一种植物花药特异性启动子及其应用
阅读：1发布：2023-10-29
专利汇可以提供一种植物花药特异性启动子及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种 植物 花药特异性启动子及其应用。该启动子的核苷酸序列是：(1)、 序列表 中序列1所述的核苷酸序列；或(2)、与(1)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列；或(3)、与(1)或(2)所述的核苷酸序列具有60％或60％以上同源性的核苷酸序列；或(4)、与(1)、(2)或(3)所述的核苷酸序列在严谨杂交条件下能够杂交的核苷酸序列。可用含有该启动子与内源基因的反义基因、能够干扰内源基因表达的小RNA或外源基因的融合 片段 的表达载体转化宿主细胞或宿主组织及其后代细胞，培育雄性不育系植物、能够防止转基因通过花粉漂移而污染其野生种和近缘种的转基因植物和“飞絮”消除或大幅度减少的飞絮园林绿化植物或作物品种等。，下面是一种植物花药特异性启动子及其应用专利的具体信息内容。
1.一种植物花药特异性启动子，其特征在于：它的核苷酸序列是：(1)、序列表中序列1所述的核苷酸序列；或(2)、与(1)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列；或(3)、与(1)或(2)所述的核苷酸序列具有60％或60％以上同源性的核苷酸序列；或(4)、与(1)、(2)或(3)所述的核苷酸序列在严谨杂交条件下能够杂交的核苷酸序列。
2.含有权利要求1所述的启动子的表达盒。
3.根据权利要求2所述的表达盒，其特征在于：所述启动子的下游连接结构基因，或调节基因，或结构基因或调节基因的反义基因，或者能够干扰内源基因表达的小RNA。
4.含有权利要求1所述启动子、或权利要求2或3所述的表达盒的重组表达载体。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体是由权利要求2或3所述的表达盒与质粒、病毒或运载体表达载体所构建的重组载体。
6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为重组植物表达载体，所述重组植物表达载体含有权利要求2或3所述的表达盒并且能够将所述的表达盒转送进入植物宿主细胞、组织或器官及其后代并且能够或者至少方便所述的表达盒整合到宿主的基因组中。
7.根据权利要求6所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为双元载体或共合载体。
8.由权利要求4-7任一所述的重组表达载体转化植物细胞或植物组织或植物器官得到的转基因植物细胞或组织或器官。
9.权利要求1所述的花药特异性启动子在培育植物或作物雄性不育的品种和/或品系及其恢复系品种和/或品系、培育授粉授精能力增强的品种和/或品系、培育能够防止外源基因通过花粉漂移而污染其野生种和近缘种的转基因植物或作物品种和/或品系、培育货架寿命延长的花卉植物或作物品种和/或品系、和培育飞絮消除或大幅度减少的飞絮园林绿化植物或作物品种和/或品系中的应用；所述植物是显花植物，包括但不限于被子植物和裸子植物、单子叶植物和双子叶植物、草本植物、藤本植物和木本植物、园林园艺植物和农作物及牧草植物、一年生植物和多年生植物、水生和陆生植物以及有性和无性繁殖植物，优选为陆生植物、有性种子繁殖植物和被子植物。
10.一种权利要求1所述的花药特异性启动子的获得方法，是以矮牵牛的基因组DNA为模板，用核苷酸序列是序列表中序列2和核苷酸序列是序列表中序列3的一对引物进行PCR扩增得到启动子。
一种植物花药特异性启动子及其应用
技术领域
本发明涉及一种植物花药特异性启动子及其应用。
背景技术
启动子是基因表达调控因子中最重要的因子，它基本决定一个基因是否表达、何时表达和何处表达。按作用方式和功能，启动子大体可以分为组成型启动子、特异性启动子和诱导型启动子三大类[王关林，方宏筠，2002，植物基因工程原理与技术(第二版)，北京，科学技术出版社]。这种分类方式基本上反映了不同类型启动子各自的功能特点，但在某些情况下，一种类型的启动子往往兼有其它类型启动子的特性。
诱导型启动子(inducible promoter)是指其控制的基因在某些特定的物理、化学和生物信号(统称为“诱导子”或“诱导因子”)的刺激下，可以大幅度地增加转录水平。其特征为，该类型启动子控制的基因在没有诱导因子存在的条件下不表达或者只有非常低的表达(也称为“本底表达”)，但一旦受到诱导因子的诱导，基因的表达量迅速并且大幅度增加。诱导型启动子常常根据其诱导信号来分类和命名，例如：激素诱导启动子[Xu D等，1993，Plant Mol Biol，22(4)：573-588；Taylor JE等，1995，Plant J，7(1)：129-134]、化学诱导启动子(Williams S等，1992，Biol/Technol，10：540-543；综述见：Padidam M，2003，Curr Opinion in Plant Biol，6 169-177)、光诱导启动子[Sheen JY等，1987，Plant Mol Biol，8(3)：227-238；Matsuoka M等，1994，Plant J，6(3)：311-319]、热诱导启动子[Schoffl F等，1989，Mol GenGenet，217(2-3)：246-53]、创伤诱导启动子[Farmer EE等，1992，Plant Cell，4：129-134；Carrera E等，1998，Plant J，15(6)：765-771]、真菌诱导启动子(Fukuda Y等，1994，Plant Mol Biol，24(3)：485-493)和共生细菌诱导启动子(MiaoGH等，1993，Plant Cell，5：781-786)等。诱导型启动子往往也多少具有器官和/或组织特异性，例如烟草水杨酸诱导启动子PR-1a主要驱动基因在叶片中表达(WardER等，1993，Plant Mol Biol，22：361-366；Uknes S等，1993，Plant Cell，5：159-169；聂秀玲，2003，中国农业大学博士论文)。
组成型启动子(constitutive promoter)是指在该类型启动子控制下，结构基因的表达大体恒定在一定水平上，在不同器官和/或组织的表达水平也没有明显差异。其特点是：受其控制的结构基因的表达具有持续性，但不具有时空特异性；RNA和蛋白质表达量相对恒定，不受外界因素的诱导。例如：玉米Ubiqultin启动子和水稻的Actinl启动子。
器官或组织特异性启动子(organ-and/or tissue-specific promoter)，是指其调控基因的表达往往只发生植体的在某一或某些特定的器官和/或组织，或者往往只发生在植物生长发育的某一或某些特定阶段。其特征是受其控制或调节的基因表达具有明显的时空性，并往往表现出发育调节的特性。例如，根特异性启动子(YamamotoYT等，1991，Plant Cell，3：371-382)、拟南芥叶片特异性启动子Lhcb3[Taylor，WC，2001，Plant Mol Biol，46(3)：325-333)、番茄果实特异性启动子(PearJR等，1989，Plant Mol Biol，13：639-651)、水稻花药特异性启动子Osg6B(TsuchiyaT等，1994，Plant Mol Biol，20(6)：1189-1193)、PSP1(王胜华等，2001，四川大学学报(自然科学版)，38(4)：554-559)、PRP1(吴孝槐等，2003，科学通报，48(20)：2154-2161)、番茄花粉特异性启动子LAT52(Twell D等，1989，Mol GenGenet，217：240-245)、TomAl08(Xu XS and Chen RD，2006，Physiol and Biochem，25(3)：231-240)、烟草花药绒毡层特异性启动子TA29(Koltunow AM等，1990，PlantCell，2：1201-1224)、玉米花粉特异性基因启动子Zm13(Guerrero FD等，1990，MolGen Genet，224：161-168)、花药特异性启动子[Beachy RN等，1985，EMBO J，4(12)：3047-3053]、胚乳特异性启动子[Colot V等，1987，EMBO J，6(12)：3559-3564]、棉花纤维特异性启动子(Ma DP等，1997，Biochem Biophys Acta，1344：111-114)和韧皮部特异性启动子[Bostwick DE等，1994，Plant Mol Biol，26：887-897]等等。
花药是显花植物最主要的雄性器官，是雄配子---花粉形成、发育和成熟的场地，也是成熟或功能花粉释放的“器具”。它决定着花粉的命运，从而决定着花药植物能否繁衍后代。
花药的发育是一个非常复杂的过程，涉及大量基因的表达。杂交动力学研究发现，仅在处于发育第六期的烟草花药中就有大约25000种mRNA，其中约1000种是花药特异性表达的，在其它的营养组织和花器官中检测不到(Kamalay JC等，1980，Cell，19：935-946；1984，Proc Natl Acad Sci USA，81：2801-2805)。正是这些特异性的基因，使花药不同于植体的其它器官。因此，鉴定、分离和利用花药特异性基因，特别是克隆、功能分析和利用花药特异性基因的启动子，即花药特异性启动子一直是植物分子生物学，特别是植物生殖发育分子生物学的热点和重点。
在世界范围内已从拟南芥、金鱼草、矮牵牛、月见草、烟草、油菜、番茄、白桦、豚草、六月禾、百合、黑麦、水稻、向日葵和玉米等植物中鉴定出了100多个花药特异性基因(综述见：李胜国等，1997，生物工程进展，17：17-22；杨晓东，2000，中国农业大学硕士论文：曹克浩，2003；中国农业大学硕士论文；徐凤强，2003，中国农业大学硕士论文)和近千个cDNA[Amagai M et al，2003，Sexual Plant Reprod，15(5)：213-220，Endo M等，2004，Genes & Genetic Systems，79：213-226，ParkJI等，2006，Plant Cee Rep，25(5)：466-474]，其中，我国科学家从水稻中分离和克隆4个花药特异性基因：PS1[Zou JR等，1994，Amer J Bot，81(5)：552~56]、PSP1(王胜华等，2001，四川大学学报(自然科学版)，38(4)：554-559)、PRP1[吴孝槐等，2003，科学通报，48(20)：2154-2161]和RA39[Ding ZJ等，2003，SexualPlant Reprod，15(4)：205-212]。对部分克隆的花药特异性基因的表达研究表明，花药特异性基因的表达调控主要发生在转录水平，主要通过基因5’端的顺式元件与转录因子共同作用而实现这种调控[Mascarenhas JP，1990，Annu Rev Plant PhysiolPlant Mol Biol，41：317-338；Ariizumi T等，2002，Plant Cell Rep，21(1)：90-96])。在5’端的顺式调控元件中起核心作用的是启动子。
在国外花药特异性基因启动子的克隆和核心功能片段的分析在近十几年取得显著的进展。在已经分离的近百个花药特异性基因中，启动子已经被克隆并进行了核心功能片段分析的占1/4-1/3，主要是：烟草TA29和NeIF-4A8、森林烟草NSCHSLK、拟南芥A9、A6、APG、TUA1、nC1、LTP12、PGA4和XTH3、矮牵牛ChsA和CHIB(PB)、玉米Zm13、番茄LAT52、水稻RTS1、RTS2、Osg6B和RA8、油菜Bp4A、Bp10家族、Pcp1、SLG、OsRA8、NtmybAs1和NtmybAs2、BcA9、PRP1、RA39、peaEND1、5B-CRP、TomA108、OsRTS、PhMEZ1。
在国内，花药特异性基因启动子的克隆和功能分析近10年来已经展开，但主要是根据国外已经发表的序列通过PCR进行克隆，如烟草TA29、拟南芥A9和A6、玉米Zm13、水稻RTS2和Osg6B等(综述见：张爱民等，2000，中国科学基金，14(3)：132-135；肖兴国等，2003，植物学报，45(增)：92-103)，在国内克隆和分离的花药特异性启动子只有4个：从水稻中克隆的PS1[Zou JT等，1994，Amer J Bot，81(5)：552~56]、PSP1(王胜华等，2001，四川大学学报(自然科学版)，38(4)：554-559)、PRP1[吴孝槐等，2003，科学通报，48(20)：2154-2161]和RA39[Ding ZJ等，2003，SexualPlant Reprod，15(4)：205-212]。
花药特异性启动子不仅对花药、花粉的发育生物学和发育分子生物学的理论研究具有重要的意义，而且在阻止植物转基因通过花粉扩散而污染其野生种和近缘种和人工雄性不育/恢复的创建等方面具有重大的应用价值和广阔的市场前景。
在对花药、花粉的发育生物学和发育分子生物学的理论研究方面，Mariani等利用烟草花药特异性启动子TA29驱动细胞毒素基因Barnase，证明绒毡层对花粉的发育是必不可少的，同时也证明绒毡层对花药其它组织的分化和花药开裂没有影响(Mariani C等，1990，Nature，347：737-741)。Van der Meer等(1992，Plant Cell，4：253-262)将“花药盒”(anther-box)和CaMV 35S启动子串联驱动与CHS(查尔酮合成酶)的反义基因转化矮牵牛，阐明了CHS不仅对花瓣的类黄酮的合成具有重要的作用，而且花粉类黄酮的合成和花粉的活性也具有重要的作用。利用花药特异性启动子TA29驱动肌动蛋白(actin)反义基因，不仅证明了肌动蛋白在维持植物细胞骨架上的重要作用，而且创建了新型的人工雄性不育体系[李艳红，1999，中国农业大学博士论文；赵广荣，1999，西南农业大学博士论文；肖兴国等，2004，中国发明专利ZL00109108.5)。
在预防植物转基因通过花粉扩散而污染其野生种和近缘种方面，Wilkinson等(1997，J Exp Bot，48(2)：265-275)将花粉特异性启动子与靶基因的反义基因串联并以此转化含有组成性表达的靶基因的转基因植株，所得的转基因植株花粉中正义靶基因被反义靶基因封闭而不能表达或减弱表达，而其它组织器官中靶基因的表达不受影响，从而使转基因植物中靶基因的表达产物不会随花粉扩散或较少扩散。这一策略的有效性已被报告基因所证实。目前，通过花药或花粉特异性启动子来调控花粉的活力或育性已经成为预防植物转基因污染其野生种和近缘种的最主要的方法(Celis C等，2004，Nature，432(11)：222-225；Mlyarova L等，2006，Plant BiotechnolJ，4：445-452)。
在利用花药特异性启动子创建人工雄性不育植物(或作物)以大规模经济开发植物的杂种优势方面，国内外都取得了巨大的进展，也是花药特异性启动子应用最为广泛的领域。其基本原理是用花药特异性启动子驱动特定的目的基因在花药/花粉中表达，特异性地破坏花药组织、阻断花粉发育或使花粉对某种药剂敏感等可造成作物雄性不育。
Mariani C等利用从烟草花药绒毡层特异性启动子TA29与RNase T1或Barnase连接构建成嵌和基因，通过农杆菌介导转入烟草和油菜中，获得了稳定的雄性不育的转化株(Mariani C等，1990，Nature，1990，347：737-741)。随后，他们又用TA29驱动Bastar基因，创建了上述雄性不育系的恢复系(Mariani等，1992，Nature，357：384-387)。这一套基因工程雄性不育、保持和恢复系统已经成功地应用到油菜、花椰菜、菊苣、莴苣、番茄、棉花、玉米(综述见：Leemans J等，1992，In：Reproductivebiology and plant breeding，Springer-Verlag Press)和小麦上(De Block等，1997，Theor Appl Genet，95：125-131)。由此培育的油菜杂交种已经在加拿大和澳大利亚等国大面积栽培，由此培育的玉米杂交种已经被容许进行商品生产。在国内，许多研究人员采用该体系在烟草和油菜等作物上也得到相同或相似的结果(综述见：张爱民等，张爱民等，2000，中国科学基金，14(3)：132-135；肖兴国等，2003，植物学报，45(增)：92-103)。利用花药特异性启动子驱动反义基因来创建雄性不育植物或作物也获得巨大的成功，例如，反义CHS(Van der Meer等，1992，Plant Cell，4：253-262)、反义Bcpl(Xu HL等，1995，Proc.Natl Acad Sci USA，82：2106-2110)、反义actin(李艳红，1999，中国农业大学博士论文；赵广荣，1999，西南农业大学博士论文；肖兴国等，2004，中国发明专利ZL00109108.5)等等。利用花药特异性启动子驱动能将外源无毒物质转化为有毒物质的酶的基因还创建了化学调节性(或诱导性)雄性不育(Kriete G等，1996，Plant J，9(6)：809-818；王志林等，2005，中国农业大学博士论文)。
尽管利用花药特异性启动子来创建基因工程雄性不育系和恢复系已经获得巨大的成功，但绝大多数都依赖于来自烟草的花药特异性启动子TA29，其它的特异性启动子，如A9(Worrall D等，1992，Plant Cell，4：759-771；Paul等，1992)、Anther-box(van der Meer等，1992)、PS1(Zuo JT等，1994，Amer J Bot，81：552-561)、Osg6B[Tsuchiy T等，1995，Plant and Cell Physiol，36(3)：487-494；Matsuda N，1996，Plant and Cell Physiol，37(2)：215-222；Kitashiba H等，1999，Mol Breeding，5(2)：209-218；Kawanab T等，2006，Plant and Cell Physiol，47(6)：784-787]和LAT52[Muchietti J等，1994，Plant J，6(3)：321-328]等也有造成雄性不育的报道，但多数效果欠佳。
诱导型启动子(inducible promoter)是指其控制的基因在某些特定的物理、化学和生物信号(统称为“诱导子”或“诱导因子”)的刺激下，可以大幅度地增加转录水平。其特征为，该类型启动子控制的基因在没有诱导因子存在的条件下不表达或者只有非常低的表达(也称为“本底表达”)，但一旦受到诱导因子的诱导，基因的表达量迅速并且大幅度增加。诱导型启动子常常根据其诱导信号来分类和命名，例如：激素诱导启动子[Xu D等，1993，Plant Mol Biol，22(4)：573-588；Taylor JE等，1995，Plant J，7(1)：129-134]、化学诱导启动子(Williams S等，1992，Biol/Technol，10：540-543；综述见：Padidam M，2003，Curr Opinion in Plant Biol，6 169-177)、光诱导启动子[Sheen JY等，1987，Plant Mol Biol，8(3)：227-238；Matsuoka M等，1994，Plant J，6(3)：311-319]、热诱导启动子[Schoffl F等，1989，Mol GenGenet，217(2-3)：246-53]、创伤诱导启动子[Farmer EE等，1992，Plant Cell，4：129-134；Carrera E等，1998，Plant J，15(6)：765-771]、真菌诱导启动子(Fukuda Y等，1994，Plant Mol Biol，24(3)：485-493)和共生细菌诱导启动子(MiaoGH等，1993，Plant Cell，5：781-786)等。诱导型启动子往往也多少具有器官和/或组织特异性，例如烟草水杨酸诱导启动子PR-1a主要驱动基因在叶片中表达(WardER等，1993，Plant Mol Biol，22：361-366；Uknes S等，1993，Plant Cell，5：159-169；聂秀玲，2003，中国农业大学博士论文)。
组成型启动子(constitutive promoter)是指在该类型启动子控制下，结构基因的表达大体恒定在一定水平上，在不同器官和/或组织的表达水平也没有明显差异。其特点是：受其控制的结构基因的表达具有持续性，但不具有时空特异性；RNA和蛋白质表达量相对恒定，不受外界因素的诱导。例如：玉米Ubiqultin启动子和水稻的Actinl启动子。
器官或组织特异性启动子(organ-and/or tissue-specific promoter)，是指其调控基因的表达往往只发生植体的在某一或某些特定的器官和/或组织，或者往往只发生在植物生长发育的某一或某些特定阶段。其特征是受其控制或调节的基因表达具有明显的时空性，并往往表现出发育调节的特性。例如，根特异性启动子(YamamotoYT等，1991，Plant Cell，3：371-382)、拟南芥叶片特异性启动子Lhcb3[Taylor，WC，2001，Plant Mol Biol，46(3)：325-333)、番茄果实特异性启动子(PearJR等，1989，Plant Mol Biol，13：639-651)、水稻花药特异性启动子Osg6B(TsuchiyaT等，1994，Plant Mol Biol，20(6)：1189-1193)、PSP1(王胜华等，2001，四川大学学报(自然科学版)，38(4)：554-559)、PRP1(吴孝槐等，2003，科学通报，48(20)：2154-2161)、番茄花粉特异性启动子LAT52(Twell D等，1989，Mol GenGenet，217：240-245)、TomAl08(Xu XS and Chen RD，2006，Physiol and Biochem，25(3)：231-240)、烟草花药绒毡层特异性启动子TA29(Koltunow AM等，1990，PlantCell，2：1201-1224)、玉米花粉特异性基因启动子Zm13(Guerrero FD等，1990，MolGen Genet，224：161-168)、花药特异性启动子[Beachy RN等，1985，EMBO J，4(12)：3047-3053]、胚乳特异性启动子[Colot V等，1987，EMBO J，6(12)：3559-3564]、棉花纤维特异性启动子(Ma DP等，1997，Biochem Biophys Acta，1344：111-114)和韧皮部特异性启动子[Bostwick DE等，1994，Plant Mol Biol，26：887-897]等等。
花药是显花植物最主要的雄性器官，是雄配子---花粉形成、发育和成熟的场地，也是成熟或功能花粉释放的“器具”。它决定着花粉的命运，从而决定着花药植物能否繁衍后代。
花药的发育是一个非常复杂的过程，涉及大量基因的表达。杂交动力学研究发现，仅在处于发育第六期的烟草花药中就有大约25000种mRNA，其中约1000种是花药特异性表达的，在其它的营养组织和花器官中检测不到(Kamalay JC等，1980，Cell，19：935-946；1984，Proc Natl Acad Sci USA，81：2801-2805)。正是这些特异性的基因，使花药不同于植体的其它器官。因此，鉴定、分离和利用花药特异性基因，特别是克隆、功能分析和利用花药特异性基因的启动子，即花药特异性启动子一直是植物分子生物学，特别是植物生殖发育分子生物学的热点和重点。
在世界范围内已从拟南芥、金鱼草、矮牵牛、月见草、烟草、油菜、番茄、白桦、豚草、六月禾、百合、黑麦、水稻、向日葵和玉米等植物中鉴定出了100多个花药特异性基因(综述见：李胜国等，1997，生物工程进展，17：17-22；杨晓东，2000，中国农业大学硕士论文：曹克浩，2003；中国农业大学硕士论文；徐凤强，2003，中国农业大学硕士论文)和近千个cDNA[Amagai M et al，2003，Sexual Plant Reprod，15(5)：213-220，Endo M等，2004，Genes & Genetic Systems，79：213-226，ParkJI等，2006，Plant Cee Rep，25(5)：466-474]，其中，我国科学家从水稻中分离和克隆4个花药特异性基因：PS1[Zou JR等，1994，Amer J Bot，81(5)：552~56]、PSP1(王胜华等，2001，四川大学学报(自然科学版)，38(4)：554-559)、PRP1[吴孝槐等，2003，科学通报，48(20)：2154-2161]和RA39[Ding ZJ等，2003，SexualPlant Reprod，15(4)：205-212]。对部分克隆的花药特异性基因的表达研究表明，花药特异性基因的表达调控主要发生在转录水平，主要通过基因5’端的顺式元件与转录因子共同作用而实现这种调控[Mascarenhas JP，1990，Annu Rev Plant PhysiolPlant Mol Biol，41：317-338；Ariizumi T等，2002，Plant Cell Rep，21(1)：90-96])。在5’端的顺式调控元件中起核心作用的是启动子。
在国外花药特异性基因启动子的克隆和核心功能片段的分析在近十几年取得显著的进展。在已经分离的近百个花药特异性基因中，启动子已经被克隆并进行了核心功能片段分析的占1/4-1/3，主要是：烟草TA29和NeIF-4A8、森林烟草NSCHSLK、拟南芥A9、A6、APG、TUA1、nC1、LTP12、PGA4和XTH3、矮牵牛ChsA和CHIB(PB)、玉米Zm13、番茄LAT52、水稻RTS1、RTS2、Osg6B和RA8、油菜Bp4A、Bp10家族、Pcp1、SLG、OsRA8、NtmybAs1和NtmybAs2、BcA9、PRP1、RA39、peaEND1、5B-CRP、TomA108、OsRTS、PhMEZ1。
在国内，花药特异性基因启动子的克隆和功能分析近10年来已经展开，但主要是根据国外已经发表的序列通过PCR进行克隆，如烟草TA29、拟南芥A9和A6、玉米Zm13、水稻RTS2和Osg6B等(综述见：张爱民等，2000，中国科学基金，14(3)：132-135；肖兴国等，2003，植物学报，45(增)：92-103)，在国内克隆和分离的花药特异性启动子只有4个：从水稻中克隆的PS1[Zou JT等，1994，Amer J Bot，81(5)：552~56]、PSP1(王胜华等，2001，四川大学学报(自然科学版)，38(4)：554-559)、PRP1[吴孝槐等，2003，科学通报，48(20)：2154-2161]和RA39[Ding ZJ等，2003，SexualPlant Reprod，15(4)：205-212]。
花药特异性启动子不仅对花药、花粉的发育生物学和发育分子生物学的理论研究具有重要的意义，而且在阻止植物转基因通过花粉扩散而污染其野生种和近缘种和人工雄性不育/恢复的创建等方面具有重大的应用价值和广阔的市场前景。
在对花药、花粉的发育生物学和发育分子生物学的理论研究方面，Mariani等利用烟草花药特异性启动子TA29驱动细胞毒素基因Barnase，证明绒毡层对花粉的发育是必不可少的，同时也证明绒毡层对花药其它组织的分化和花药开裂没有影响(Mariani C等，1990，Nature，347：737-741)。Van der Meer等(1992，Plant Cell，4：253-262)将“花药盒”(anther-box)和CaMV 35S启动子串联驱动与CHS(查尔酮合成酶)的反义基因转化矮牵牛，阐明了CHS不仅对花瓣的类黄酮的合成具有重要的作用，而且花粉类黄酮的合成和花粉的活性也具有重要的作用。利用花药特异性启动子TA29驱动肌动蛋白(actin)反义基因，不仅证明了肌动蛋白在维持植物细胞骨架上的重要作用，而且创建了新型的人工雄性不育体系[李艳红，1999，中国农业大学博士论文；赵广荣，1999，西南农业大学博士论文；肖兴国等，2004，中国发明专利ZL00109108.5)。
在预防植物转基因通过花粉扩散而污染其野生种和近缘种方面，Wilkinson等(1997，J Exp Bot，48(2)：265-275)将花粉特异性启动子与靶基因的反义基因串联并以此转化含有组成性表达的靶基因的转基因植株，所得的转基因植株花粉中正义靶基因被反义靶基因封闭而不能表达或减弱表达，而其它组织器官中靶基因的表达不受影响，从而使转基因植物中靶基因的表达产物不会随花粉扩散或较少扩散。这一策略的有效性已被报告基因所证实。目前，通过花药或花粉特异性启动子来调控花粉的活力或育性已经成为预防植物转基因污染其野生种和近缘种的最主要的方法(Celis C等，2004，Nature，432(11)：222-225；Mlyarova L等，2006，Plant BiotechnolJ，4：445-452)。
在利用花药特异性启动子创建人工雄性不育植物(或作物)以大规模经济开发植物的杂种优势方面，国内外都取得了巨大的进展，也是花药特异性启动子应用最为广泛的领域。其基本原理是用花药特异性启动子驱动特定的目的基因在花药/花粉中表达，特异性地破坏花药组织、阻断花粉发育或使花粉对某种药剂敏感等可造成作物雄性不育。
Mariani C等利用从烟草花药绒毡层特异性启动子TA29与RNase T1或Barnase连接构建成嵌和基因，通过农杆菌介导转入烟草和油菜中，获得了稳定的雄性不育的转化株(Mariani C等，1990，Nature，1990，347：737-741)。随后，他们又用TA29驱动Bastar基因，创建了上述雄性不育系的恢复系(Mariani等，1992，Nature，357：384-387)。这一套基因工程雄性不育、保持和恢复系统已经成功地应用到油菜、花椰菜、菊苣、莴苣、番茄、棉花、玉米(综述见：Leemans J等，1992，In：Reproductivebiology and plant breeding，Springer-Verlag Press)和小麦上(De Block等，1997，Theor Appl Genet，95：125-131)。由此培育的油菜杂交种已经在加拿大和澳大利亚等国大面积栽培，由此培育的玉米杂交种已经被容许进行商品生产。在国内，许多研究人员采用该体系在烟草和油菜等作物上也得到相同或相似的结果(综述见：张爱民等，张爱民等，2000，中国科学基金，14(3)：132-135；肖兴国等，2003，植物学报，45(增)：92-103)。利用花药特异性启动子驱动反义基因来创建雄性不育植物或作物也获得巨大的成功，例如，反义CHS(Van der Meer等，1992，Plant Cell，4：253-262)、反义Bcpl(Xu HL等，1995，Proc.Natl Acad Sci USA，82：2106-2110)、反义actin(李艳红，1999，中国农业大学博士论文；赵广荣，1999，西南农业大学博士论文；肖兴国等，2004，中国发明专利ZL00109108.5)等等。利用花药特异性启动子驱动能将外源无毒物质转化为有毒物质的酶的基因还创建了化学调节性(或诱导性)雄性不育(Kriete G等，1996，Plant J，9(6)：809-818；王志林等，2005，中国农业大学博士论文)。
尽管利用花药特异性启动子来创建基因工程雄性不育系和恢复系已经获得巨大的成功，但绝大多数都依赖于来自烟草的花药特异性启动子TA29，其它的特异性启动子，如A9(Worrall D等，1992，Plant Cell，4：759-771；Paul等，1992)、Anther-box(van der Meer等，1992)、PS1(Zuo JT等，1994，Amer J Bot，81：552-561)、Osg6B[Tsuchiy T等，1995，Plant and Cell Physiol，36(3)：487-494；Matsuda N，1996，Plant and Cell Physiol，37(2)：215-222；Kitashiba H等，1999，Mol Breeding，5(2)：209-218；Kawanab T等，2006，Plant and Cell Physiol，47(6)：784-787]和LAT52[Muchietti J等，1994，Plant J，6(3)：321-328]等也有造成雄性不育的报道，但多数效果欠佳。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物花药特异性启动子及其应用。
本发明所提供的植物花药特异性启动子，它的核苷酸序列是：(1)、序列表中序列1所述的核苷酸序列；或(2)、与(1)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列；或(3)、与(1)或(2)所述的核苷酸序列具有60％或60％以上同源性的核苷酸序列；或(4)、与(1)、(2)或(3)所述的核苷酸序列在严谨杂交条件下能够杂交的核苷酸序列。
含有上述花药特异性启动子的表达盒也属于本发明的保护范围。
在所述表达盒中，所述花药特异性启动子的下游连接结构基因，或调节基因，或结构基因或调节基因的反义基因，或者能够干扰内源基因表达的小RNA，用于驱动结构基因，或调节基因，或结构基因或调节基因的反义基因，或者天然小RNA或人工合成的小RNA的表达。
含有上述花药特异性启动子的重组表达载体也属于本发明的保护范围，所述重组表达载体是含有上述表达盒与质粒、病毒或运载体表达载体所构建的重组载体所述重组表达载体为重组植物表达载体，所述重组植物表达载体上述表达盒并且能够将所述的表达盒转送进入植物宿主细胞、组织或器官及其后代并且能够或者至少方便所述的表达盒整合到宿主的基因组中，它包括但不限于双元载体、共合载体。
上述重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导或基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织或器官，得到转基因植物细胞或组织或器官及由此分化、再生的完整植株及其无性系或其后代。
本发明还提供了一种上述花药特异性启动子的获得方法，是以矮牵牛的基因组DNA为模板，用核苷酸序列是序列表中序列2和核苷酸序列是序列表中序列3的一对引物进行PCR扩增得到启动子。
实验证明，本发明花药特异性启动子PhFD可启动报告基因GUS在烟草的花药中特异表达，而在其它花器官和营养器官都没有检测到表达。
将本发明的启动子下游衔接内源基因的反义基因、能够干扰内源基因表达的小RNA(包括天然的和人工合成的小RNA)或外源基因，构建表达盒并与不同的表达载体连接，转化到植物中，利用其花药异性表达活性，在花药中特异性表达其控制或指导的所述的反义基因、外源基因或小RNA。在转基因植株中使其内源基因的反义基因、能够干扰内源基因表达的小RNA(包括天然的和人工合成的小RNA)或外源基因的表达局限于花药中，排除了这些基因在植体其它部位的表达。
利用本发明的启动子的花药特异性表达活性，用含有本发明启动子或该启动子与内源基因的反义基因、能够干扰内源基因表达的小RNA(包括天然的和人工合成的小RNA)或外源基因的融合片段的表达载体转化宿主细胞或宿主组织及其后代细胞，并由此再生完整的转基因植株，培育雄性不育系植物或作物品种、能够防止转基因通过花粉漂移而污染其野生种和近缘种的转基因植物或作物品种、货架寿命延长的花卉植物或作物品中和“飞絮”消除或大幅度减少的飞絮园林绿化植物或作物品种等。此外，通过将能够增强耐受胁迫(例如寒冷天气，干旱，热等)的结构基因与本发明的启动子序列或其他部分相连接增强雄性器官的授精能力。所述植物是显花植物，包括但不限于被子植物和裸子植物、单子叶植物和双子叶植物、草本植物、藤本植物和木本植物、园林园艺植物和农作物及牧草植物、一年生植物和多年生植物、水生和陆生植物以及有性和无性繁殖植物，优选为陆生植物、有性种子繁殖植物和被子植物。
本发明的花药特异性启动子可用于功能分析、鉴定和分离植物花药发育所必须的基因、创建人工雄性不育植物和预防植物转基因通过花粉传播而污染转基因植物的亲缘种和野生种。具体可在本发明的花药特异性启动子下游衔接异源或同源基因或其反义基因或小RNA，并构建到植物表达载体，转化宿主植物，在其花药表达目的蛋白、抑制或干扰目标基因的转录或翻译，以增强或降低花药和/或花粉的生活力。本发明分离的花药特异性启动子PhFD对植物花药生长和发育基因的功能分析和鉴定、人工雄性不育系的创建、植物转基因漂移或逃逸的预防和延长花卉的货架寿命等都具有重大的应用前景。
附图说明
图1为含有花药特异性启动子PhFD的载体pUFD的酶切鉴定电泳图。
图2为花药特异性启动子PhFD的DNA序列。
图3为花药特异性启动子PhFD驱动GUS基因(PhFD::GUS)植物表达载体pRDFDG的构建流程图。
图4为转pRDFDG烟草T0代植株与野生型植株的花药和花粉的GUS染色图。
图5为转pRDFDG烟草T0代植株与野生型植株GUS染色花药的解剖图。
图6为转pRDFDG烟草T1代植株与野生型植株试管苗与成熟花粉的GUS染色图。
本发明所提供的植物花药特异性启动子，它的核苷酸序列是：(1)、序列表中序列1所述的核苷酸序列；或(2)、与(1)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列；或(3)、与(1)或(2)所述的核苷酸序列具有60％或60％以上同源性的核苷酸序列；或(4)、与(1)、(2)或(3)所述的核苷酸序列在严谨杂交条件下能够杂交的核苷酸序列。
含有上述花药特异性启动子的表达盒也属于本发明的保护范围。
在所述表达盒中，所述花药特异性启动子的下游连接结构基因，或调节基因，或结构基因或调节基因的反义基因，或者能够干扰内源基因表达的小RNA，用于驱动结构基因，或调节基因，或结构基因或调节基因的反义基因，或者天然小RNA或人工合成的小RNA的表达。
含有上述花药特异性启动子的重组表达载体也属于本发明的保护范围，所述重组表达载体是含有上述表达盒与质粒、病毒或运载体表达载体所构建的重组载体所述重组表达载体为重组植物表达载体，所述重组植物表达载体上述表达盒并且能够将所述的表达盒转送进入植物宿主细胞、组织或器官及其后代并且能够或者至少方便所述的表达盒整合到宿主的基因组中，它包括但不限于双元载体、共合载体。
上述重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导或基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织或器官，得到转基因植物细胞或组织或器官及由此分化、再生的完整植株及其无性系或其后代。
本发明还提供了一种上述花药特异性启动子的获得方法，是以矮牵牛的基因组DNA为模板，用核苷酸序列是序列表中序列2和核苷酸序列是序列表中序列3的一对引物进行PCR扩增得到启动子。
实验证明，本发明花药特异性启动子PhFD可启动报告基因GUS在烟草的花药中特异表达，而在其它花器官和营养器官都没有检测到表达。
将本发明的启动子下游衔接内源基因的反义基因、能够干扰内源基因表达的小RNA(包括天然的和人工合成的小RNA)或外源基因，构建表达盒并与不同的表达载体连接，转化到植物中，利用其花药异性表达活性，在花药中特异性表达其控制或指导的所述的反义基因、外源基因或小RNA。在转基因植株中使其内源基因的反义基因、能够干扰内源基因表达的小RNA(包括天然的和人工合成的小RNA)或外源基因的表达局限于花药中，排除了这些基因在植体其它部位的表达。
利用本发明的启动子的花药特异性表达活性，用含有本发明启动子或该启动子与内源基因的反义基因、能够干扰内源基因表达的小RNA(包括天然的和人工合成的小RNA)或外源基因的融合片段的表达载体转化宿主细胞或宿主组织及其后代细胞，并由此再生完整的转基因植株，培育雄性不育系植物或作物品种、能够防止转基因通过花粉漂移而污染其野生种和近缘种的转基因植物或作物品种、货架寿命延长的花卉植物或作物品中和“飞絮”消除或大幅度减少的飞絮园林绿化植物或作物品种等。此外，通过将能够增强耐受胁迫(例如寒冷天气，干旱，热等)的结构基因与本发明的启动子序列或其他部分相连接增强雄性器官的授精能力。所述植物是显花植物，包括但不限于被子植物和裸子植物、单子叶植物和双子叶植物、草本植物、藤本植物和木本植物、园林园艺植物和农作物及牧草植物、一年生植物和多年生植物、水生和陆生植物以及有性和无性繁殖植物，优选为陆生植物、有性种子繁殖植物和被子植物。
本发明的花药特异性启动子可用于功能分析、鉴定和分离植物花药发育所必须的基因、创建人工雄性不育植物和预防植物转基因通过花粉传播而污染转基因植物的亲缘种和野生种。具体可在本发明的花药特异性启动子下游衔接异源或同源基因或其反义基因或小RNA，并构建到植物表达载体，转化宿主植物，在其花药表达目的蛋白、抑制或干扰目标基因的转录或翻译，以增强或降低花药和/或花粉的生活力。本发明分离的花药特异性启动子PhFD对植物花药生长和发育基因的功能分析和鉴定、人工雄性不育系的创建、植物转基因漂移或逃逸的预防和延长花卉的货架寿命等都具有重大的应用前景。
附图说明
图1为含有花药特异性启动子PhFD的载体pUFD的酶切鉴定电泳图。
图2为花药特异性启动子PhFD的DNA序列。
图3为花药特异性启动子PhFD驱动GUS基因(PhFD::GUS)植物表达载体pRDFDG的构建流程图。
图4为转pRDFDG烟草T0代植株与野生型植株的花药和花粉的GUS染色图。
图5为转pRDFDG烟草T0代植株与野生型植株GUS染色花药的解剖图。
图6为转pRDFDG烟草T1代植株与野生型植株试管苗与成熟花粉的GUS染色图。
具体实施方式
本发明中所述的启动子核苷酸序列可以是其中一个或多个核苷酸发生取代、缺失、插入或倒位的核苷酸序列，即所分离的核苷酸序列的人工突变体或“天然”突变体，它保留其启动子功能；还可以是所述的核苷酸序列与其它启动子序列或启动子区保守调控序列(“motif”或“box”)的融合序列。本发明中所述的“启动子”包括具有或不具有TATA盒(TATA box)的启动子；TATA盒或类似区域，它定位于转录起始位点(+1)上游并且具有指导RNA聚合酶在正确位置上启动转录的功能，但不限于该区域附近的部分；此外，它还含有与除RNA聚合酶以外的蛋白质相关联的用于调节表达的另一个必须区域。本发明中所述的“启动子区域”定义为含有上文中定义的启动子的区域。本发明中所述的“启动子活性”是指当以某种基因的可表达方式将其连接到启动子的下游，并导入到宿主中，该宿主显示具有在宿主内或宿主外生产该基因产物的能力和功能时，该启动子具有启动活性。通常，是将编码容易定性或定量检测的蛋白质的基因(报告基因)连接到该启动子的下游，将该基因导入宿主内，并检测所表达的蛋白质，可确定特定启动子的活性或是否存在该启动子或者该启动子的效力。本发明中所述的结构基因是指能够编码某种蛋白质或其它活性物质功能的一段核苷酸序列，包括RNA或DNA序列。所述的调节基因是指其编码的某种RNA或蛋白质或其它活性物质能够对其它结构基因的表达进行调节或调控的一段核苷酸序列，包括RNA或DNA序列。所述的正义基因包括上述的结构基因和调节基因。所述的反义基因是指与上述结构基因或调节基因编码的RNA互补的RNA或BNA序列。所述的内源基因是指来自宿主自身的基因，包括RNA或DNA序列。所述外源基因是指任何一段核酸序列，并具有编码某种蛋白质或其它活性物质功能，包括天然的和人工合成的RNA或DNA序列，该序列与花药特异性启动子在正常情况不相结合。所述的小RNA是指分离自生物体的或人工合成的RNA序列片段，其长度通常为20-26个脱氧核苷酸或者在导入宿舍细胞后能够被剪切成20-26个脱氧核苷酸的RNA片段，它本身对生物体无毒或毒性极低。
本发明中所述的表达载体是指现有技术中已知的、能够在植物中进行表达的任何一种植物载体，例如pBin19、pBI121(美国ClonTech公司产品)和pCAMBIA系列(澳大利亚CAMBIA中心产品)等。
本发明中所述的转化是指现有技术中已知的、能够将外源基因导入植物细胞或植物组织的任何一种植物转化方法，如农杆菌介导法和基因枪等。
本发明中所述的宿主细胞或宿主组织或宿主器官及其后代细胞是指所有植物细胞或植物组织或植物器官或由这些细胞、组织或器官通过组织分化或无性胚再生并且发育成熟的整体植株(包括种子)。
术语“核酸序列”或“核苷酸序列”指含有天然存在的核苷酸或核苷单体的序列。该序列也包括具有相似功能的非天然存在的单体或其部分的修饰的或取代的序列。
术语“花药特异性启动子”是指能够指导其控制下的基因仅仅在花药表达而在植体的其它器官不表达的启动子。
术语“具有60％或60％以上同源性的序列”是指与(1)或(2)中的序列相比有60％或60％以上的核苷酸序列相同或相似的那些核酸序列或核苷酸序列，这些序列以基本相同的方式发挥作用并且能够驱动其下游基因的花药特异性表达，它们与(1)或(2)中序列的差异可能是由于局部结构上的修饰或突变，包括人工突变和非人工突变。
术语“杂交的序列”是指可以在严谨杂交条件下与(1)、(2)、(3)或(4)的序列杂交的核酸序列。“严谨杂交条件”是指本领域技术人员已知的，或者可以在分子生物学或基因工程实验指南，例如《Molecular Cloning》(3rdEd)(Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，2001)(以下简称“《分子克隆》第三版”)中的通用方案中找到，具体为在2×SSPE(或2×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
T0代表示由愈伤组织得到的转基因植株及其无性系，T1表示T0代自交产生的种子及由它所长成的植株和无性系。
实施例1、矮牵牛花药特异启动子PhFD的克隆与分离1、矮牵牛总DNA的提取取温室盆栽的矮牵牛(Petunia x hybrida)品种“Big Bleu”(各花卉公司均有出售)嫩叶片1-2g，用CTAB法(《分子克隆》第三版)提取总DNA。取1-5ul DNA样品，用紫外分光光度计测量其浓度和纯度，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度和完整性。将提取的DNA于-20℃保存。
2、PCR扩增与扩增片段的回收设计并合成如下两条引物(引物1和引物2)扩增矮牵牛花药特异启动子，为了方便以后的克隆和构建，在两条引物的5’端分别加入了限制性内切酶HindIII和Bam HI的识别序列位点(下列引物序列中的下划线序列)引物1：5’-AAGCTTGTCGACTAAATTGAAACAG-3’(Hind III)引物2：5’-GGATCCGAAAACTGGGGGAAGGTAG-3’(Bam HI)以步骤1提取的矮牵牛基因组DNA为模板，进行PCR反应：反应体系为：模板DNA： 800ng；10X Exbuffer： 2ul；dNTP混合物(2.5mM)： 2ul；ExTaq DNA Polymerase(5U/ul)： 0.5ul；引物1(10uM)： 2ul；引物2(10uM)： 2ul；无菌重蒸馏水(sddH20)： 补足至20ul。
PCR反应程序：先预变性94℃5min；然后94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，35个循环。
PCR反应完成后，取15ul扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下快速用一次性刀片小心切下位于350bp左右的特异片段，用DNA片段回收试剂盒回收并纯化(Easy-NA Gel Extraction Kit，德国Omeg-Bio/TEK产品)，溶于50ul ddH2O中，-20℃保存备用。
3、回收片段的亚克隆与测序将步骤2回收的片段插入到载体pUCm-T(上海生工生物工程技术服务有限公司产品)，将经测序表明正确的载体命名为pUFD。将所得到的pUFD通过“冻融法”转化到大肠杆菌菌株DH5α感受态细胞，转化的DH5α。在含氨苄青霉素100mg/L的LB固体培养基上于37℃过夜培养，挑取平板上生长的白色菌落，接入氨苄青霉素100mg/L的LB液体培养基中于37℃过夜培养。当菌液浓度达到OD600为0.6时，离心收集菌体，按小量碱裂解法(《分子克隆》第三版)提取质粒，用限制性酶HindIII和Bam HI双酶切后，用2.0％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下可见分子大小大约分别为2800bp(载体带)和350bp(目标带)两条带(图1)。图1中，泳道1和泳道3为分子量标记：泳道1：100bp DNA marker；泳道3：λDNA/Eco RI+Hind III marker；泳道2为pUFD的酶切结果；箭头所指为分子量标记相应带的大小。
将所需要的克隆和由此提取的质粒(pUFD)送交商业测序公司测序(原上海博雅生物技术服务有限公司，现已并入Introgen公司)，测序表明确证pUFD中含有矮牵牛花药特异启动子，序列如图2所示，矮牵牛花药特异启动子具有序列表中序列1的核苷酸序列，将具有序列表中序列1的核苷酸序列的矮牵牛花药特异启动子命名为PhFD。图2中，下划线者为所用的引物序列(上述引物1和引物2)，斜体为外加的限制性内切酶识别位点(HindIII和BamH I)。
实施例2、花药特异启动子驱动GUS基因(PhFD::GUS)植物表达载体pRDFDG的构建花药特异启动子驱动GUS基因(PhFD::GUS)植物表达载体pRDFDG的构建流程如图3所示，具体方法如下所述：将pUFD经限制性内切酶Hind III和Bam HI双酶切后，得到花药特异启动子PhFD片段，用冻融法(《分子克隆》第三版)或DNA片段回收试剂盒(Easy-NA GelExtraction Kit，德国Omeg-Bio/TEK产品)回收并纯化花药特异启动子PhFD片段，与经过Hind III和Bam HI双酶切的植物表达载体pRD410(加拿大PBI产品)的大片段(大约为13.6kb)相连，得到重组质粒。将所得到重组质粒用“冻融法”(《分子克隆》第三版)转化到大肠杆菌菌株DH5a。转化的DH5α在含氨苄青霉素100mg/L和卡那霉素50mg/L的LB固体培养基上于37℃过夜培养，挑取平板上生长的单菌落，接入含氨苄青霉素100mg/L和卡那霉素50mg/L的LB液体培养基中于37℃振荡过夜培养。当菌液浓度达到OD600值0.5-0.6时，离心收集菌体，按上述小量碱裂解法提取质粒，用限制性内切酶Hindll和BamHI双酶切后，在2.0％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下可见分子大小分别约为13.5kb(pRD410载体带)和350bp(PhFD)两条带，并且进行了测序验证，将酶切和测序表明含有花药特异启动子PhFD片段和pRD410酶切得到的大片段的重组表达载体命名为pRDFDG。pRDFDG中GUS基因需要花药特异启动子驱动表达。
实施例3、转基因(PhFD)烟草的鉴定1、农杆菌的转化与转化子的鉴定用CaCl2法(《分子克隆》第三版)制备根癌农杆菌菌株LBA4404(美国LifeTechnology公司产品)的感受态细胞。利用冻融法(《分子克隆》第三版)将重组的植物表达载体pRDFDG转入制备的LBA4404的感受态细胞。将转化的LBA4404细胞接种到含有链霉素(Str)100mg/L和卡那霉素(Kan)50mg/L的YEB固体培养基，置于28℃在暗处培养48-72h，挑取平板上的单菌落，接入含有链霉素100mg/L和卡那霉素50mg/L的YEB液体培养基，在28℃振荡过夜培养。当培养物的浓度达到OD600值0.4-0.5时，取少量菌液(1.5-2ml)，按上述小量碱裂解法提取质粒，用限制性内切酶Hind III和Bam HI双酶切鉴定，在2.0％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下可见分子大小大约分别为13.5kb(载体带)和350bp(PhFD)两条带，并测序鉴定，将酶切和测序鉴定表明含有PhFD正确的阳性克隆命名为pRDFDG/LBA4404。
2、转PhFD基因烟草(转pRDFDG烟草)的获得1)农杆菌的准备挑取携带植物表达载体pRDFDG的农杆菌LBA4404(pRDFDG/LBA4404)单菌落，接种于5ml含链霉素(Str)100mg/L和卡那霉素(Kan)50mg/L的YEB液体培养基中，28℃振荡培养过夜培养，取活化的农杆菌液，按1∶50的比例加入到含链霉素(Str)100mg/L和卡那霉素(Kan)50mg/L的YEB液体培养基中，继续培养至OD600值为0.4-0.6；4000rpm离心5min，收集菌体；用1/2MSO液体培养基(MS无机盐+B5维生素+肌醇0.1g/L+蔗糖30g/L，pH 5.8)洗涤菌体一次，并将其稀释到离心前菌液5倍体积的1/2MS液体培养基中，准备侵染用。
2)烟草的转化与转化植株的再生烟草的转化根据叶盘法(Horsch RB等，1985，Science，227：1229-1231)进行。选取约30天苗龄的烟草(品种“NC89”，种子购自中国农业科学院)无菌苗，切下鲜嫩浓绿的叶片，用直径9mm的打孔器制取叶盘外植体；将新制备的外植体投入已准备好的农杆菌(pRDFD6/LBA4404)菌液中，侵染15min；取出叶盘，用高压灭菌的吸水纸吸除叶盘表面残余的农杆菌菌液，置于固体再生培养基(MS无机盐+B5维生素+肌醇0.1g/L+BA 2.0mg/L+IAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉0.7％，pH 5.8)上暗处共培养2天；将共培养的叶盘转到含有羧苄青霉素(Carb)500mg/L和Kan 50mg/L的固体再生培养基进行筛选培养，每隔2-3周更换一次培养基，并逐渐降低Carb至200mg/L。待Kan抗性芽长到1-1.5cm时，将其切下换到含有Carb 200mg/L和Kan 50mg/L的固体生根培养基(MS无机盐+B5维生素+肌醇0.1g/L+IAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉0.7％，pH 5.8)上诱导生根，获得50多株完整的卡那霉素抗性的转pRDFDG烟草植株。
3)转基因烟草的分子鉴定首先对步骤2)得到的Kan抗性转pRDFDG烟草植株进行PCR鉴定。根据上述的CTAB法提取转pRDFDG烟草(Kan抗性株)和未转基因NC89烟草(对照)的叶片基因组DNA，用花药特异性启动子PhFD两端特异性引物对(引物1：5’-AAG CTTGTC GAC TAA ATT GAA ACA G-3’；引物2：5’-GGA TCC GAA AAC TGG GGG AAGGTA G-3’)进行PCR扩增，转pRDFDG烟草均扩增得到大小为350bp的目标带，而未转化的对照烟草在相应位置则没有扩增出此目标片段。这一结果初步表明目标基因(PhFD::GUS)已整合到烟草基因组中。
为了进一步确认PhFD基因已经整合到转pRDFDG烟草基因组中，对具有Kan抗性和PCR检测呈阳性的转pRDFDG烟草再进行Southern杂交检测。
根据上述的CTAB法提取具有Kan抗性和PCR检测阳性的转pRDFDG烟草和未转基因NC89烟草(对照)的叶片基因组DNA(10μg)，分别用HindIII和Eco RI于37℃过夜酶切消化，与作为阳性对照未酶切的表达载体质粒pRDFDG一起，通过电泳法(0.7v/cm)在0.8％琼脂糖凝胶上分离酶切后的DNA 16-20h，分离后的DNA用向上毛细管转移法(《分子克隆》第三版)转移到一带正电荷的尼龙膜(德国Boehringer Mannheim公司产品)上。
用内切酶BamHI和Hind III从表达载体质粒pRDFDG上切下约350bp的PhFD片段，以此作为模板，利用地高辛DNA标记试剂盒(瑞士Roche公司产品，Cat.No.1093657)所带的DIG-标记dNTP和酶，对上述模板DNA进行标记，作为探针。以标记好的单链DNA作为探针，按照地高辛DNA标记试剂盒说明书所叙述的方法，将制备好的探针与上述尼龙膜杂交，并用试剂盒碱性磷酸酶标记地高辛抗体(Anti-Digoxigenin-AP，alkaline phosphotase)进行检测。结果显示，阳性对照质粒出现一条很明显的大约13.9kb的杂交带；用Hind III酶切的转pRDFDG烟草植株DNA均呈现阳性，出现1-3条杂交带，而未转基因的对照植株NC89则无杂交带出现；用Eco RI酶切的转pRDFDG植株基因组出现1-4条杂交带，未转基因的对照植株NC89则无杂交带出现。此结果确证，pRDFDG已经整合到转基因烟草的基因组中。
实施例4、转pRDFDG烟草GUS基因表达的组织化学检测将同时具有卡那霉素抗性、PCR和Southern检测呈阳性的转pRDFDG烟草T0代株系和未转基因的烟草NC89对照植株(CK)试管苗在三角瓶中开口炼苗一周，然后移入装有普通花卉营养土的花盆，在温室中培养，第一周套袋保湿，之后去袋并进行常规管理。
转基因烟草GUS基因表达的组织化学检测按照Jefferson RA[1987，Plant MolBiol Rep，5(4)：387-405]的方法进行。将转基因植物及其对照的新鲜的根、茎、叶、花萼、花瓣、花丝、子房、柱头和不同发育时期的花药在X-GLuc溶液中温育24-48h进行染色，然后将染色的植物材料分别用70％和100％的乙醇彻底漂洗脱色和固定，在显微镜下观测样品并拍照。GUS染色的结果见表1。
表1、转pRDFDG烟草T0代的GUS染色
注：表中“+”表示GUS染色阳性；“++”表示染色强度较高“+++”表示染色强度最高；“-”表示GUS染色阴性；花药为发育时期III-IV的花药，花药发育时期的划分见表2。
由表1可见，未转基因的对照植株(CK)的各个器官都不能染色，而在检测的转pRDFDG烟草的15个PCR阳性T0代株系中，除了2个株系(株系6和12)之外，其它13个株系的花药都能不同程度地被染色(图4中A)，而其它器官，如根、茎、叶、花萼、花瓣、花丝、子房和柱头等均未染出蓝色。在株系8中，除了花药能染色外，花粉也被染出很强的蓝色(图4中B)。这些结果显示出GUS染色的花药特异性，即表明启动子PhFD具有花药特异性驱动活性。图4中，图4中A为未转基因对照的花药(左)与转pRDFDG烟草(株系3)的花药(右)的GUS染色；图4中B为未转基因的对照的花粉(左)与转pRDFDG烟草(株系8)的花粉(右)的GUS染色。
为了进一步明确转基因植株花药各个发育时期GUS基因的表达情况，对花药的不同发育时期(Koltunow AM等，1990，Plant Cell，2：1201-1224)进行了GUS染色。依据曹克浩(2003，中国农业大学硕士论文)总结的花药不同发育时期的烟草花蕾大小特征(表2)，以花蕾大小相对应的花药大小和发育阶段，对花药的各个时期进行了染色。结果表明，花药染色阳性时期在发育的II、III、IV期，即从而花药绒毡层和花粉母细胞出现一直到绒毡层降解和开始出现二核花粉粒的阶段；花粉染色阳性时期在IV、V期，即从出现成熟二核花粉粒至花粉成熟期。
表2、烟草花药不同发育时期的花蕾大小特征
实施例5：转pRDFDG烟草花药GUS基因表达的解剖观察为了进一步明确PhFD::GUS嵌合基因在转pRDFDG烟草花药不同组织部位的表达情况，对GUS染色的花药进行石蜡切片解剖观察。石蜡切片按照张丕方和倪德祥(1985，植物制片技术——石蜡切片法。见《植物生理学实验手册》，上海科学技术出版社)的方法制作。石蜡切片的显微观察结果表明，大多数pRDFDG烟草T0代株系的花药GUS染色都发生在花药的表皮细胞和花药壁细胞，而在花药的其它部位如药隔等，都未见GUS染色(图5右)。例外的是转pRDFDG烟草T0代株系8(花药和花粉都有强烈的GUS染色，见表1)，可以明显地看到花药表皮细胞、壁细胞和花粉都被染成强蓝色，但药隔部位仍然未显蓝色。图5为未转基因对照植株花药(左图)和转pRDFDG烟草植株(株系8)花药(右图)经GUS染色后的横切解剖图。
从转pRDFDG烟草植株花药特异性GUS表达的时间及在组织部位来看，GUS的表达主要集中在花药发育的第II、III、IV期，即从花药绒毡层出现到花粉粒成熟。
实施例6：转pRDFDG烟草T1代GUS表达将转pRDFDG烟草T0代株系3、8和10所结的种子(T1代)及其未转基因的对照种子(NC89)表面消毒后接种到含有Kan 100mg/L的种子萌发培养基(1/2MS)，暗培养7天，后置于光下于25±1℃培养30天后统计Kan抗性阳性苗的比例(表3)。
表3、转pRDFDG烟草T1代Kan抗性苗的比例
注：CK1：未转基因植株种子(NC89)在没有选择压的培养基(不含有Kan)上；CK2：未转基因植株种子(NC89)在有选择压的培养基(含有Kan 100mg/L)上。
由表3可以看出，未转基因烟草植株的T1代种子在没有Kan选择压下(CK1)的发芽率为86.7％，而在选择压存在时(CK2)不能产生苗。三个转基因株系的T1代种子在有选择压时，抗性芽的比例在56-62％，按照与无选择压力下可发芽种子的比率计算，抗性芽率为65-72％。
将转基因T0代株系3、8和10的T1代抗性苗各随机选10株进行试管培养，得到旺盛生长的大苗后取其营养器官进行GUS染色。T0代株系29、56和68的T1代种子播种于温室花盆，T1苗长到有2-3片真叶时取叶盘进行体外抗Kan试验，每个株系随机选留3株发育到成熟，发育过程中，取不同的器官和组织按照前文已述的方法进行GUS染色。以确定转pRDFDG烟草中PhFD::GUS在T1代的稳定性和表达特异性。GUS染色结果见表4，试管苗与成熟花粉GUS染色图见图6。表4中FD-3-1表示转pRDFDG烟草株系3的T1代的第一个植株，其他以此类推；CK表示未转基因植株(NC89)。
表4、转pRDFDG烟草T1代Kan抗性苗的GUS染色
注：表中“+”表示GUS染色阳性；“++”表示染色较强“+++”表示染色最强；“-”表示GUS染色阴性，nt表示未检测。
由表4可以看出，由PhFD驱动的GUS基因在转pRDFDG烟草中能够稳定地传递给后代，并且GUS基因在所有检测的后代植株试管苗和温室苗的营养器官都不表达，只特异性地在花药中表达。
在图6中，图6中A为未转基因对照(CK，左)和转pRDFDG烟草(右)T1代试管苗的GUS染色，图6中B为未转基因对照(CK，左)与转pRDFDG烟草(株系29-1)T1代花粉的GUS染色。
上述的实施例结果表明并且确证，本发明所提供的矮牵牛花药特异性启动子PhFD不仅具有良好的花药特异性和花药特异性活性，而且该特异性能够稳定地传递给后代。因此，本发明所提供的分离自矮牵牛的启动子PhFD是一个稳定、驱动力和特异性都很强的花药特异性启动子。
序列表<160>1<210>1<211>354<212>DNA<213>矮牵牛属矮牵牛(Petunia x hybrida)<400>1gtcgactaaa ttgaaacaga acaaggagtt cgaatggacc cctgaatgtc agcaagcact 60taaggatttg aagcggtact tgtcaagccc gcctttactt tcaacgccac aaccaggtga 120acaactattg ctctacctgg ccgtgtctga gtctgcggta agtgcagttt tggttcgaga 180agacaaaggt aagcaactac caatttatta cattagcaaa tccttattag atgctgaaac 240ccgctatcaa cctttggaga aattagcact agcattggta atcgctgccc gtaaattaag 300accttatttt caaagtcact caatagctgt agttactacc ttccccgagt tttc 354<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2aagcttgtcg actaaattga aacag 25<210>3<211>25<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3ggatccgaaa actgggggaa ggtag 25
本发明中所述的表达载体是指现有技术中已知的、能够在植物中进行表达的任何一种植物载体，例如pBin19、pBI121(美国ClonTech公司产品)和pCAMBIA系列(澳大利亚CAMBIA中心产品)等。
本发明中所述的转化是指现有技术中已知的、能够将外源基因导入植物细胞或植物组织的任何一种植物转化方法，如农杆菌介导法和基因枪等。
本发明中所述的宿主细胞或宿主组织或宿主器官及其后代细胞是指所有植物细胞或植物组织或植物器官或由这些细胞、组织或器官通过组织分化或无性胚再生并且发育成熟的整体植株(包括种子)。
术语“核酸序列”或“核苷酸序列”指含有天然存在的核苷酸或核苷单体的序列。该序列也包括具有相似功能的非天然存在的单体或其部分的修饰的或取代的序列。
术语“花药特异性启动子”是指能够指导其控制下的基因仅仅在花药表达而在植体的其它器官不表达的启动子。
术语“具有60％或60％以上同源性的序列”是指与(1)或(2)中的序列相比有60％或60％以上的核苷酸序列相同或相似的那些核酸序列或核苷酸序列，这些序列以基本相同的方式发挥作用并且能够驱动其下游基因的花药特异性表达，它们与(1)或(2)中序列的差异可能是由于局部结构上的修饰或突变，包括人工突变和非人工突变。
术语“杂交的序列”是指可以在严谨杂交条件下与(1)、(2)、(3)或(4)的序列杂交的核酸序列。“严谨杂交条件”是指本领域技术人员已知的，或者可以在分子生物学或基因工程实验指南，例如《Molecular Cloning》(3rdEd)(Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，2001)(以下简称“《分子克隆》第三版”)中的通用方案中找到，具体为在2×SSPE(或2×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
T0代表示由愈伤组织得到的转基因植株及其无性系，T1表示T0代自交产生的种子及由它所长成的植株和无性系。
实施例1、矮牵牛花药特异启动子PhFD的克隆与分离1、矮牵牛总DNA的提取取温室盆栽的矮牵牛(Petunia x hybrida)品种“Big Bleu”(各花卉公司均有出售)嫩叶片1-2g，用CTAB法(《分子克隆》第三版)提取总DNA。取1-5ul DNA样品，用紫外分光光度计测量其浓度和纯度，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度和完整性。将提取的DNA于-20℃保存。
2、PCR扩增与扩增片段的回收设计并合成如下两条引物(引物1和引物2)扩增矮牵牛花药特异启动子，为了方便以后的克隆和构建，在两条引物的5’端分别加入了限制性内切酶HindIII和Bam HI的识别序列位点(下列引物序列中的下划线序列)引物1：5’-AAGCTTGTCGACTAAATTGAAACAG-3’(Hind III)引物2：5’-GGATCCGAAAACTGGGGGAAGGTAG-3’(Bam HI)以步骤1提取的矮牵牛基因组DNA为模板，进行PCR反应：反应体系为：模板DNA： 800ng；10X Exbuffer： 2ul；dNTP混合物(2.5mM)： 2ul；ExTaq DNA Polymerase(5U/ul)： 0.5ul；引物1(10uM)： 2ul；引物2(10uM)： 2ul；无菌重蒸馏水(sddH20)： 补足至20ul。
PCR反应程序：先预变性94℃5min；然后94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，35个循环。
PCR反应完成后，取15ul扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下快速用一次性刀片小心切下位于350bp左右的特异片段，用DNA片段回收试剂盒回收并纯化(Easy-NA Gel Extraction Kit，德国Omeg-Bio/TEK产品)，溶于50ul ddH2O中，-20℃保存备用。
3、回收片段的亚克隆与测序将步骤2回收的片段插入到载体pUCm-T(上海生工生物工程技术服务有限公司产品)，将经测序表明正确的载体命名为pUFD。将所得到的pUFD通过“冻融法”转化到大肠杆菌菌株DH5α感受态细胞，转化的DH5α。在含氨苄青霉素100mg/L的LB固体培养基上于37℃过夜培养，挑取平板上生长的白色菌落，接入氨苄青霉素100mg/L的LB液体培养基中于37℃过夜培养。当菌液浓度达到OD600为0.6时，离心收集菌体，按小量碱裂解法(《分子克隆》第三版)提取质粒，用限制性酶HindIII和Bam HI双酶切后，用2.0％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下可见分子大小大约分别为2800bp(载体带)和350bp(目标带)两条带(图1)。图1中，泳道1和泳道3为分子量标记：泳道1：100bp DNA marker；泳道3：λDNA/Eco RI+Hind III marker；泳道2为pUFD的酶切结果；箭头所指为分子量标记相应带的大小。
将所需要的克隆和由此提取的质粒(pUFD)送交商业测序公司测序(原上海博雅生物技术服务有限公司，现已并入Introgen公司)，测序表明确证pUFD中含有矮牵牛花药特异启动子，序列如图2所示，矮牵牛花药特异启动子具有序列表中序列1的核苷酸序列，将具有序列表中序列1的核苷酸序列的矮牵牛花药特异启动子命名为PhFD。图2中，下划线者为所用的引物序列(上述引物1和引物2)，斜体为外加的限制性内切酶识别位点(HindIII和BamH I)。
实施例2、花药特异启动子驱动GUS基因(PhFD::GUS)植物表达载体pRDFDG的构建花药特异启动子驱动GUS基因(PhFD::GUS)植物表达载体pRDFDG的构建流程如图3所示，具体方法如下所述：将pUFD经限制性内切酶Hind III和Bam HI双酶切后，得到花药特异启动子PhFD片段，用冻融法(《分子克隆》第三版)或DNA片段回收试剂盒(Easy-NA GelExtraction Kit，德国Omeg-Bio/TEK产品)回收并纯化花药特异启动子PhFD片段，与经过Hind III和Bam HI双酶切的植物表达载体pRD410(加拿大PBI产品)的大片段(大约为13.6kb)相连，得到重组质粒。将所得到重组质粒用“冻融法”(《分子克隆》第三版)转化到大肠杆菌菌株DH5a。转化的DH5α在含氨苄青霉素100mg/L和卡那霉素50mg/L的LB固体培养基上于37℃过夜培养，挑取平板上生长的单菌落，接入含氨苄青霉素100mg/L和卡那霉素50mg/L的LB液体培养基中于37℃振荡过夜培养。当菌液浓度达到OD600值0.5-0.6时，离心收集菌体，按上述小量碱裂解法提取质粒，用限制性内切酶Hindll和BamHI双酶切后，在2.0％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下可见分子大小分别约为13.5kb(pRD410载体带)和350bp(PhFD)两条带，并且进行了测序验证，将酶切和测序表明含有花药特异启动子PhFD片段和pRD410酶切得到的大片段的重组表达载体命名为pRDFDG。pRDFDG中GUS基因需要花药特异启动子驱动表达。
实施例3、转基因(PhFD)烟草的鉴定1、农杆菌的转化与转化子的鉴定用CaCl2法(《分子克隆》第三版)制备根癌农杆菌菌株LBA4404(美国LifeTechnology公司产品)的感受态细胞。利用冻融法(《分子克隆》第三版)将重组的植物表达载体pRDFDG转入制备的LBA4404的感受态细胞。将转化的LBA4404细胞接种到含有链霉素(Str)100mg/L和卡那霉素(Kan)50mg/L的YEB固体培养基，置于28℃在暗处培养48-72h，挑取平板上的单菌落，接入含有链霉素100mg/L和卡那霉素50mg/L的YEB液体培养基，在28℃振荡过夜培养。当培养物的浓度达到OD600值0.4-0.5时，取少量菌液(1.5-2ml)，按上述小量碱裂解法提取质粒，用限制性内切酶Hind III和Bam HI双酶切鉴定，在2.0％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下可见分子大小大约分别为13.5kb(载体带)和350bp(PhFD)两条带，并测序鉴定，将酶切和测序鉴定表明含有PhFD正确的阳性克隆命名为pRDFDG/LBA4404。
2、转PhFD基因烟草(转pRDFDG烟草)的获得1)农杆菌的准备挑取携带植物表达载体pRDFDG的农杆菌LBA4404(pRDFDG/LBA4404)单菌落，接种于5ml含链霉素(Str)100mg/L和卡那霉素(Kan)50mg/L的YEB液体培养基中，28℃振荡培养过夜培养，取活化的农杆菌液，按1∶50的比例加入到含链霉素(Str)100mg/L和卡那霉素(Kan)50mg/L的YEB液体培养基中，继续培养至OD600值为0.4-0.6；4000rpm离心5min，收集菌体；用1/2MSO液体培养基(MS无机盐+B5维生素+肌醇0.1g/L+蔗糖30g/L，pH 5.8)洗涤菌体一次，并将其稀释到离心前菌液5倍体积的1/2MS液体培养基中，准备侵染用。
2)烟草的转化与转化植株的再生烟草的转化根据叶盘法(Horsch RB等，1985，Science，227：1229-1231)进行。选取约30天苗龄的烟草(品种“NC89”，种子购自中国农业科学院)无菌苗，切下鲜嫩浓绿的叶片，用直径9mm的打孔器制取叶盘外植体；将新制备的外植体投入已准备好的农杆菌(pRDFD6/LBA4404)菌液中，侵染15min；取出叶盘，用高压灭菌的吸水纸吸除叶盘表面残余的农杆菌菌液，置于固体再生培养基(MS无机盐+B5维生素+肌醇0.1g/L+BA 2.0mg/L+IAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉0.7％，pH 5.8)上暗处共培养2天；将共培养的叶盘转到含有羧苄青霉素(Carb)500mg/L和Kan 50mg/L的固体再生培养基进行筛选培养，每隔2-3周更换一次培养基，并逐渐降低Carb至200mg/L。待Kan抗性芽长到1-1.5cm时，将其切下换到含有Carb 200mg/L和Kan 50mg/L的固体生根培养基(MS无机盐+B5维生素+肌醇0.1g/L+IAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉0.7％，pH 5.8)上诱导生根，获得50多株完整的卡那霉素抗性的转pRDFDG烟草植株。
3)转基因烟草的分子鉴定首先对步骤2)得到的Kan抗性转pRDFDG烟草植株进行PCR鉴定。根据上述的CTAB法提取转pRDFDG烟草(Kan抗性株)和未转基因NC89烟草(对照)的叶片基因组DNA，用花药特异性启动子PhFD两端特异性引物对(引物1：5’-AAG CTTGTC GAC TAA ATT GAA ACA G-3’；引物2：5’-GGA TCC GAA AAC TGG GGG AAGGTA G-3’)进行PCR扩增，转pRDFDG烟草均扩增得到大小为350bp的目标带，而未转化的对照烟草在相应位置则没有扩增出此目标片段。这一结果初步表明目标基因(PhFD::GUS)已整合到烟草基因组中。
为了进一步确认PhFD基因已经整合到转pRDFDG烟草基因组中，对具有Kan抗性和PCR检测呈阳性的转pRDFDG烟草再进行Southern杂交检测。
根据上述的CTAB法提取具有Kan抗性和PCR检测阳性的转pRDFDG烟草和未转基因NC89烟草(对照)的叶片基因组DNA(10μg)，分别用HindIII和Eco RI于37℃过夜酶切消化，与作为阳性对照未酶切的表达载体质粒pRDFDG一起，通过电泳法(0.7v/cm)在0.8％琼脂糖凝胶上分离酶切后的DNA 16-20h，分离后的DNA用向上毛细管转移法(《分子克隆》第三版)转移到一带正电荷的尼龙膜(德国Boehringer Mannheim公司产品)上。
用内切酶BamHI和Hind III从表达载体质粒pRDFDG上切下约350bp的PhFD片段，以此作为模板，利用地高辛DNA标记试剂盒(瑞士Roche公司产品，Cat.No.1093657)所带的DIG-标记dNTP和酶，对上述模板DNA进行标记，作为探针。以标记好的单链DNA作为探针，按照地高辛DNA标记试剂盒说明书所叙述的方法，将制备好的探针与上述尼龙膜杂交，并用试剂盒碱性磷酸酶标记地高辛抗体(Anti-Digoxigenin-AP，alkaline phosphotase)进行检测。结果显示，阳性对照质粒出现一条很明显的大约13.9kb的杂交带；用Hind III酶切的转pRDFDG烟草植株DNA均呈现阳性，出现1-3条杂交带，而未转基因的对照植株NC89则无杂交带出现；用Eco RI酶切的转pRDFDG植株基因组出现1-4条杂交带，未转基因的对照植株NC89则无杂交带出现。此结果确证，pRDFDG已经整合到转基因烟草的基因组中。
实施例4、转pRDFDG烟草GUS基因表达的组织化学检测将同时具有卡那霉素抗性、PCR和Southern检测呈阳性的转pRDFDG烟草T0代株系和未转基因的烟草NC89对照植株(CK)试管苗在三角瓶中开口炼苗一周，然后移入装有普通花卉营养土的花盆，在温室中培养，第一周套袋保湿，之后去袋并进行常规管理。
转基因烟草GUS基因表达的组织化学检测按照Jefferson RA[1987，Plant MolBiol Rep，5(4)：387-405]的方法进行。将转基因植物及其对照的新鲜的根、茎、叶、花萼、花瓣、花丝、子房、柱头和不同发育时期的花药在X-GLuc溶液中温育24-48h进行染色，然后将染色的植物材料分别用70％和100％的乙醇彻底漂洗脱色和固定，在显微镜下观测样品并拍照。GUS染色的结果见表1。
表1、转pRDFDG烟草T0代的GUS染色
注：表中“+”表示GUS染色阳性；“++”表示染色强度较高“+++”表示染色强度最高；“-”表示GUS染色阴性；花药为发育时期III-IV的花药，花药发育时期的划分见表2。
由表1可见，未转基因的对照植株(CK)的各个器官都不能染色，而在检测的转pRDFDG烟草的15个PCR阳性T0代株系中，除了2个株系(株系6和12)之外，其它13个株系的花药都能不同程度地被染色(图4中A)，而其它器官，如根、茎、叶、花萼、花瓣、花丝、子房和柱头等均未染出蓝色。在株系8中，除了花药能染色外，花粉也被染出很强的蓝色(图4中B)。这些结果显示出GUS染色的花药特异性，即表明启动子PhFD具有花药特异性驱动活性。图4中，图4中A为未转基因对照的花药(左)与转pRDFDG烟草(株系3)的花药(右)的GUS染色；图4中B为未转基因的对照的花粉(左)与转pRDFDG烟草(株系8)的花粉(右)的GUS染色。
为了进一步明确转基因植株花药各个发育时期GUS基因的表达情况，对花药的不同发育时期(Koltunow AM等，1990，Plant Cell，2：1201-1224)进行了GUS染色。依据曹克浩(2003，中国农业大学硕士论文)总结的花药不同发育时期的烟草花蕾大小特征(表2)，以花蕾大小相对应的花药大小和发育阶段，对花药的各个时期进行了染色。结果表明，花药染色阳性时期在发育的II、III、IV期，即从而花药绒毡层和花粉母细胞出现一直到绒毡层降解和开始出现二核花粉粒的阶段；花粉染色阳性时期在IV、V期，即从出现成熟二核花粉粒至花粉成熟期。
表2、烟草花药不同发育时期的花蕾大小特征
实施例5：转pRDFDG烟草花药GUS基因表达的解剖观察为了进一步明确PhFD::GUS嵌合基因在转pRDFDG烟草花药不同组织部位的表达情况，对GUS染色的花药进行石蜡切片解剖观察。石蜡切片按照张丕方和倪德祥(1985，植物制片技术——石蜡切片法。见《植物生理学实验手册》，上海科学技术出版社)的方法制作。石蜡切片的显微观察结果表明，大多数pRDFDG烟草T0代株系的花药GUS染色都发生在花药的表皮细胞和花药壁细胞，而在花药的其它部位如药隔等，都未见GUS染色(图5右)。例外的是转pRDFDG烟草T0代株系8(花药和花粉都有强烈的GUS染色，见表1)，可以明显地看到花药表皮细胞、壁细胞和花粉都被染成强蓝色，但药隔部位仍然未显蓝色。图5为未转基因对照植株花药(左图)和转pRDFDG烟草植株(株系8)花药(右图)经GUS染色后的横切解剖图。
从转pRDFDG烟草植株花药特异性GUS表达的时间及在组织部位来看，GUS的表达主要集中在花药发育的第II、III、IV期，即从花药绒毡层出现到花粉粒成熟。
实施例6：转pRDFDG烟草T1代GUS表达将转pRDFDG烟草T0代株系3、8和10所结的种子(T1代)及其未转基因的对照种子(NC89)表面消毒后接种到含有Kan 100mg/L的种子萌发培养基(1/2MS)，暗培养7天，后置于光下于25±1℃培养30天后统计Kan抗性阳性苗的比例(表3)。
表3、转pRDFDG烟草T1代Kan抗性苗的比例
注：CK1：未转基因植株种子(NC89)在没有选择压的培养基(不含有Kan)上；CK2：未转基因植株种子(NC89)在有选择压的培养基(含有Kan 100mg/L)上。
由表3可以看出，未转基因烟草植株的T1代种子在没有Kan选择压下(CK1)的发芽率为86.7％，而在选择压存在时(CK2)不能产生苗。三个转基因株系的T1代种子在有选择压时，抗性芽的比例在56-62％，按照与无选择压力下可发芽种子的比率计算，抗性芽率为65-72％。
将转基因T0代株系3、8和10的T1代抗性苗各随机选10株进行试管培养，得到旺盛生长的大苗后取其营养器官进行GUS染色。T0代株系29、56和68的T1代种子播种于温室花盆，T1苗长到有2-3片真叶时取叶盘进行体外抗Kan试验，每个株系随机选留3株发育到成熟，发育过程中，取不同的器官和组织按照前文已述的方法进行GUS染色。以确定转pRDFDG烟草中PhFD::GUS在T1代的稳定性和表达特异性。GUS染色结果见表4，试管苗与成熟花粉GUS染色图见图6。表4中FD-3-1表示转pRDFDG烟草株系3的T1代的第一个植株，其他以此类推；CK表示未转基因植株(NC89)。
表4、转pRDFDG烟草T1代Kan抗性苗的GUS染色
注：表中“+”表示GUS染色阳性；“++”表示染色较强“+++”表示染色最强；“-”表示GUS染色阴性，nt表示未检测。
由表4可以看出，由PhFD驱动的GUS基因在转pRDFDG烟草中能够稳定地传递给后代，并且GUS基因在所有检测的后代植株试管苗和温室苗的营养器官都不表达，只特异性地在花药中表达。
在图6中，图6中A为未转基因对照(CK，左)和转pRDFDG烟草(右)T1代试管苗的GUS染色，图6中B为未转基因对照(CK，左)与转pRDFDG烟草(株系29-1)T1代花粉的GUS染色。
上述的实施例结果表明并且确证，本发明所提供的矮牵牛花药特异性启动子PhFD不仅具有良好的花药特异性和花药特异性活性，而且该特异性能够稳定地传递给后代。因此，本发明所提供的分离自矮牵牛的启动子PhFD是一个稳定、驱动力和特异性都很强的花药特异性启动子。
序列表<160>1<210>1<211>354<212>DNA<213>矮牵牛属矮牵牛(Petunia x hybrida)<400>1gtcgactaaa ttgaaacaga acaaggagtt cgaatggacc cctgaatgtc agcaagcact 60taaggatttg aagcggtact tgtcaagccc gcctttactt tcaacgccac aaccaggtga 120acaactattg ctctacctgg ccgtgtctga gtctgcggta agtgcagttt tggttcgaga 180agacaaaggt aagcaactac caatttatta cattagcaaa tccttattag atgctgaaac 240ccgctatcaa cctttggaga aattagcact agcattggta atcgctgccc gtaaattaag 300accttatttt caaagtcact caatagctgt agttactacc ttccccgagt tttc 354<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2aagcttgtcg actaaattga aacag 25<210>3<211>25<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3ggatccgaaa actgggggaa ggtag 25
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