一种高产L-色氨酸的重组大肠杆菌及其构建方法
阅读：261发布：2023-12-22
专利汇可以提供一种高产L-色氨酸的重组大肠杆菌及其构建方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种高产L-色 氨 酸的重组大肠杆菌及其构建方法，属于遗传工程技术领域。本发明是以大肠杆菌CICC 10303作为出发菌株，采用CRISPR-Cas9基因编辑技术，替换莽 草酸 激酶编码基因aroK启动子为强启动子T7；替换预苯酸脱氢酶编码基因pheA的启动子为弱启动子tac；敲除 色氨酸 转运体编码基因mtr，阻止 发酵 过程色氨酸转运回胞内。最终得到积累L-色氨酸的大肠杆菌基因工程菌，产量达到36g/L，为进一步代谢工程改造大肠杆菌生产L-色氨酸奠定了 基础 。，下面是一种高产L-色氨酸的重组大肠杆菌及其构建方法专利的具体信息内容。
1.一种产L-色氨酸的重组大肠杆菌，其特征在于，替换了莽草酸激酶基因aroK启动子为T7启动子，敲除了色氨酸转运体编码基因mtr并替换了预苯酸脱氢酶编码基因pheA的启动子为tac启动子。
2.如权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的tac启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.如权利要求1或2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，是对大肠杆菌CICC 10303进行基因组编辑得到的。
4.如权利要求3所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述基因组编辑是利用CRISPR-Cas9技术进行的。
5.权利要求1-4任一所述的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)构建T7启动子替换重组片段、tac启动子替换重组片段以及敲除mtr基因重组片段：
将大肠杆菌莽草酸激酶编码基因aroK基因簇起始密码子上下游同源臂序列融合后，引入T7启动子，得到重组片段T7AROK；将预苯酸脱氢酶编码基因pheA的起始密码子上下游同源臂序列融合后，引入启动子tac，得到片段TACPHE；将色氨酸转运体编码基因mtr上下游同源臂融合，得到片段MTRD。
2)构建重组质粒：将片段T7AROK、TACPHE、MTRD分别与含有sgRNA的线性化载体连接，分别得到重组质粒含T7AROK的重组质粒、含TACPHE的重组质粒、含MTRD的重组质粒；
3)构建重组大肠杆菌：将含有cas9蛋白的质粒转化大肠杆菌CICC 10303，得到大肠杆菌CICC 10303-cas9；随后将含T7AROK的重组质粒转化大肠杆菌CICC 10303-cas9，得到重组大肠杆菌CICC 10303-aroKT；将含TACPHE的重组质粒转化大肠杆菌CICC 10303-aroKT，得到重组大肠杆菌CICC 10303-pheAT；将含MTRD的重组质粒转化大肠杆菌CICC 10303-pheAT，得到重组大肠杆菌CICC 10303-mtrD；去除外源质粒后，得到重组大肠杆菌CICC
10303-TRYP。
6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述含有cas9蛋白的质粒包括pCas9。
7.如权利要求5或6所述的构建方法，其特征在于，含有sgRNA的线性化载体包括pTT7A、pTPH或pTMT。
8.权利要求1-4任一所述的重组大肠杆菌在生产L-色氨酸中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用包括将平板培养基中34-38℃下培养22-26h的单菌落接种至种子培养基，于34-38℃、180-220rpm条件下培养5-8h，再以20％的接种量接种发酵培养基，34-38℃、180-220rpm条件下培养10-14h，0.1mM IPTG诱导45-
50h。
10.权利要求1-4任一所述的重组大肠杆菌在饲料、制药、保健品或食品工业中的应用。
一种高产L-色氨酸的重组大肠杆菌及其构建方法
技术领域
背景技术
[0002] L-色氨酸作为一种非常重要的芳香性氨基酸，是人体必需的八种氨基酸之一。在生物体内，L-色氨酸可以合成5-羟基色胺、烟酸、色素、生物碱、辅酶、吲哚乙酸等重要的生物活性物质，对人和动物的生长发育起重要作用，广泛应用于食品、医药、饲料等方面。L-色氨酸的生产最早主要依靠化学合成法和蛋白质水解法，但是这些方法存在着材料来源有限、周期长、工艺复杂等缺点，因而逐渐被淘汰。由于成本低廉、原料来源广泛、环境污染小等特点，微生物法生产L-色氨酸已经得到了广泛的应用。
[0003] 目前，微生物法生产L-色氨酸存在产量不高、操作复杂等缺点。2001年，王健等用硫酸二乙酯(DES)作为诱变剂，选取了一株酪氨酸、苯丙氨酸双营养缺陷株出发菌株，经过多次诱变处理之后，选育出一株L-色氨酸生产菌株，分批连续发酵64h后，L-色氨酸积累量可以达到7.28g/L。2007年，陈俊峰等利用多次诱变的分离方法，以一株谷氨酸棒状杆菌为出发菌株，得到一株苯丙氨酸和酪氨酸双营养缺陷型的L.色氨酸结构类似物抗性突变株，摇瓶发酵96h后，L-色氨酸积累量达到10.82g/L。
[0004] 大肠杆菌(Escherichia coli)已经被应用于工业发酵生产各类氨基酸。因此，运用代谢工程手段构建重组大肠杆菌是生产L-色氨酸的有效途径。目前，利用表达质粒介导的氨基酸合成途径和竞争途径中关键性酶基因的过表达或弱化是对大肠杆菌进行基因改造的主要手段。然而利用表达质粒介导基因过表达必将在大肠杆菌细胞内引入抗生素抗性基因并在生长过程中添加一定的抗生素，引起人们对抗生素使用的疑虑。因此，提供一种安全高效的对大肠杆菌进行遗传改造的方法，对于氨基酸生产领域有重要的意义。
发明内容
[0005] 本发明的第一个目的是提供一种产L-色氨酸的重组大肠杆菌，替换了莽草酸激酶基因aroK启动子为T7启动子、敲除了色氨酸转运体编码基因mtr和替换了预苯酸脱氢酶编码基因pheA的启动子为tac启动子。
[0006] 在本发明的一种实施方式中，所述的tac启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0007] 在本发明的一种实施方式中，莽草酸激酶aroK基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0008] 在本发明的一种实施方式中，色氨酸转运体编码基因mtr的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0009] 在本发明的一种实施方式中，预苯酸脱氢酶编码基因pheA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0010] 在本发明的一种实施方式中，是对大肠杆菌CICC 10303进行基因组编辑得到的。
[0011] 在本发明的一种实施方式中，所述基因组编辑是利用CRISPR-Cas9技术进行的。
[0012] 本发明的第二个目的是提供上述的重组大肠杆菌的构建方法，所述方法包括以下步骤：
[0013] 1)构建T7启动子替换重组片段、tac启动子替换重组片段以及敲除mtr基因重组片段：将大肠杆菌莽草酸激酶编码基因aroK基因簇起始密码子上下游同源臂序列融合后，引入T7启动子，得到重组片段T7AROK；将预苯酸脱氢酶编码基因pheA的起始密码子上下游同源臂序列融合后，引入启动子tac，得到片段TACPHE；将色氨酸转运体编码基因mtr上下游同源臂融合，得到片段MTRD。
[0014] 2)构建重组质粒：将片段T7AROK、TACPHE、MTRD分别与含有sgRNA的线性化载体PCR连接，分别得到重组质粒含T7AROK的重组质粒、含TACPHE的重组质粒、含MTRD的重组质粒；
[0015] 3)构建重组大肠杆菌：将含有cas9蛋白的质粒转化大肠杆菌CICC 10303，得到大肠杆菌CICC 10303-cas9；随后将含T7AROK的重组质粒转化大肠杆菌CICC 10303-cas9，得到重组大肠杆菌CICC 10303-aroKT；将含TACPHE的重组质粒转化大肠杆菌CICC 10303-aroKT，得到重组大肠杆菌CICC 10303-pheAT；将含MTRD的重组质粒转化大肠杆菌CICC 10303-pheAT，得到重组大肠杆菌CICC 10303-mtrD；去除外源质粒后，得到重组大肠杆菌CICC 10303-TRYP，所述外源质粒包括含T7AROK的重组质粒、含TACPHE的重组质粒和含MTRD的重组质粒。
[0016] 在本发明的一种实施方式中，所述含有cas9蛋白的质粒包括pCas9。
[0017] 在本发明的一种实施方式中，含有sgRNA的线性化载体包括pTT7A、pTPH或pTMT。
[0018] 在本发明的一种实施方式中，pTT7A的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0019] 在本发明的一种实施方式中，pTPH的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0020] 在本发明的一种实施方式中，pTMT的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
[0021] 在本发明的一种实施方式中，pCas9的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0022] 本发明的第三个目的是提供上述的重组大肠杆菌在生产L-色氨酸中的应用。
[0023] 在本发明的一种实施方式中，所述应用包括将平板培养基中34-38℃下培养22-26h的单菌落接种至种子培养基，于34-38℃、180-220rpm条件下培养5-8h，再以20％的接种量接种发酵培养基，34-38℃、180-220rpm条件下培养10-14h，0.1mM IPTG诱导45-50h。
[0024] 本发明的第四个目的是提供上述的重组大肠杆菌在饲料、制药、保健品或食品工业中的应用。
[0025] 本发明是以大肠杆菌CICC 10303作为出发菌株，采用CRISPR-Cas9基因编辑技术，替换莽草酸激酶编码基因aroK启动子为强启动子T7；替换预苯酸脱氢酶编码基因pheA的启动子为弱启动子tac；敲除色氨酸转运体编码基因mtr，阻止发酵过程色氨酸转运回胞内。最终得到积累L-色氨酸的大肠杆菌基因工程菌，产量达到36g/L，为进一步代谢工程改造大肠杆菌生产L-色氨酸奠定了基础。本发明提供的重组大肠杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好的应用前景。附图说明
[0026] 图1：质粒图谱，A：pTT7A；B：pTPH；C：pTMT。
[0027] 图2：重组大肠杆菌CICC 10303-TRYP在不同培养条件下色氨酸的产量。
[0028] 图3：仅替换预苯酸脱氢酶编码基因pheA的启动子为tac启动子，在35℃条件下发酵重组菌生产L-色氨酸。
[0029] 图4：仅替换预苯酸脱氢酶编码基因pheA的启动子为tac启动子，在35℃条件下发酵重组菌生产L-色氨酸。
[0030] 图5：仅敲除色氨酸转运体编码基因mtr，在35℃温度条件下发酵重组菌生产L-色氨酸。
具体实施方式
[0031] 重组大肠杆菌种子培养及发酵培养基：
[0035] 培养条件：将37℃下培养24h的平板挑取单菌落至种子培养基，于37℃、220rpm条件下培养10h，10％的接种量接种发酵培养基，35℃、220rpm条件下培养42h。
[0036] L-色氨酸的测定方法：
[0037] 1.样品处理：
[0038] 取1mL发酵液，离心去除菌体取上清。用5％的三氯乙酸将上清液适当稀释后12000rpm/min离心10min，然后经孔径为0.22μm的滤膜过滤。
[0039] 2.分析方法：OPA硼酸柱前衍生化，13.768min洗脱峰为色氨酸
[0040] 3.色谱条件：
[0041] (1)色谱柱：色谱柱C18(250×4.6)mm
[0042] (2)柱温：40℃
[0043] (3)流动相A：称取3.01g无水乙酸钠于烧杯中，加去离子水溶解并定容至1L，然后加入200μL三乙胺，用5％的醋酸将pH调到7.20±0.05；抽滤后加入5mL四氢呋喃，混合后备用。流动相B：称取3.01g无水乙酸钠于烧杯中；加去离子水溶解并定容至200mL；用5％醋酸将pH调到7.20±0.05；抽滤后，再向此溶液加入400mL乙腈和400mL甲醇，混合后备用。
[0044] (4)流速：1.0ml/min；
[0045] (5)紫外检测器：338nm；
[0046] (6)柱温：40℃；
[0047] 下述实施例中，没有多作说明的都是采用常规的分子生物学实验方法。
[0048] 实施例1重组片段的构建
[0049] 根据大肠杆菌基因组序列信息，设计引物pT-aroK-1R和pT-aroK-2F、pT-aroK-1F、pT-aroK-2R(见表1)，使用上述四种引物从大肠杆菌CICC 10303基因组中扩增带有T7启动子的aroK基因同源臂基因序列各600bp，将所得2段扩增片段通过融合PCR技术融合，得到重组片段T7AROK；
[0050] 根据大肠杆菌基因组序列信息，设计引物pT-pheA-1F、pT-pheA-1R、pT-pheA-2F和pT-pheA-2R，使用上述引物从大肠杆菌CICC 10303基因组中扩增pheA基因起始密码子两侧同源臂基因序列各600bp，将所得2段扩增片段通过融合PCR技术融合，得到重组片段TACPHE。
[0051] 根据大肠杆菌基因组序列信息，设计引物pT-mtr-1F、pT-mtr-1R、pT-mtr-2F和pT-mtr-2R，使用上述引物从大肠杆菌CICC 10303基因组中扩增mtr基因两侧同源臂基因序列各600bp，将所得2段扩增片段通过融合PCR技术融合，得到重组片段MTRD。
[0052] 表1引物表
[0053]
[0054] 实施例2重组质粒的构建
[0055] 根据载体pTarget序列信息，设计引物pT-aroK-F、pT-aroK-R，进行PCR得到含有sgRNA的线性化载体pTT7A(序列信息如SEQ ID NO.5所示)；设计引物pT-pheA-F、pT-pheA-R，进行PCR得到含有sgRNA的线性化载体pTPH(序列信息如SEQ ID NO.6所示)；设计引物pT-mtr-F、pT-mtr-R，进行PCR得到线性化含有sgRNA的pTMT(序列信息如SEQ ID NO.7所示)，pTT7A、pTPH、pTMT分别与重组片段T7AROK、TACPHE、MTRD连接构建重组质粒，BamHI、BsgI双酶切验证及测序，确认重组质粒构建成功。pTT7A、pTPH、pTMT质粒图谱如图1所示。
[0056] 实施例3重组T7AROK片段大肠杆菌的构建
[0057] 将含有cas9蛋白的pCas9质粒转化大肠杆菌CICC 10303。采用Kana抗性板筛选转化成功的重组大肠杆菌CICC 10303-cas9，随后将重组质粒pTargetT7AROK转化大肠杆菌CICC 10303-cas9，筛选确认T7启动子整合成功，加0.05mM IPTG在30℃下诱导12h，去除重组质粒pTargetT7AROK，选用引物pT-aroK-2F与pT-aroK-2R挑选转化子进行菌落PCR，出现600bp左右条带，测序正确后，得到aroK基因启动子为T7的重组大肠杆菌CICC 10303-aroKT。
[0058] 实施例4重组TACPHE片段大肠杆菌的构建
[0059] 将重组质粒pTargetTACPHE转化大肠杆菌CICC 10303-aroKT，选用引物pT-pheA-2F和pT-pheA-2R挑选转化子进行菌落PCR，出现600bp左右条带，测序正确后得到aroK基因启动子为T7、pheA基因启动子为tac的重组大肠杆菌CICC 10303-pheAT。
[0060] 实施例5重组MTRD片段大肠杆菌的构建
[0061] 将重组质粒pTargetMTRD转化大肠杆菌CICC 10303-pheAT，选用引物pT-mtr-1F和pT-mtr-2R挑选转化子进行菌落PCR，出现1200bp左右条带，测序确认mtr基因被成功敲除，加0.05mM IPTG在30℃下诱导12h，去除重组质粒pTargetMTRD后得到aroK基因启动子为T7、pheA基因启动子为tac且mtr基因缺失的重组大肠杆菌CICC 10303-mtrD；在37℃下培养12h，去除质粒pCas9后，得到高产L-色氨酸的重组大肠杆菌CICC 10303-TRYP。
[0062] 实施例6硫酸铵与大豆蛋白胨作氮源发酵生产L-色氨酸
[0063] 将重组大肠杆菌CICC 10303-TRYP在平板培养基中37℃下培养24h，挑取单菌落至种子培养基，于37℃、220rpm条件下培养10h，以10％的接种量接种发酵培养基，在发酵培养基中添加硫酸铵18g/L，添加大豆蛋白胨6g/L。35℃、220rpm条件下培养12h，0.1mM IPTG诱导36h至菌体不再耗糖。利用HPLC高效液相色谱测定发酵液上清中含有L-色氨酸22g/L。
[0064] 实施例7添加柠檬酸发酵生产L-色氨酸
[0065] 将重组大肠杆菌CICC 10303-TRYP在平板培养基中37℃下培养24h，挑取单菌落至种子培养基，于37℃、220rpm条件下培养10h，以10％的接种量接种至发酵培养基，在发酵培养基中去除柠檬酸三钠，添加柠檬酸3g/L。35℃、220rpm条件下培养12h，0.1mM IPTG诱导40h至菌体不再耗糖。利用HPLC高效液相色谱测定发酵液上清中含有L-色氨酸26g/L。
[0066] 实施例8 37℃温度条件下发酵生产L-色氨酸
[0067] 将重组大肠杆菌CICC 10303-TRYP在平板培养基中37℃下培养24h，挑取单菌落至种子培养基，于37℃、220rpm条件下培养10h，以10％的接种量接种发酵培养基，37℃、220rpm条件下培养12h，0.1mM IPTG诱导48h至糖耗尽。利用HPLC高效液相色谱测定发酵液上清中含有L-色氨酸32g/L。
[0068] 实施例9 35℃温度条件下发酵生产L-色氨酸
[0069] 将重组大肠杆菌CICC 10303-TRYP在平板培养基中37℃下培养24h，挑取单菌落至种子培养基，于37℃、220rpm条件下培养10h，10％的接种量接种发酵培养基，35℃、220rpm条件下培养12h，0.1mM IPTG诱导42h。利用HPLC高效液相色谱测定发酵液上清中含有L-色氨酸36g/L，如图2所示。
[0070] 对比例1仅替换莽草酸激酶aroK启动子为T7启动子，在35℃温度条件下发酵重组菌生产L-色氨酸
[0071] 根据大肠杆菌基因组序列信息，设计引物pT-aroK-1R和pT-aroK-2F、pT-aroK-1F、pT-aroK-2R，使用上述四种引物从大肠杆菌CICC 10303基因组中扩增带有T7启动子的aroK基因同源臂基因序列各600bp，将所得2段扩增片段通过融合PCR技术融合得到重组片段T7AROK；
[0072] 根据载体pTarget序列信息，设计引物pT-aroK-F、pT-aroK-R，PCR得到含有sgRNA的线性化载体pTT7A；与重组片段T7AROK连接构建重组质粒，BamHI、BsgI双酶切验证及测序，确认重组质粒构建成功。
[0073] 将含有cas9蛋白的pCas9质粒转化大肠杆菌CICC 10303。采用Kana抗性板筛选转化成功的重组大肠杆菌CICC 10303-cas9，随后将重组质粒pTargetT7AROK转化大肠杆菌CICC 10303-cas9，筛选确认T7启动子整合成功并去除重组质粒pTargetT7AROK，选用引物pT-aroK-2F与pT-aroK-2R挑选转化子进行菌落PCR，出现600bp左右条带，测序正确后，得到aroK基因启动子为T7的重组大肠杆菌CICC 10303-aroKT；去除质粒pCas9后，得到高产L-色氨酸的重组大肠杆菌CICC 10303-TRYP1。
[0074] 将重组大肠杆菌CICC 10303-TRYP1在平板培养基中37℃下培养24h，挑取单菌落至种子培养基，于37℃、220rpm条件下培养10h，10％的接种量接种发酵培养基，；35℃、220rpm条件下培养12h，0.1mM IPTG诱导42h。利用HPLC高效液相色谱测定发酵液上清中L-色氨酸的含量12g/L，如图3所示。
[0075] 对比例2仅替换预苯酸脱氢酶编码基因pheA的启动子为tac启动子，在35℃温度条件下发酵重组菌生产L-色氨酸
[0076] 根据大肠杆菌基因组序列信息，设计引物pT-pheA-1F、pT-pheA-1R、pT-pheA-2F和pT-pheA-2R，使用上述引物从大肠杆菌CICC 10303基因组中扩增pheA基因起始密码子两侧同源臂基因序列各600bp，将所得2段扩增片段通过融合PCR技术融合得到重组片段TACPHE。
[0077] 根据载体pTarget序列信息，设计引物pT-pheA-F和pT-pheA-R，PCR得到含有sgRNA的线性化载体pTPH；与重组片段TACPHE连接构建重组质粒，BamHI、BsgI双酶切验证及测序，确认重组质粒构建成功。
[0078] 将含有cas9蛋白的pCas9质粒转化大肠杆菌CICC 10303。采用Kana抗性板筛选转化成功的重组大肠杆菌CICC 10303-cas9，随后将重组质粒pTargetTACPHE转化大肠杆菌CICC 10303-cas9，筛选确认tac启动子整合成功并去除重组质粒pTargetTACPHE，设计引物进行菌落PCR验证，测序结果正确后，得到pheA基因启动子为tac的重组大肠杆菌CICC 10303-pheAT2；去除质粒pCas9后，得到重组大肠杆菌CICC 10303-TRYP2。
[0079] 将重组大肠杆菌CICC 10303-TRYP2在平板培养基中37℃下培养24h，挑取单菌落，于37℃、220rpm条件下培养10h，10％的接种量接种发酵培养基，35℃、220rpm条件下培养12h，0.1mM IPTG诱导42h。利用HPLC高效液相色谱测定发酵液上清中L-色氨酸的含量20g/L，如图4所示。
[0080] 对比例3仅敲除色氨酸转运体编码基因mtr，在35℃温度条件下发酵重组菌生产L-色氨酸
[0081] 根据大肠杆菌基因组序列信息，设计引物pT-mtr-1F、pT-mtr-1R、pT-mtr-2F和pT-mtr-2R，使用上述引物从大肠杆菌CICC 10303基因组中扩增mtr基因两侧同源臂基因序列各600bp，将所得2段扩增片段通过融合PCR技术融合得到重组片段MTRD。
[0082] 根据载体pTarget序列信息，设计引物pT-mtr-F和pT-mtr-R，PCR得到含有sgRNA的线性化载体pTMT，与重组片段MTRD连接构建重组质粒，BamHI、BsgI双酶切验证及测序，确认重组质粒构建成功。
[0083] 将含有cas9蛋白的pCas9质粒转化大肠杆菌CICC 10303。采用Kana抗性板筛选转化成功的重组大肠杆菌CICC 10303-cas9，随后将重组质粒pTargetMTRD转化大肠杆菌CICC 10303-cas9，筛选确认mtr基因被成功敲除整合成功并去除重组质粒pTargetMTRD，设计引物，挑选转化子进行菌落PCR验证，测序结果正确后，得到mtr基因被成功敲除的重组大肠杆菌CICC 10303-mtrD去除质粒pCas9后，得到高产L-色氨酸的重组大肠杆菌CICC 10303-TRYP3。
[0084] 将重组大肠杆菌CICC 10303-TRYP3在平板培养基中37℃下培养24h，挑取单菌落至种子培养基，于37℃、220rpm条件下培养10h，10％的接种量接种发酵培养基，35℃、220rpm条件下培养12h，0.1mM IPTG诱导42h。利用HPLC高效液相色谱测定发酵液上清中L-色氨酸的含量20g/L，如图5所示。
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