技术领域
[0001] 本
发明涉及一种防治苹果苦痘病的复合微
生物肥料及其制备方法，属于微生物肥料技术领域。技术背景
[0002] 苹果苦痘病又称苦陷病，主要是因为树体生理性缺
钙引起的，是在苹果成熟期和贮藏期常发生的一种生理病害，主要表现在果实上，症状在果实近成熟时开始出现，贮藏期继续发展。
[0003] 中国是传统的农业大国，农业是我国的
基础产业，在国民经济中占有举足轻重的地位。人民的生活
水平不断提高，随之对农业提供的产品的要求也相应提高，尤其是对苹果等水果类需求逐年增长，我国北方是苹果的主要种植区，苦痘病又称苦陷病、斑点病，是苹果成熟期、贮藏期常发的一种缺钙生理病害，主要表现在果实上。苹果苦痘病已经成为世界范围内影响苹果经济性状的主要病害，在我国实行套袋栽培后发病日益严重，有的果园果实发病率高达50％以上，严重影响果品
质量和经济效益的提高。传统的中量元素水溶肥、无机钙肥等存在吸收难，效果差等情况。
[0004] 中国
专利文献CN108929169A(
申请号201811007512.5)公开了一种环保抗病苹果树肥料，包括玉米秸秆、
黄腐酸钾、糠
醛渣、
磷酸二氢钾、四
硼酸钠、观音土、
柠檬酸钠、蓖麻饼、骨粉、
活性炭、沸石粉、复合菌种粉。本发明制成的肥料，肥料持久，肥料利用率高，有效的提高苹果树的抵抗
力，配比合理，经济环保，但该肥料依然存在钙元素吸收困难，无法防止苹果苦痘病。
发明内容
[0005] 针对
现有技术的不足，本发明提供了一种防治苹果苦痘病的复合微生物肥料及其制备方法。
[0006] 本发明所述复合微生物肥料，可以有效增加成熟苹果果肉中的含钙量，有效防治苹果苦痘病，有利于苹果的稳定保存，保证了苹果的品质，增加了种植户的经济收益；所述复合微生物肥料在起到肥料作用的同时还可以调整
土壤菌群平衡，促进果树对钙的吸收利用。
[0007] 本发明的技术方案如下:
[0008] 一种防治苹果苦痘病的复合微生物肥料，包括如下组分，均为重量份：
[0009] 枯草芽孢杆菌
发酵液1～5份、糖醇钙20～30份、磷酸二氢钾5份、黄腐酸铵15-30份、硼酸5份、水40-60份；
[0010] 所述发酵液中枯草芽孢杆菌有效活菌数≥250亿/ml。
[0011] 根据本发明优选的，所述复合微生物肥料，包括如下组分，均为重量份：枯草芽孢杆菌发酵液5份、糖醇钙30份、磷酸二氢钾5份、黄腐酸铵30份、硼酸5份、水60份；所述发酵液中枯草芽孢杆菌的有效活菌数为350亿/ml。
[0012] 根据本发明优选的，所述枯草芽孢杆菌发酵液中的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 来源于中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号ACCC 10242。
[0013] 所述复合微生物肥料的制备方法，包括如下步骤：
[0014] (1)将枯草芽孢杆菌经斜面培养基活化后转接于液体
种子培养基中，经摇瓶培养，制得液体种子A，将制得的液体种子A接种于液体发酵培养基中，调控pH值至7.0～8.0、通气比为1:(0.5～1)、转速100～200转/分，在30～37℃培养36～48h，制得发酵液，所述发酵液中枯草芽孢杆菌的有效活菌数≥250亿/ml；
[0015] 所述步骤(1)中斜面培养条件为：在30～37℃的
温度下，在斜面培养基中培养24～48h；所述斜面培养基每升组分如下：
[0016] 蛋白胨6～9g，
酵母粉3～5g，
牛肉膏2～4g，
氯化钠3～5g，琼脂15～25g，磷酸二氢钾0.5～1g，
磷酸氢二钾0.5～1g，余量水；
[0017] 所述步骤(1)中摇瓶培养条件为：在30～37℃条件下，培养36～48h；所述液体种子培养基每升组分如下：
[0018] 蛋白胨6～9g，
葡萄糖5～8g，酵母粉3～5g，牛肉膏2～4g，氯化钠3～5g，磷酸二氢钾0.5～1g，磷酸氢二钾0.5～1g，余量水；
[0019] 所述步骤(1)中液体发酵培养基每升组分如下：
[0020] 玉米粉10～15g，豆饼粉10～15g，葡萄糖5～10g，
硫酸铵5～10g，酵母粉3～5g，磷酸二氢钾0.5～0.8g，
硫酸镁0.1～0.25g，硫酸锰0.1～0.25g，氯化亚
铁0.1～0.2g，余量水，调整pH值7～8；
[0021] (2)按所述重量份取步骤(1)制备的枯草芽孢杆菌发酵液、糖醇钙、磷酸二氢钾、黄腐酸铵、硼酸、水，混合均匀，制得复合微生物肥料；
[0022] (3)将步骤(2)制得复合微生物肥料进行150目筛分,除去大于150目的微粒杂质，便于
滴灌施用，避免堵塞滴管头。
[0023] 根据本发明优选的，所述步骤(1)制得发酵液有效活菌数为350亿/ml；步骤(2)按重量份取步骤(1)制备的枯草芽孢杆菌发酵液枯草芽孢杆菌发酵液5份、糖醇钙30份、磷酸二氢钾5份、黄腐酸铵30份、硼酸5份、水60份，混合均匀，制得复合微生物肥料。
[0024] 上述复合微生物肥料应用于防治苹果苦痘病。
[0025] 本技术方案的有益效果
[0026] 1、本发明涉及的复合微生物肥料可以有效增加成熟苹果果肉的钙含量，有效防治苹果苦痘病，有利于苹果的稳定保存，保证了苹果的品质，增加了种植户的经济收益。
[0027] 2、本发明涉及的复合微生物肥料在起到肥料作用的同时还可以调整土壤菌群平衡，促进果树对钙的吸收利用。
具体实施方式
[0028] 下面结合
实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
[0029] 微生物来源
[0030] 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)购自于中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号ACCC 10242；
[0031] 枯草芽孢杆菌编号LZH-H1购自于德州学院生物物理重点实验室。
[0032] 枯草芽孢杆菌编号LZH-13购自于德州学院生物物理重点实验室。
[0033] 实施例1
[0034] 一种防治苹果苦痘病的复合微生物肥料，包括组份如下，均为重量份：
[0035] 枯草芽孢杆菌(ACCC 10242)发酵液2份、糖醇钙20份、磷酸二氢钾5份、黄腐酸铵 15份、硼酸5份、水40份；所述发酵液中枯草芽孢杆菌的有效活菌数为270亿/ml。
[0036] 上述防治苹果苦痘病的复合微生物肥料的制备方法，包括如下步骤：
[0037] (1)将枯草芽孢杆菌(ACCC 10242)经斜面培养基活化后转接于液体种子培养基中，经摇瓶培养，制得液体种子A，将制得的液体种子A接种于液体发酵培养基中，调控pH值至7.0、通气比为1:0.5、转速为100转/分，培养温度为30℃，培养时间为46h，制得发酵液，所述发酵液中枯草芽孢杆菌的有效活菌数为270亿/ml；
[0038] 所述步骤(1)中斜面培养条件为：在35℃的温度下，在斜面培养基中培养36h；所述斜面培养基每升组分如下：
[0039] 蛋白胨8g,酵母粉3g,牛肉膏2g,氯化钠5g,琼脂17g,磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钾0.5g，余量水；
[0040] 所述步骤(1)中摇瓶培养条件为：在35℃条件下，培养42h；所述液体种子培养基每升组分如下：
[0041] 蛋白胨6g,葡萄糖5g，酵母粉3g,牛肉膏2g,氯化钠3g,磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钾 1g，余量水；
[0042] 所述步骤(1)中液体发酵培养基每升组分如下：
[0043] 玉米粉10g,豆饼粉10g,葡萄糖5g,硫酸铵5g,酵母粉3g,磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.1g,氯化亚铁0.1g，余量水，调整pH值7.0。
[0044] (2)按上述重量份取步骤(1)制备的枯草芽孢杆菌发酵液、糖醇钙、磷酸二氢钾、黄腐酸铵、硼酸、水投入混合罐内搅拌均匀，搅拌时间30分钟，制得复合微生物肥料。
[0045] (3)将步骤(2)制备的复合微生物肥料送入150目的
振动筛进行筛分，除去大于150 目的微粒杂质，便于滴灌施用，避免堵塞滴管头。
[0046] (4)将步骤(3)筛分后的复合微生物肥料进行
包装。
[0047] 实施例2
[0048] 一种防治苹果苦痘病的复合微生物肥料，包括组份如下，均为重量份：
[0049] 枯草芽孢杆菌(ACCC 10242)发酵液5份、糖醇钙25份、磷酸二氢钾5份、黄腐酸铵 20份、硼酸5份、水50份；所述发酵液中枯草芽孢杆菌的有效活菌数为300亿/ml。
[0050] 上述复合微生物肥料的制备方法，包括如下步骤：
[0051] (1)将枯草芽孢杆菌(ACCC 10242)经斜面培养基活化后转接于液体种子培养基中，经摇瓶培养，制得液体种子A，将制得的液体种子A接种于液体发酵培养基中，调控pH值至7.5、通气比为1:0.75、转速为150转/分，培养温度为37℃，培养时间为36h，制得发酵液，所述发酵液中枯草芽孢杆菌有效活菌数为300亿/ml；
[0052] 所述步骤(1)中斜面培养条件为：在37℃的温度下，在斜面培养基中培养40h；所述斜面培养基每升组分如下：
[0053] 蛋白胨8g,酵母粉4g,牛肉膏3g,氯化钠4g,琼脂17g,磷酸二氢钾0.8g，磷酸氢二钾0.8g，余量水；
[0054] 所述步骤(1)中摇瓶培养条件为：在35℃条件下，培养42h；所述液体种子培养基每升组分如下：
[0055] 蛋白胨9g,葡萄糖5g酵母粉5g,牛肉膏2g,氯化钠5g,磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钾1g，余量水；
[0056] 所述步骤(1)中液体发酵培养基每升组分如下：
[0057] 玉米粉12g,豆饼粉13g,葡萄糖8g,硫酸铵6g,酵母粉4g,磷酸二氢钾0.7g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.15g,氯化亚铁0.15g，余量水，调整pH值7.4。
[0058] (2)按上述重量份取步骤(1)制备的枯草芽孢杆菌发酵液、糖醇钙、磷酸二氢钾、黄腐酸铵、硼酸、水投入混合罐内搅拌均匀，搅拌时间35分钟，制得复合微生物肥料。
[0059] (3)将步骤(2)制备的复合微生物肥料送入150目的振动筛进行筛分，除去大于150 目的微粒杂质，便于滴灌施用，避免堵塞滴管头。
[0060] (4)将步骤(3)筛分后的复合微生物肥料进行包装。
[0061] 实施例3
[0062] 一种防治苹果苦痘病的复合微生物肥料，组份如下，均为重量份：
[0063] 枯草芽孢杆菌(ACCC 10242)发酵液5份、糖醇钙30份、磷酸二氢钾5份、黄腐酸铵 30份、硼酸5份、水60份；所述发酵液中枯草芽孢杆菌的有效活菌数为350亿/ml。
[0064] 上述复合微生物肥料的制备方法，包括如下步骤：
[0065] (1)将枯草芽孢杆菌(ACCC 10242)经斜面培养基活化后转接于液体种子培养基中，经摇瓶培养，制得液体种子A，将制得的液体种子A接种于液体发酵培养基中，调控pH值至7.5、通气比为1:1、转速为200转/分，培养温度为37℃，培养时间为38h，制得发酵液，所述发酵液中枯草芽孢杆菌有效活菌数为350亿/ml；
[0066] 所述步骤(1)中斜面培养条件为：在37℃的温度下，在斜面培养基中培养48h；所述斜面培养基每升组分如下：
[0067] 蛋白胨9g,酵母粉5g,牛肉膏4g,氯化钠5g,琼脂20g,磷酸二氢钾1g，磷酸氢二钾1g，余量水；
[0068] 所述步骤(1)中摇瓶培养条件为：在37℃条件下，培养48h；所述液体种子培养基每升组分如下：
[0069] 蛋白胨9g,葡萄糖8g酵母粉5g,牛肉膏4g,氯化钠5g,磷酸二氢钾1g，磷酸氢二钾1g，余量水；
[0070] 所述步骤(1)中液体发酵培养基每升组分如下：
[0071] 玉米粉15g,豆饼粉15g,葡萄糖10g,硫酸铵8g,酵母粉5g,磷酸二氢钾0.8g，硫酸镁 0.25g，硫酸锰0.25g,氯化亚铁0.2g，余量水，调整pH值7.8。
[0072] (2)按上述重量份取步骤(1)制备的枯草芽孢杆菌发酵液、糖醇钙、磷酸二氢钾、黄腐酸铵、硼酸、水投入混合罐内搅拌均匀，搅拌时间40分钟。
[0073] (3)将步骤(2)制备的复合微生物肥料送入150目的振动筛进行筛分，除去大于150 目的微粒杂质，便于滴灌施用，避免堵塞滴管头。
[0074] (4)将步骤(3)筛分后的复合微生物肥料进行包装。
[0075] 对比例1
[0076] 与实施例3不同之处在于所述复合微生物肥料中不添加枯草芽孢杆菌(ACCC 10242)发酵液，而是添加同样方法制备的，有效活菌数相同的枯草芽孢杆菌(LZH-H1)发酵液。
[0077] 对比例2
[0078] 与实施例3不同之处在于所述复合微生物肥料不添加枯草芽孢杆菌(ACCC 10242))发酵液，而是添加同样方法制备的，有效活菌数相同的地衣芽孢杆菌(LZH-13)。
[0079] 对比例3
[0080] 与实施例3不同之处在于所述复合微生物肥料不添加枯草芽孢杆菌(ACCC 10242)发酵液，其他均相同。
[0081] 对比例4
[0082] 与实施例3不同之处在于所述复合微生物肥料不添加黄腐酸铵，其他均相同。
[0083] 对比例5
[0084] 与实施例3不同之处在于所述复合微生物肥料不添加硼砂，其他均相同。
[0085] 对比例6
[0086] 与实施例3不同之处在于所述复合微生物肥料不添加糖醇钙，用
硝酸钙代替，其他均相同。
[0087] 对比例7
[0088] 与实施例3不同之处在于所述复合微生物肥料中不添加磷酸二氢钾，其他均相同。
[0089] 效果例
[0090] 将实施例1-3与对比例1-7制备的复合微生物肥料在山东省烟台市栖霞市臧家庄镇进行效果验证。
[0091] 选用树形大小长势基本一致、树龄10年的红富士苹果为施用对象，进行效果验证对比；使用方式：将实施例1-3与对比例1-7制备的复合微生物肥料分别在苹果树展叶期灌根冲施一次、落花后灌根冲施一次，采收前40天叶面喷施一次，上述对应制备的肥料作为一个实验处理组，共10个处理组，并以清水为空白对照作为一个处理组；每个处理组5个平行，每个平行施用3棵树，待采收时，每个棵随机采收10个苹果，用以统计分析苦痘病病斑个数，并按照下表1进行等级划分来区分患病程度，对应3棵树的平均值为该平行的代表值，各处理组的病情程度指数见表2。
[0092] 按照GB5009.92-2006食品中钙含量的测定采摘后苹果的钙含量，每个处理组每个平行随机选取5个苹果，11个处理组，应选取大小、色泽一致的苹果进行钙含量的检测，且检测部位应一致，苹果钙含量的检测结果见表3。
[0093] 按照NY/T2321-2013微生物肥料产品检验规程中5.1有效活菌数的测定方法测定土壤样品中细菌总数(使用营养肉汤琼脂培养基)和
真菌总数(使用PDA培养基)，每个处理组每个平行随机选取2棵树，每棵树在其树冠外缘选取4个点以及树干距树冠外缘三分之二处选取 4个点共计8个点采集深度为15cm的土样每个点1kg，使用四分法最终获得0.5kg样品进行检测，施用前
采样方法则为从所有处理组每组随机选取1棵树，共计11棵按照同样方法每棵选取8个点采样，最终用四分法获得0.5kg样品进行检测。
[0094] 表1
[0095] 等级 病斑数0 0
1 1-5
2 6-10
3 11-15
4 16-20
5 ≥21
[0096] 病情程度指数：∑(发病果数×对应等级)/(发病果数×5)×100
[0097] 表2
[0098]
[0099]
[0100] 表3苹果钙含量(mg/kg)
[0101]
[0102] 表4土壤菌群相关指标变化情况
[0103]
[0104]
[0105] 从上述结果中可以看出本发明所涉及的复合微生物肥料综合
整治效果突出，有效降低了苹果苦痘病的病情指数，对提高苹果钙含量效果显著，对提高土壤菌群总数效果明显，对苹果改善品质，降低患病程度，实现良好的经济效益。
