技术领域
[0001] 本
发明属于环境污染检测技术领域，涉及一种基于光学测量的蚯蚓运动行为测试方法。
背景技术
[0002]
生物体可以通过改变自身行为来保护自己免受毒物的侵害，它们的行为也可能直接受到毒物的影响，所以生物分析中可以通过有
机体的行为变化研究来检测或监测环境中污染物的存在。蚯蚓作为
土壤环境中的指示生物被广泛运用于土壤生态毒理评价中，关于蚯蚓行为学的研究大多是描述性的观察，根据不同影响因素已建有特定的行为学研究模型，主要包括
摄食行为、回避行为、掘穴行为、学习行为、光感反应、趋向行为等。但这些研究都是对于行为终点的定性描述，而且是在相对长时间尺度下以低分辨时间研究蚯蚓对污染物的生物反应，并没有考虑蚯蚓自身条件的影响。蚯蚓自身的运动作为迁移、觅食、繁殖和逃避猎物等的基本条件，运动行为的变化或损伤也会对其余类型的行为产生影响。所以了解污染物暴露下蚯蚓自身生理活动的变化规律，有助于进一步揭示其在整个生物地球化学过程中的作用。
[0003] 目前对于蚯蚓运动行为学的研究大多是对于行为终点的定性描述，主要包括2D玻璃容器(2D terrarium)、
X射线断层成像以及录像追踪等技术，主要用于研究蚯蚓运动产生的孔隙度，也称之为掘穴行为。如Capowiez等设置了简易装置2D玻璃容器来研究
农药吡虫啉暴露后蚯蚓的掘穴行为，结果发现蚯蚓的掘穴长度、掘穴的再利用率以及爬行距离均降低，所以认为通过2D玻璃容器研究蚯蚓的掘穴行为是一种敏感的生物标志物。有研究采用
图像分析-
粒子图像测速(particle image velocimetry，PIV)成功地对蚯蚓运动引起的土壤颗粒异位的距离和方向进行了定量分析，为研究蚯蚓运动对土壤结构的影响提供了新视
角。Grant和Conlan研究了蚯蚓在模拟
地震前某一特定条件下蚯蚓的运动行为，通过录像来记录蚯蚓的运动，但这仅仅是从表观上判断蚯蚓运动与否。也有研究建立了一种夜间“牙签”方法来间接评价蚯蚓活动，在前一天傍晚将牙签垂直插入土壤表层，第二天早晨对与初始
位置不同的牙签进行计数，这是因为蚯蚓在摄食过程中会在土壤表层爬行，从而导致土壤表层牙签位置移动，通过移位的牙签数来表征蚯蚓活动；此外，也会对土壤表层新鲜的蚓粪进行计数来测定蚯蚓活动。还有研究通过设置简单的人工条件，观察蚯蚓在没有土壤的体外环境下对光照作出的反应，对蚯蚓运动进行录像记录并建立了一张对成像数据进行自动追踪定量分析蚯蚓二维位置和体长的方法。基于电生理手段的对于神经传导的测定虽然可以看作是对运动反应率的测定，但也有局限性，它是通过对蚯蚓切断处理所以造成不能可持续地进行蚯蚓活体测试。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于为克服上述
现有技术的
缺陷，提供一种为其他行为如迁移、觅食、繁殖和逃避猎物等的评价提供一定的数据
支撑、可持续地及准确地测量蚯蚓运动行为活性的方法。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0006] 本发明中，利用zebralab系统的活跃度(activity)模
块，采用该系统的光学分析条件通过研究区域内
像素的变化值来表征蚯蚓的运动活性。
[0007] 一种基于光学测量的蚯蚓运动行为测试方法，其包括以下步骤：设置处理组和对照组，对两组蚯蚓进行取样放在不同的培养皿中；设定测试周期和环境参数，给予两组蚯蚓样本适当的光照强度刺激来增强蚯蚓的运
动能力，并在黑暗/光照循环交替环境条件下运动；通过zebralab系统对两组样本进行运动行为分析和收集数据；最后用特定运动状态下的运动持续时间在测试周期的比例表征蚯蚓的运动活性。
[0008] 所述测试周期和环境参数设置如下：光照强度为20％，设定测试周期为6min，30s黑暗/60s光照，共4个循环。
[0009] 所述通过zebralab系统对两组样本进行运动行为分析和收集数据，包括：利用zebralab系统的活跃度模块进行测试，获取样本的活跃值；设置实际检测
阈值；将活跃值与实际检测阈值比较来区分样本运动状态，并获取测试周期内两组样本运动程度的数据；检测模式考察。
[0010] 所述设置实际检测阈值，包括：将一条表面干净的蚯蚓放在培养皿中，利用zebralab系统的活跃度模块获取样本的活跃值；预设检测阈值，将活跃值与预设检测阈值比较判断蚯蚓的运动程度，试验中蚯蚓的运动程度以曲线表示，曲线中不同
颜色代表不同程度的运动；调整预设阈值大小，根据曲线中的不同颜色的占比选择实际检测阈值。
[0011] 所述的检测模式考察，包括：建立测试周期内的三种不同程度
运动检测模式；包括中等程度运动持续时间和剧烈运动持续时间之和在测试时间段的比例检测模式、剧烈运动持续时间在测试时间段的比例检测模式以及中等程度运动持续时间在测试时间段的比例检测模式；对处理组与对照组的同种程度运动检测模式进行考察。
[0012] 所述检测阈值设有冻结阈值和剧烈阈值；所述将活跃值与预设检测阈值比较判断蚯蚓的运动程度，包括：当活跃值小于或等于预设冻结阈值，则蚯蚓处于静止状态；当活跃值大于预设冻结阈值且小于剧烈阈值时，则蚯蚓处于中等程度运动状态；当活跃值大于或等于剧烈阈值时，则蚯蚓处于剧烈运动状态。
[0013] 所述根据曲线中不同颜色的占比选择实际检测阈值，包括：白色表示静止状态，绿色表示中等程度运动状态，红色表示剧烈程度运动状态，调整预设检测阈值的大小直到曲线中三种颜色均显示，且曲线中绿色占比最大，红色次之，白色曲线占比最少，即为实际检测阈值。
[0014] 所述用特定运动状态下的运动持续时间在测试周期的比例表征蚯蚓的运动活性，包括：中等程度运动持续时间和剧烈运动持续时间之和在测试时间段的比例的检测模式作为最优模式用于表征蚯蚓运动活性，剧烈运动持续时间在测试时间段的比例的检测模式和中等程度运动持续时间在测试时间段的比例的检测模式作为可选模式。
[0015] 所述实际检测阈值的设定为冻结阈值5，剧烈阈值60。
[0016] 本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：
[0017] 1.现有的对于蚯蚓行为学的研究方法只是考察蚯蚓一种反应率的变化，不能真正表征蚯蚓的运动能力。相比之下，本实验所建立的方法主要是研究污染物暴露对蚯蚓自身生理活动的影响，可以为其他行为如迁移、觅食、繁殖和逃避猎物等的评价提供一定的数据支撑。
[0018] 2.与传统方法如电生理检测和掘穴行为等方法相比，既保证了
可持续性的蚯蚓活体测试，又能更准确地表征蚯蚓的运动活性。
附图说明
[0019] 图1为本发明基于光学测量的蚯蚓运动行为测试方法的
流程图；
[0020] 图2为本发明蚯蚓运动行为测试示意图；
[0021] 图3为本发明不同光照强度下蚯蚓的平均活跃度；
[0022] 图4为本发明检测模式考察-OA处理后蚯蚓运动行为测试；(a)折线图表示运动持续时间占比在测试周期中的变化曲线，(b)柱形图表示OA处理组与对照组的统计学差异分析。图上的值以平均值(n＝10)±SEM表示。(*表示p<0.05；**表示p<0.01；***表示p<0.001)；
[0023] 图5为本发明检测模式考察-5-HT处理后蚯蚓运动行为测试，(a)折线图表示运动持续时间占比在测试周期中的变化曲线，(b)柱形图表示5-HT处理组与对照组的统计学差异分析。图上的值以平均值(n＝10)±SEM表示。(*表示p<0.05；**表示p<0.01；***表示p<0.001)。
具体实施方式
[0024] 请参阅图1，在其中一个
实施例中，一种基于光学测量的蚯蚓运动行为测试方法，其包括以下步骤：
[0025] S100、设置处理组和对照组，对两组蚯蚓进行取样放在不同的培养皿中；
[0026] S110、设定测试周期和环境参数，给予两组蚯蚓样本适当的光照强度刺激来增强蚯蚓的运动能力，并在黑暗/光照循环交替环境条件下运动；
[0027] S120、通过zebralab系统对两组样本进行运动行为分析和收集数据；
[0028] S130最后用特定运动状态下的运动持续时间在测试周期的比例表征蚯蚓的运动活性。
[0029] 在一个实施例中，所述通过zebralab系统对两组样本进行运动行为分析和收集数据，包括：
[0030] 利用zebralab系统的活跃度模块进行测试，获取样本的活跃值；设置实际检测阈值；将活跃值与实际检测阈值比较来区分样本运动状态，并获取测试周期内两组样本运动程度的数据；检测模式考察。
[0031] 进一步地，所述设置实际检测阈值包括：将一条表面干净的蚯蚓放在直径8cm的培养皿中，利用zebralab系统的活跃度模块获取样本的活跃值；预设检测阈值，将活跃值与预设检测阈值比较判断蚯蚓的运动程度，试验中蚯蚓的运动程度以曲线表示，曲线中不同颜色代表不同程度的运动；调整预设阈值大小，根据曲线中的不同颜色的占比选择实际检测阈值。
[0032] 在一个实施例中，所述的检测模式考察包括：系统建立测试周期内的三种不同程度运动检测模式；包括中等程度运动持续时间和剧烈运动持续时间之和在测试时间段的比例检测模式、剧烈运动持续时间在测试时间段的比例检测模式以及中等程度运动持续时间在测试时间段的比例检测模式；对处理组与对照组的同种程度运动检测模式进行考察。
[0033] 在一个实施例中，所述检测阈值设有冻结阈值和剧烈阈值；所述将活跃值与预设检测阈值比较判断蚯蚓的运动程度，包括：当活跃值小于或等于预设冻结阈值，则蚯蚓处于静止状态；当活跃值大于预设冻结阈值且小于剧烈阈值时，则蚯蚓处于中等程度运动状态；当活跃值大于或等于剧烈阈值时，则蚯蚓处于剧烈运动状态。
[0034] 在一个实施例中，所述根据曲线中不同颜色的占比选择实际检测阈值，包括：白色表示静止状态即图中下部区域曲线部分，绿色表示中等程度运动状态即中间区域曲线部分，红色表示剧烈程度运动状态上部区域曲线部分，调整预设检测阈值的大小直到曲线中三种颜色均显示，且曲线中绿色占比最大，红色次之，白色曲线占比最少，即为实际检测阈值。
[0035] 在一个实施例中，所述用特定运动状态下的运动持续时间在测试周期的比例表征蚯蚓的运动活性，包括：中等程度运动持续时间和剧烈运动持续时间之和在测试时间段的比例的检测模式作为最优模式用于表征蚯蚓运动活性，剧烈运动持续时间在测试时间段的比例的检测模式和中等程度运动持续时间在测试时间段的比例的检测模式作为可选模式。
[0036] 在一个实施例中，所述实际检测阈值的设定为冻结阈值5，剧烈阈值60。
[0037] 以下结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0038] 实施例1：
[0039] 一种基于光学测量的蚯蚓运动行为测试方法，主要包括基本参数设置和检测模式考察，
[0040] 利用本发明提供的方法对蚯蚓暴露于林丹老化30天的土壤中28天后的运动行为进行测试。
[0041] 设置处理组和对照组，具体如下：
[0042] 配置林丹浓度为2.4mg/kg干重土的土壤-林丹体系，土壤湿度为60％，土壤充分搅拌以保证林丹混合均匀。将搅拌好的土壤分到150mm(直径)×70mm(高)的玻璃培养皿中，用保鲜膜密封好，置于恒温为25±1℃的房间中避光老化30天。对照组按照相同的操作，用蒸馏
水制备对照土壤。
[0043] 对照组和林丹暴露组各8个培养皿，每个皿放入10条蚯蚓，容器顶上
覆盖保鲜膜并扎孔以保证蚯蚓呼吸。将培养皿放入湿度为60％的房间中培养，
温度为25±1℃，维持24h光照以防止蚯蚓跑出培养皿。暴露期间对蚯蚓进行喂食，每周一次，每条蚯蚓0.5g
牛粪。在暴露持续时间为28天时对蚯蚓取样进行运动行为测试。
[0044] 光学测量的蚯蚓运动行为测试的方法具体步骤如下：
[0045] 1基本参数设置
[0046] 基本参数设置包括检测阈值设定，以及光照强度和测试周期设定。
[0047] 1.1检测阈值设定
[0048] 请参阅图2，本实验是利用zebralab系统的活跃度模块进行测试，试验中蚯蚓的运动程度以曲线表示，曲线中不同颜色代表不同程度的运动，这是通过设定合适的冻结阈值和剧烈阈值来实现。白色表示静止状态(低于冻结阈值)，绿色表示中等程度运动(介于冻结阈值和剧烈阈值之间)，红色表示剧烈运动(高于剧烈阈值)。将一条表面干净的蚯蚓放在直径8cm的培养皿中，调整阈值大小直到看到曲线中三种颜色均显示，且绿色曲线为主，红色次之，白色曲线比例最少，即为合适的阈值。最终确定冻结阈值为5，剧烈阈值为60。
[0049] 1.2光照强度和测试周期设定
[0050] 蚯蚓的运动主要通过体表的收缩反应来实现，由于蚯蚓本身不喜运动，可以给予一定的外界刺激来增强它的收缩反应，如给予轻微振动的条件刺激，或给予光照的无条件刺激。请参阅图3，本实验通过后一种途径来增强蚯蚓的运动能力，考察了不同强度光照(5％、10％、20％和50％)持续刺激5min的过程中蚯蚓的平均活跃度。结果发现在较低强度(5％和10％)或较高强度(50％)的光照刺激下，蚯蚓的平均活跃度表现出类似的趋势，在前50s内明显增强，随着光照时间延长又逐渐下降，说明较低或较高强度的光刺激对蚯蚓的刺激效应有一定的时间效应。在中等强度20％的光照条件下，平均活跃度在整个光照时间段内维持基本一致的水平，说明蚯蚓的运动状态在这一刺激下可以持续保持稳定状态，所以选择20％光照强度作为蚯蚓运动行为学测试的光刺激条件。由于蚯蚓不适合长期离开土壤生存，而且在光照和黑暗阶段的运动也会有差异，所以设定测试周期为6min，30s黑暗/60s光照，共4个循环。
[0051] 2检测模式考察
[0052] 动物的节律运动行为由位于中枢神经系统中的称为中枢模式发生器(central pattern generator，CPG)的神经网络控制，该神经网络中的神经元能够在没有运动器官作出真正运动行为的情况下产生节律性的运动输出，这种运动称为虚拟运动(fictive locomotion)。诱导虚拟运动产生的一种方法是利用生物活性物质作用于CPG，有文献报导，单胺类物质章鱼胺能够产生和增强无
脊椎动物中枢神经系统中的运动输出模式，10-4mol/L章鱼胺作用于分离出的蚯蚓腹神经索的20节等位神经节
片段，可以诱导产生明显的节律性的收缩。此外，5-HT也被发现在蚯蚓蠕动中的运动系统中发挥作用，5-HT持续性增强分离的蚯蚓腹神经索切段节律性的收缩。所以本实验中选用OA和5-HT为作为阳性对照试验，目的是检测所建立方法的可靠性，并找到最适合表征蚯蚓运动活性的检测模式。
[0053] 本实验考察了3种模式，即中等程度运动持续时间(middur)和剧烈运动持续时间(burdur)之和在测试时间段的比例-(middur&burdur)％，剧烈运动持续时间(burdur)在测试时间段的比例-burdur％，以及中等程度运动持续时间(middur)在测试时间段的比例-middur％。
[0054] 请参阅图4，其示为OA阳性试验结果，图中可以看出OA处理后(middur&burdur)％显著高于对照组，在90s之后的测试阶段均表现有显著性差异；burdur％相比于对照组也明显升高，但仅在120-180s和300-360s光照阶段有统计学差异；middur％在OA处理组和对照组之间几乎没有变化。
[0055] 请参阅图5，5-HT阳性对照试验整体趋势与OA组相似，(middur&burdur)％虽然高于对照组，但并没有表现出显著性差异；burdur％仅在在120-180s和300-360s光照阶段相比对照组显著增加；middur％在5-HT处理组和对照组之间几乎没有变化。
[0056] 经研究发现，middur％在对照组和林丹暴露组中水平基本一致。对(middur&burdur)％而言，蚯蚓在林丹老化30天暴露28天时在6min的测试周期内相比对照组显著下降。对照组和林丹暴露组中burdur％在6min的测试周期内随着测试时间延长整体呈明显的降低趋势，且林丹暴露组中burdur％相比于对照组在整个测试周期内都出现下降，个别时间段内有统计学差异。综合可以得出，(middur&burdur)％可以作为最优模式表征蚯蚓的运动行为变化，burdur％和middur作为可选模式。即相比对照组而言，林丹老化30天暴露持续时间为28天组中蚯蚓的运动能力显著下降。
[0057] 上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种
修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
