入无菌空气，培养，得种子培养物；
3）发酵生产：将步骤2）得到的种子培养物转接入发酵培养基，通入无菌空气，流加葡萄糖以维持其浓度在5 ~ 30 g/L；调节通气量和搅拌转速以维持DO值在4% ~ 40%，发酵60 ~ 64 hr放罐，即得。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1）a中活化条件：20℃ ~ 30℃活化
2 ~ 6 d。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1）b中：取步骤a得到的封盖海水以体积比5% ~ 10%的接种量转接入活化培养基，培养温度20℃ ~ 30℃，培养时间24 ~ 48 hr。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1）c中：取步骤b得到的菌种液体积比5% ~ 15%的接种量转接入活化培养基，培养温度20℃ ~ 30℃，培养时间24 ~ 48 hr。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1）d中：取步骤c得到的菌种液体积比5% ~ 15%的接种量转接入活化培养基，培养温度20℃ ~ 30℃，培养时间24 ~ 48 hr。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2）中将步骤1）所得活化菌种按体积比5% ~ 15%的接种量转接入种子培养基，通入无菌空气，培养温度20℃ ~ 30℃，通气量
5 ~ 50 L/min，搅拌转速250 ~ 450 rpm，培养时间24 ~ 60 hr，得种子培养物。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤3）中将步骤2）得到的种子培养物按体积比5% ~ 15%的接种量转接入发酵培养基，初始搅拌转速50 ~ 450 rpm，通入无菌空气，初始通气量5 ~ 450 L/min，流加葡萄糖以维持其浓度在5 ~ 30 g/L；调节通气量和搅拌转速以维持DO值在4% ~ 40%，发酵60 ~ 64 hr放罐，即得。
9.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤1）中所述活化培养基的配方：10 ~ 30 g/L葡萄糖、2 ~ 8 g/L酵母粉和2 ~ 8 g/L大豆蛋白胨，用人工海水配制；步骤2）中所述种子培养基的配方：20 ~ 40 g/L葡萄糖、5 ~ 15 g/L酵母粉、2 ~ 8 g/L大豆蛋白胨、1 ~
3 g/L玉米浆，用人工海水配制；步骤3）中所述发酵培养基的配方：20 ~ 40 g/L葡萄糖、5 ~ 15 g/L酵母粉、2 ~ 8 g/L大豆蛋白胨、1 ~ 3 g/L玉米浆，营养液5 ~ 15 mL/L，其中，所述营养液的配方：1.5 ~ 3.5 mg/L肌醇、0.05 ~ 0.15 mg/L硫胺素、0.05 ~ 0.15 mg/L钴胺素、0.05 ~ 0.15 mg/L泛酸钙、0.05 ~ 0.15 mg/L烟酸、0.05 ~ 0.15 mg/L核黄素、0.025 ~ 0.075 mg/L生物素，用人工海水配制。
10.根据权利要求2 ~ 9任一项所述的方法，其特征在于，所述人工海水由如下浓度的成分构成：Na2SO4 24g/L、MgSO4·7H2O 4 g/L、K2H2PO4 2 g/L、(NH4)2SO4 2 g/L、K2SO4 1.3 g/L、KCl 1 g/L、CaCl2·2H2O 0.34 g/L、FeSO4·7H2O 20 mg/L、MnCl2·4H2O 6 mg/L、ZnSO4·7H2O
6 mg/L、CuSO4·5H2O 4 mg/L、NiSO4·6H2O 4 mg/L、CoCl2·6H2O 0.08 mg/L、Na2MoO4·2H2O
0.08 mg/L。
裂殖壶菌及其高密度发酵生产DHA的方法
技术领域
背景技术
[0002] 二十二碳六烯酸（DHA，C22:6-4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z）是大脑、视网膜的重要结构物质，还能够调节中枢神经系统功能、预防和治疗心血管疾病、消除炎症、抑制癌症。长期以来，DHA的主要来源是从鲱鱼、鲭鱼、鲑鱼和鳁鱼等富含油脂的鱼类中提取出来的鱼油。鱼油带着浓烈的、难闻的、特征性的海腥味，其品质因提取鱼油所用的鱼种及捕捞季节和地点的不同而差异很大，还因环境污染而降低，在食品和医药中的应用因而受到严重限制。鱼油所含的脂肪酸很复杂，其链长和饱和度各不相同，从中提取和纯化DHA的成本很高。人们因此需要寻找替代来源（Sijtsma L, et al. Appl Microbiol Biotechnol, 2004, 64:
146 – 153）。裂殖壶菌（Schizochytrium）无论在实验中还是商业上都是DHA的卓越生产者（Bailey R B, et al. US Patent 6607900, 2003）。它不致病、不产毒，人类通过食物链中的贻贝和蛤直接摄食之，美国FDA将其列为公认安全级（GRAS，Generally Recognized as Safe）。自上个世纪90年代FAO和WHO等机构推荐在婴、幼儿食品配方中添加DHA以来，裂殖壶菌发酵生产DHA受到更加广泛的关注，技术水平不断提高。
146 – 153）。裂殖壶菌（Schizochytrium）无论在实验中还是商业上都是DHA的卓越生产者（Bailey R B, et al. US Patent 6607900, 2003）。它不致病、不产毒，人类通过食物链中的贻贝和蛤直接摄食之，美国FDA将其列为公认安全级（GRAS，Generally Recognized as Safe）。自上个世纪90年代FAO和WHO等机构推荐在婴、幼儿食品配方中添加DHA以来，裂殖壶菌发酵生产DHA受到更加广泛的关注，技术水平不断提高。
[0003] S. limacinum SR21培养5 d，DHA生产率0.8 g/(L·d)（Yokochi T, et al. Appl Microbiol Biotechnol, 1998, 49: 72 – 76）。S. mangrovei Raghu Kumar培养107 hr，DHA生产率0.5 g/(L·d)（Bowles R D, et al. J Biotechnol, 1999, 70: 193 – 202）。一株S. mangrovei 培养52 hr，DHA生产率1.27 g/(L·d)（Fan K W, et al. J Ind Microbiol Biotechnol, 2001, 70: 199 – 202）。S. aggregatum ATCC 28209培养
96 hr，DHA生产率3.42 g/(L·d)（姜悦, 等. 中国专利1218035C, 2005）。S. limacinum OUC88培养5 d，DHA生产率1.65 g/(L·d)（张学成, 等. 中国专利1264967C, 2006）。S. limacinum G13/2S培养110 hr（葡萄糖初始浓度150 g/L，60 hr后再添加65 g/L），DHA生产率3 g/(L·d)（Ganuza E, et al. Biotechnol Lett, 2008, 30: 1559 – 1564）。S. WZU4771培养5 d，DHA生产率2.76 g/(L·d)（赵肖为, 等. 中国专利100503811C, 2009）。
一株裂殖壶菌培养5 d（葡萄糖初始浓度125 g/L，降至10 g/L时流加葡萄糖以维持其浓度在10 ~ 20 g/L），DHA生产率1.66 g/(L·d)（陈丽珠, 等. 厦门大学学报: 自然科学版, 2009, 48(1): 84 – 88）。S. CCTCC M209059在5000 L发酵罐中培养5 d（葡萄糖初始浓度100 g/L，降至10 ~ 20 g/L时流加葡萄糖以维持其浓度在50 ~ 100 g/L），DHA生产率2.59 g/(L·d)（黄和, 等. 中国专利101575584B, 2010）；在1000 L发酵罐中培养
132 hr（葡萄糖初始浓度40 g/L，降至15 g/L时流加葡萄糖以维持其浓度在15 ~ 40 g/L），DHA生产率2.86 g/(L·d)（Ren L J, et al. Appl Microbiol Biotechnol, 2010）。
S. limacinum ATCC 20888在500 L发酵罐中培养90 hr（葡萄糖初始浓度45 g/L，降至
35 g/L时流加葡萄糖），DHA生产率4.86 g/(L·d)（徐从英, 等. 中国专利101519676B,
2011）。一株裂殖壶菌在8000 L发酵罐中培养5 d（葡萄糖初始浓度120 g/L，然后流加葡萄糖以维持其浓度在8 ~ 10 g/L），DHA生产率6 g/(L·d)（钟惠昌, 等. 中国专利
101812484B, 2012）。
96 hr，DHA生产率3.42 g/(L·d)（姜悦, 等. 中国专利1218035C, 2005）。S. limacinum OUC88培养5 d，DHA生产率1.65 g/(L·d)（张学成, 等. 中国专利1264967C, 2006）。S. limacinum G13/2S培养110 hr（葡萄糖初始浓度150 g/L，60 hr后再添加65 g/L），DHA生产率3 g/(L·d)（Ganuza E, et al. Biotechnol Lett, 2008, 30: 1559 – 1564）。S. WZU4771培养5 d，DHA生产率2.76 g/(L·d)（赵肖为, 等. 中国专利100503811C, 2009）。
一株裂殖壶菌培养5 d（葡萄糖初始浓度125 g/L，降至10 g/L时流加葡萄糖以维持其浓度在10 ~ 20 g/L），DHA生产率1.66 g/(L·d)（陈丽珠, 等. 厦门大学学报: 自然科学版, 2009, 48(1): 84 – 88）。S. CCTCC M209059在5000 L发酵罐中培养5 d（葡萄糖初始浓度100 g/L，降至10 ~ 20 g/L时流加葡萄糖以维持其浓度在50 ~ 100 g/L），DHA生产率2.59 g/(L·d)（黄和, 等. 中国专利101575584B, 2010）；在1000 L发酵罐中培养
132 hr（葡萄糖初始浓度40 g/L，降至15 g/L时流加葡萄糖以维持其浓度在15 ~ 40 g/L），DHA生产率2.86 g/(L·d)（Ren L J, et al. Appl Microbiol Biotechnol, 2010）。
S. limacinum ATCC 20888在500 L发酵罐中培养90 hr（葡萄糖初始浓度45 g/L，降至
35 g/L时流加葡萄糖），DHA生产率4.86 g/(L·d)（徐从英, 等. 中国专利101519676B,
2011）。一株裂殖壶菌在8000 L发酵罐中培养5 d（葡萄糖初始浓度120 g/L，然后流加葡萄糖以维持其浓度在8 ~ 10 g/L），DHA生产率6 g/(L·d)（钟惠昌, 等. 中国专利
101812484B, 2012）。
[0004] 上述现有技术的DHA生产率虽然不断攀升，但还不够高，因此，DHA由裂殖壶菌发酵生产替代从鱼油中提取的关键在于进一步提高DHA生产率。
发明内容
[0005] 本发明所要解决的技术问题是现有技术中DHA生产率过低。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种裂殖壶菌及其高密度发酵生产DHA的方法，进一步提高DHA生产率，以利于裂殖壶菌发酵生产DHA的产业化。
[0007] 本发明提供一株裂殖壶菌，所述菌株为裂殖壶菌（Shizochytrium sp.）WZU6961，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 6369。
[0008] 上述裂殖壶菌高密度发酵生产DHA的方法，包括如下步骤：1）种子活化：a、将所述裂殖壶菌WZU6961转接入活化培养基的琼脂平板，加人工海水封盖，活化，得封盖海水；b、取步骤a得到的封盖海水转接入活化培养基，培养；c、取步骤b得到的菌种液，转接入活化培养基，培养；d、取步骤c得到的菌种液，转接入活化培养基，培养，得活化菌种；
2）种子培养：将步骤1）得到的活化菌种转接入种子培养基，通入无菌空气，培养，得种子培养物；
3）发酵生产：将步骤2）得到的种子培养物转接入发酵培养基，通入无菌空气，流加葡萄糖以维持其浓度在5 ~ 30 g/L；调节通气量和搅拌转速以维持DO值在4% ~ 40%，发酵60 ~ 64 hr放罐，即得。
2）种子培养：将步骤1）得到的活化菌种转接入种子培养基，通入无菌空气，培养，得种子培养物；
3）发酵生产：将步骤2）得到的种子培养物转接入发酵培养基，通入无菌空气，流加葡萄糖以维持其浓度在5 ~ 30 g/L；调节通气量和搅拌转速以维持DO值在4% ~ 40%，发酵60 ~ 64 hr放罐，即得。
[0009] 优选地，步骤1）a中活化条件：20℃ ~ 30℃活化2 ~ 6 d，更优选为25℃活化4 d。
[0010] 优选地，步骤1）b中：取步骤a得到的封盖海水以体积比5% ~ 10%的接种量转接入活化培养基，培养温度20℃ ~ 30℃，培养时间24 ~ 48 hr。更优选地，步骤1）b中：取步骤a得到的封盖海水以体积比5%的接种量转接入活化培养基，培养温度25℃，摇瓶转速200 rpm，培养时间48 hr。
[0011] 优选地，步骤1）c中：取步骤b得到的菌种液以体积比5% ~ 15%的接种量转接入活化培养基，培养温度20℃ ~ 30℃，培养时间24 ~ 48 hr。更优选地，取步骤b得到的菌种液以体积比10%的接种量转接入活化培养基，培养温度25℃，摇瓶转速200 rpm，培养时间48 hr。
[0012] 优选地，步骤1）d中：取步骤c得到的菌种液以体积比5% ~ 15%的接种量转接入活化培养基，培养温度20℃ ~ 30℃，培养时间24 ~ 48 hr。更优选地，取步骤c得到的菌种液以体积比10%的接种量转接入活化培养基，培养温度25℃，摇瓶转速200 rpm，培养时间48 hr。
[0013] 优选地，步骤2）中将步骤1）所得活化菌种以体积比5% ~ 15%的接种量转接入种子培养基，通入无菌空气，培养温度20℃ ~ 30℃，通气量5 ~ 50 L/min，搅拌转速250 ~450 rpm，培养时间24 ~ 60 hr，得种子培养物。更优选地，步骤2）中将步骤1）得到的活化菌种以体积比10%的接种量转接入种子培养基，培养温度25℃，通入无菌空气，通气量5 ~
50 L/min，搅拌转速250 ~ 450 rpm，培养时间48 hr，得种子培养物。
50 L/min，搅拌转速250 ~ 450 rpm，培养时间48 hr，得种子培养物。
[0014] 优选地，步骤3）中将步骤2）得到的种子培养物以体积比5% ~ 15%的接种量转接入发酵培养基，初始搅拌转速50 ~ 450 rpm，通入无菌空气，初始通气量5 ~ 450 L/min，流加葡萄糖以维持其浓度在5 ~ 30 g/L；调节通气量和搅拌转速以维持DO值在4% ~ 40%，发酵60 ~ 64 hr放罐，即得。更优选地，步骤3）中将步骤2）得到的种子培养物以体积比10%（v/v）的接种量转接入发酵培养基，发酵温度25℃，初始搅拌转速50 ~ 450 rpm，初始通气量5 ~ 450 L/min。流加葡萄糖以维持其浓度在5 ~ 10 g/L；调节通气量和搅拌转速以控制DO值低于4% ~ 10%。发酵60 ~ 64 hr放罐。
[0015] 优选地，步骤1）中所述活化培养基的配方：10 ~ 30 g/L葡萄糖、2 ~ 8 g/L酵母粉和2 ~ 8 g/L大豆蛋白胨，用人工海水配制；更优选地，所述活化培养基的配方20 g/L葡萄糖、5 g/L酵母粉和5 g/L大豆蛋白胨，用人工海水配制。
[0016] 优选地，步骤2）中所述种子培养基的配方：20 ~ 40 g/L葡萄糖、5 ~ 15 g/L酵母粉、2 ~ 8 g/L大豆蛋白胨、1 ~ 3 g/L玉米浆，用人工海水配制；更优选地，所述种子培养基的配方：30 g/L葡萄糖、10 g/L酵母粉、5 g/L大豆蛋白胨、2 g/L玉米浆，用人工海水配制。
[0017] 优选地，步骤3）中所述发酵培养基的配方：20 ~ 40 g/L葡萄糖、5 ~ 15 g/L酵母粉、2 ~ 8 g/L大豆蛋白胨、1 ~ 3 g/L玉米浆，营养液5 ~ 15 mL/L；更优选地，所述发酵培养基的配方：30 g/L葡萄糖、10 g/L酵母粉、5g/L大豆蛋白胨、2 g/L玉米浆，营养液10 mL/L。其中，所述营养液的配方：1.5 ~ 3.5 mg/L肌醇、0.05 ~ 0.15 mg/L硫胺素、0.05 ~0.15 mg/L钴胺素、0.05 ~ 0.15 mg/L泛酸钙、0.05 ~ 0.15 mg/L烟酸、0.05 ~ 0.15 mg/L核黄素、0.025 ~ 0.075 mg/L生物素，用人工海水配制。
[0018] 优选地，所述人工海水由如下浓度的成分构成：Na2SO4 24g/L、MgSO4·7H2O 4 g/L、K2H2PO4 2 g/L、(NH4)2SO4 2 g/L、K2SO4 1.3 g/L、KCl 1 g/L、CaCl2·2H2O 0.34 g/L、FeSO4·7H2O 20 mg/L、MnCl2·4H2O 6 mg/L、ZnSO4·7H2O 6 mg/L、CuSO4·5H2O 4 mg/L、NiSO4·6H2O 4 mg/L、CoCl2·6H2O 0.08 mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.08 mg/L。
[0019] 本发明能够达到以下有益效果：本发明以裂殖壶菌WZU6961高密度培养生产DHA，裂殖壶菌WZU6961经过多次充分活化后，转接入种子培养基培养，然后转接入发酵培养基发酵生产，得到的发酵液中生物量浓度92.4 ~ 103.2 g/L，生物量中DHA含量20.9% ~21.9%，DHA生产率达到7.2 ~ 8.5 g/(L·d)，高于现有技术，有利于裂殖壶菌发酵生产DHA的产业化。
附图说明
附图说明
[0020] 图1是裂殖壶菌种子培养的生长曲线；图2是不同种龄的裂殖壶菌种子培养物的细胞形态（400 ×）；
图3是裂殖壶菌流加发酵的生物量和DHA变化曲线。
图3是裂殖壶菌流加发酵的生物量和DHA变化曲线。
[0021] 菌株的保藏本发明的裂殖壶菌（Shizochytrium sp.）WZU6961，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 6369，保藏日期为2012年7月20日。
[0022]
具体实施方式
[0023] 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
[0024] 本发明的裂殖壶菌WZU6961高密度发酵生产DHA的方法，包括如下步骤：1）种子活化：a、将裂殖壶菌WZU6961转接入活化培养基的琼脂平板，加人工海水封盖，活化，得封盖海水，活化条件：20℃ ~ 30℃活化2 ~ 6 d。
[0025] b、取步骤a得到的封盖海水转接入活化培养基，培养。具体步骤为，取步骤a得到的封盖海水以体积比5% ~ 10%的接种量转接入新鲜的活化培养基，培养温度20℃ ~ 30℃，培养时间24 ~ 48 hr。
[0026] c、取步骤b得到的菌种液，转接入活化培养基，培养。具体步骤为，取步骤b得到的菌种液以体积比5% ~ 15%的接种量转接入新鲜的活化培养基，培养温度20℃ ~ 30℃，培养时间24 ~ 48 hr。
[0027] d、取步骤c得到的菌种液，转接入活化培养基，培养，得活化菌种。具体步骤为，取步骤c得到的菌种液以体积比5% ~ 15%的接种量转接入新鲜的活化培养基，培养温度20℃ ~ 30℃，培养时间24 ~ 48 hr。
[0028] 活化培养基的配方：10 ~ 30 g/L葡萄糖、2 ~ 8 g/L酵母粉和2 ~ 8 g/L大豆蛋白胨，用人工海水配制。
[0029] 2）种子培养：将步骤1）得到的活化菌种转接入种子培养基，通入无菌空气，培养，得种子培养物。具体步骤为，步骤2）中将步骤1）所得活化菌种以体积比5% ~ 15%的接种量转接入种子培养基，通入无菌空气，培养温度20℃ ~ 30℃，通气量5 ~ 50 L/min，搅拌转速250 ~ 450 rpm，培养时间24 ~ 60 hr，得种子培养物。
[0030] 种子培养基的配方：20 ~ 40 g/L葡萄糖、5 ~ 15 g/L酵母粉、2 ~ 8 g/L大豆蛋白胨、1 ~ 3 g/L玉米浆，用人工海水配制。
[0031] 3）发酵生产：将步骤2）得到的种子培养物转接入发酵培养基，通入无菌空气，流加葡萄糖以维持其浓度在5 ~ 30 g/L；调节通气量和搅拌转速以维持DO值在4% ~ 40%，发酵60 ~ 64 hr放罐，即得。具体步骤为，步骤3）中将步骤2）得到的种子培养物以体积比5% ~ 15%的接种量转接入发酵培养基，初始搅拌转速50 ~ 450 rpm，通入无菌空气，初始通气量5 ~ 450 L/min，流加葡萄糖以维持其浓度在5 ~ 30 g/L；调节通气量和搅拌转速以维持DO值在4% ~ 40%，发酵60 ~ 64 hr放罐，即得。
[0032] 发酵培养基的配方：20 ~ 40 g/L葡萄糖、5 ~ 15 g/L酵母粉、2 ~ 8 g/L大豆蛋白胨、1 ~ 3 g/L玉米浆，营养液5 ~ 15 mL/L，用人工海水配制，其中，营养液的配方：1.5 ~3.5 mg/L肌醇、0.05 ~ 0.15 mg/L硫胺素、0.05 ~ 0.15 mg/L钴胺素、0.05 ~ 0.15 mg/L泛酸钙、0.05 ~ 0.15 mg/L烟酸、0.05 ~ 0.15 mg/L核黄素、0.025 ~ 0.075 mg/L生物素，用人工海水配制。
[0033] 以下列举优选实施例以进一步对本发明进行说明。
[0034] 实施例1a、将保藏于–70℃的裂殖壶菌WZU6961转接入活化培养基的琼脂平板，加适量人工海水封盖，25℃活化4 d，得封盖海水。b、取步骤a得到的封盖海水以体积比5%（v/v）的接种量转接入新鲜的活化培养基，培养温度25℃，摇瓶转速200 rpm，培养时间48 hr；c、取步骤b得到的菌种液以体积比10%的接种量转接入新鲜的活化培养基，培养温度25℃，摇瓶转速
200 rpm，培养时间48 hr；d、取步骤c得到的菌种液以体积比10%的接种量转接入新鲜的活化培养基，培养温度25℃，摇瓶转速200 rpm，培养时间48 hr，得活化菌种。其中，活化培养基的配方：20 g/L葡萄糖、5 g/L酵母粉和5 g/L大豆蛋白胨，用人工海水配制。
200 rpm，培养时间48 hr；d、取步骤c得到的菌种液以体积比10%的接种量转接入新鲜的活化培养基，培养温度25℃，摇瓶转速200 rpm，培养时间48 hr，得活化菌种。其中，活化培养基的配方：20 g/L葡萄糖、5 g/L酵母粉和5 g/L大豆蛋白胨，用人工海水配制。
[0035] 人工海水由如下浓度的成分构成：Na2SO4 24g/L、MgSO4·7H2O 4 g/L、K2H2PO4 2 g/L、(NH4)2SO4 2 g/L、K2SO4 1.3 g/L、KCl 1 g/L、CaCl2·2H2O 0.34 g/L、FeSO4·7H2O 20 mg/L、MnCl2·4H2O 6 mg/L、ZnSO4·7H2O 6 mg/L、CuSO4·5H2O 4 mg/L、NiSO4·6H2O 4 mg/L、CoCl2·6H2O 0.08 mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.08 mg/L。
[0036] 本实施例中，裂殖壶菌WZU6961分离自浙江省乐清市雁荡山麓西门岛红树林，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 6369。
[0037] 将活化菌种以体积比10%的接种量转接入5 L种子培养基，培养温度25℃，通入无菌空气，通气量5 L/min，搅拌转速450 rpm，培养，得种子培养物。其中，种子培养基的配方：30 g/L葡萄糖、10 g/L酵母粉、5 g/L大豆蛋白胨、2 g/L玉米浆，用人工海水配制。
[0038] 裂殖壶菌的种子培养物的生长曲线见图1，不同种龄的种子培养物的细胞形态见图2。由图1可以看出，种龄为24 ~ 32 hr的种子培养物进入对数期末期。但是，将种龄为24或32 hr的种子培养物转接入发酵培养基，发酵过程容易出现不稳定状态，生长情况经常异常。由图2可以看出，种龄为48 hr的种子培养物与种龄为24或32 hr的种子培养物的细胞形态明显不同，而种龄大于48 hr的种子培养物的细胞形态无明显变化。将种龄为48 hr的种子培养物转接入发酵培养基，其发酵过程非常稳定。
[0039] 因此，本实施例优选的种子培养物的种龄为48 hr。
[0040] 实施例2将实施例1得到的种龄为48 hr的种子培养物以体积比10%（v/v）的接种量转接入5 L所述发酵培养基，发酵温度25℃，通入无菌空气，通气量5 L/min，搅拌转速450 rpm。其中，发酵培养基的配方：10、20、30、40和50 g/L葡萄糖、10 g/L酵母粉、5 g/L大豆蛋白胨、
2 g/L玉米浆，营养液10 mL/L，用人工海水配制。其中，营养液的配方：1.5 ~ 3.5 mg/L肌醇、0.05 ~ 0.15 mg/L硫胺素、0.05 ~ 0.15 mg/L钴胺素、0.05 ~ 0.15 mg/L泛酸钙、0.05 ~ 0.15 mg/L烟酸、0.05 ~ 0.15 mg/L核黄素、0.025 ~ 0.075 mg/L生物素，用人工海水配制。
2 g/L玉米浆，营养液10 mL/L，用人工海水配制。其中，营养液的配方：1.5 ~ 3.5 mg/L肌醇、0.05 ~ 0.15 mg/L硫胺素、0.05 ~ 0.15 mg/L钴胺素、0.05 ~ 0.15 mg/L泛酸钙、0.05 ~ 0.15 mg/L烟酸、0.05 ~ 0.15 mg/L核黄素、0.025 ~ 0.075 mg/L生物素，用人工海水配制。
[0041] 裂殖壶菌在不同葡萄糖浓度下的比生长速率列于表1。由表1可以看出，葡萄糖浓度对菌体生长具有抑制作用，低浓度葡萄糖更有利于菌体生长。
[0042] 表1 葡萄糖浓度对裂殖壶菌生长的影响葡萄糖浓度/g/L 比生长速率/hr-1
10 0.153
20 0.149
30 0.140
40 0.133
50 0.126
考虑到生产过程中葡萄糖检测的实际问题，优选的葡萄糖维持浓度为5 ~ 10 g/L。
10 0.153
20 0.149
30 0.140
40 0.133
50 0.126
考虑到生产过程中葡萄糖检测的实际问题，优选的葡萄糖维持浓度为5 ~ 10 g/L。
[0043] 实施例3将实施例1得到的种龄为48 hr的种子培养物以体积比10%（v/v）的接种量转接入5 L发酵培养基（发酵培养基的配方：30 g/L葡萄糖、10 g/L酵母粉、5 g/L大豆蛋白胨、2 g/L玉米浆，营养液10 mL/L，用人工海水配制），发酵温度25℃，通入无菌空气，初始通气量5 L/min，初始搅拌转速450 rpm。当葡萄糖浓度降至10 g/L以下时，流加葡萄糖以维持其浓度在5 ~ 10 g/L。调节通气量和搅拌转速以控制DO值分别维持在4% ~ 10%、10% ~ 20%和
30% ~ 40%。
30% ~ 40%。
[0044] 裂殖壶菌在不同溶氧水平下的发酵结果列于表2。由表2可以看出，在不同溶氧水平下，发酵终止时生物量比较接近；随着DO值升高，发酵时间缩短，生物量中DHA含量下降，DHA生产率下降，说明高溶氧利于菌体生长而不利于DHA积累。
[0045] 表2 溶氧水平对裂殖壶菌发酵生产DHA的影响DO值 4%~10% 10%~20% 30%~40%
发酵时间/h 64 60 57
生物量/g/L 103.2 101.3 102.1
生物量中DHA含量/% 21.9 18.2 15.0
DHA生产率/g/(L·d) 8.48 7.37 6.45
优选的DO值维持水平为4% ~ 10%。
发酵时间/h 64 60 57
生物量/g/L 103.2 101.3 102.1
生物量中DHA含量/% 21.9 18.2 15.0
DHA生产率/g/(L·d) 8.48 7.37 6.45
优选的DO值维持水平为4% ~ 10%。
[0046] 实施例4将保藏于–70℃的裂殖壶菌WZU6961转接于活化培养基的琼脂平板，加适量人工海水封盖，25℃活化4 d。取封盖海水以体积比5%（v/v）的接种量转接入50 mL新鲜的活化培养基，培养温度25℃，摇瓶转速200 rpm，培养时间48 hr后，得到的菌种液以体积比10%（v/v）的接种量转接入500 mL新鲜的活化培养基，培养温度25℃，摇瓶转速200 rpm，培养时间
48 hr后，得到的菌种液以体积比10%的接种量转接入1000 mL新鲜的活化培养基，培养温度25℃，摇瓶转速200 rpm，培养时间48 hr。
48 hr后，得到的菌种液以体积比10%的接种量转接入1000 mL新鲜的活化培养基，培养温度25℃，摇瓶转速200 rpm，培养时间48 hr。
[0047] 将活化菌种以体积比10%（v/v）的接种量转接入25 L种子培养基，培养温度25℃，通入无菌空气，通气量22 L/min，搅拌转速350 rpm，培养时间48 hr。
[0048] 将种子培养物以体积比10%（v/v）的接种量转接入500 L发酵培养基，发酵温度25℃，通入无菌空气，初始通气量450 L/min，初始搅拌转速60 rpm。当葡萄糖浓度降至10 g/L以下时，流加葡萄糖以维持其浓度在5 ~ 10 g/L。当DO值升至10%时，调节通气量和搅拌转速以维持DO值在4% ~ 10%。发酵64 hr放罐。
[0049] 裂殖壶菌发酵过程的生物量和DHA变化曲线见图3。发酵结束时，培养液中生物量浓度92.4 g/L，气相色谱法测定生物量中DHA含量为20.9%，DHA生产率达到7.24 g/(L·d)。
[0050] 以上实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
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