一种诱导副溶血性弧菌产生左氧氟沙星耐药性的方法
专利汇可以提供一种诱导副溶血性弧菌产生左氧氟沙星耐药性的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种诱导副溶血性弧菌产生左 氧 氟沙星耐药性的方法，包括：敏感菌株筛选、亚致死抗生素浓度初步诱导和连续诱导、耐药性菌株保藏步骤，本发明诱导后的副溶血性弧菌经验证获得了左氧氟沙星耐药性，其MIC值均达到了CLSI的耐药标准，即副溶血性弧菌的MIC值≥8mg/L，且这种耐药性能够稳定地遗传；本发明的诱导方法可快速获得具有稳定遗传特性的耐药性菌株，为副溶血性弧菌对左氧氟沙星耐药机制的研究提供了可靠工具，具有良好的参考价值和实际意义。，下面是一种诱导副溶血性弧菌产生左氧氟沙星耐药性的方法专利的具体信息内容。
1.一种诱导副溶血性弧菌产生左氧氟沙星耐药性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、制备种子液：将副溶血性弧菌菌株从保存于-80℃的甘油管中取出，划线接种于TCBS平板上，恒温培养活化；
S2、敏感菌株筛选；
S3、亚致死抗生素浓度下初步诱导；
S4、亚致死抗生素浓度下连续诱导；
S5、保藏耐药性副溶血性弧菌菌株；其中，
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步骤S1中，所述种子液的浓度为1×10～9×10CFU/mL；
步骤S2中，所述筛选的敏感菌株为在1/2的MIC值中可以生长的左氧氟沙星敏感型副溶血性弧菌菌株，其中，所述MIC值为最低抑菌浓度；
步骤S4中，所述亚致死抗生素浓度下连续诱导后的副溶血性弧菌MIC值≥8mg/L；
步骤S5中，所述保藏的耐药性副溶血性弧菌菌株为经步骤S4中亚致死抗生素浓度下连续诱导后培养至9LogCFU/mL的突变菌株。
2.一种如权利要求1所述诱导副溶血性弧菌产生左氧氟沙星耐药性的方法，其特征在于，步骤S2中，所述敏感菌株的筛选方法为：取步骤S1中所述种子液，调节OD600使其接种量为1.5×108CFU/mL，然后利用质量浓度为0.85％的NaCl将其调整为6LogCFU/mL，并接种于含有不同浓度的左氧氟沙星抗生素96孔板中，每孔100ul所述种子液，置于37℃恒温培养箱中培养16h后，用酶标仪测得上述每孔的OD值后确定最低抑菌浓度MIC，筛选1/2所述MIC值中可以生长的左氧氟沙星敏感型副溶血性弧菌菌株。
3.一种如权利要求1所述诱导副溶血性弧菌产生左氧氟沙星耐药性的方法，其特征在于，步骤S3中初步诱导的方法为：吸取步骤S2中筛选的左氧氟沙星敏感型副溶血性弧菌菌液于10mL离心管中，用质量浓度为0.85％的NaCl将所述菌液浓度调至6LogCFU/mL，并接种于含有不同浓度的左氧氟沙星抗生素96孔板中，置于37℃恒温培养箱中培养16h。
4.一种如权利要求1所述诱导副溶血性弧菌产生左氧氟沙星耐药性的方法，其特征在于，步骤S4中连续诱导的方法为：将步骤S3中初步诱导后的左氧氟沙星敏感型副溶血性弧菌菌株持续存在于所述亚致死抗生素浓度条件下继续生长12～30天，直至所述副溶血性弧菌的MIC值≥8mg/L。
5.一种如权利要求2或3所述诱导副溶血性弧菌产生左氧氟沙星耐药性的方法，其特征在于，所述含有不同浓度的左氧氟沙星抗生素96孔板的制备过程如下：
取1mL左氧氟沙星母液于19mlMHB液体培养基中，充分震荡混匀后得浓度为256mg/L的左氧氟沙星抗生素；再取200ul上述左氧氟沙星抗生素于96孔板第1列每孔中，第2列至第11列每孔加100ul的MHB培养基，第12列每孔加200ul的MHB培养基作为空白对照；然后用100ul的排枪由第1列吸取100ul液体至第2列，充分吸打后吸取100ul液体至第3列，如此依次进行梯度稀释至11列，此列充分吹打后吸出100ul液体，即得不同浓度的左氧氟沙星抗生素96孔板，置于-80℃冰箱中冷藏，备用。
6.一种如权利要求5所述诱导副溶血性弧菌产生左氧氟沙星耐药性的方法，其特征在于，所述不同浓度的左氧氟沙星抗生素96孔板由第1列至第11列左氧氟沙星抗生素浓度依次为256mg/L，128mg/L，64mg/L，32mg/L，16mg/L，8mg/L，4mg/L，2mg/L，1mg/L，0.5mg/L，
0.25mg/L，且每孔体积均为100ul。
7.一种如权利要求1所述诱导副溶血性弧菌产生左氧氟沙星耐药性的方法，其特征在于，步骤S5中，所述的保藏方法具体为：
将诱导后获得耐药性的副溶血性弧菌突变株重新划线培养，挑取生长良好的单菌落于
9mL含NaCl且其质量浓度为3％的TSB试管中，培养至9LogCFU/mL，再将菌悬液与甘油按照体积比为1:1混合后置于-80℃中保藏。
8.一种左氧氟沙星耐药性副溶血性弧菌菌株，其特征在于，由权利要求1～7任一项所述诱导副溶血性弧菌产生左氧氟沙星耐药性的方法制得。
9.一种如权利要求8所述左氧氟沙星耐药性副溶血性弧菌菌株的耐药性验证方法，其特征在于，将所述左氧氟沙星耐药性副溶血性弧菌菌株活化，划线于含8mg/L左氧氟沙星的MHA固体培养基上培养16h，挑取生长良好的单菌落于9mL含NaCl质量浓度3％的TSB试管中，在37℃、转速为180r/min的摇床中培养16h；吸取10ul菌悬液于9mL含NaCl质量浓度3％的TSB试管中，在37℃、转速为180r/min的摇床中继续培养16h；重复上述操作至连续传代培养
5天；然后通过K-B纸片法或肉汤倍数稀释法检测所述左氧氟沙星耐药性副溶血性弧菌菌株的耐药性。
10.一种如权利要求9所述左氧氟沙星耐药性副溶血性弧菌菌株的耐药性验证方法，其特征在于，所述耐药性为所述左氧氟沙星耐药性副溶血性弧菌菌株的MIC值≥8mg/L。
一种诱导副溶血性弧菌产生左氧氟沙星耐药性的方法
技术领域
背景技术
发明内容
液调节OD600使得其接种量为1.5×10 CFU/mL，用棉拭子吸取菌液，在Mueller-Hinton agar(MHA)培养基表面进行涂布，待培养基表面菌液完全晾干后贴上抗生素纸片，置于37℃培养箱中过夜培养16h，观察并记录试验结果；根据美国临床实验室标准化协会(CLSI)标准，测量抑菌圈的直径，判断副溶血性弧菌的耐药性为耐药、中介和敏感三类，进一步证实诱导后的副溶血性弧菌最低抑菌浓度均达到CLSI规定的耐药标准(直径≤13mm)，说明通过诱导获得可稳定遗传左氧氟沙星耐药性的副溶血性弧菌。
6LogCFU/mL后，接种于含有不同浓度左氧氟沙星抗生素的96孔板中，每孔100ul菌液，且最后一列设为空白对照，置于37℃培养箱中过夜培养16h，观察并记录试验结果；根据美国临床实验室标准化协会(CLSI)标准，测得最低抑菌浓度(MIC)，判断副溶血性弧菌的耐药性为耐药、中介和敏感三类；进一步证实诱导后的副溶血性弧菌最低抑菌浓度均达到CLSI规定的耐药标准(MIC≥8mg/L)，说明通过诱导获得可稳定遗传左氧氟沙星耐药性的副溶血性弧菌。
具体实施方式
得其接种量为1.5×10CFU/mL，然后利用0.85％NaCl将其调为6LogCFU/mL后，接种于含有不同浓度左氧氟沙星抗生素的96孔板中，每孔100ul菌液，且最后一列设为空白对照，置于
37℃培养箱中过夜培养16h，观察并记录试验结果；根据美国临床实验室标准化协会(CLSI)标准，测得最低抑菌浓度(MIC)，判断副溶血性弧菌的耐药性为耐药、中介和敏感三类；进一步证实诱导后的副溶血性弧菌最低抑菌浓度均达到CLSI规定的耐药标准(MIC≥8mg/L)，说明通过诱导获得可稳定遗传左氧氟沙星耐药性的副溶血性弧菌。
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