一种脑膜炎球菌fHbp蛋白的表达系统
阅读：334发布：2023-12-27
专利汇可以提供一种脑膜炎球菌fHbp蛋白的表达系统专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种脑膜炎球菌fHbp蛋白的表达系统，所述的表达系统包含fHbp 抗原 基因和载体pCAMBIA1301，所述的表达系统为pCAMBIA-fHbp，所述的启动子为β-phaseolin启动子。通过设计合成了fHbp拟南芥密码子偏好的核苷酸序列全长，将其亚克隆入带有菜豆 种子 特异启动子的 植物 表达载体中，利用农杆菌介导将fHbp基因整合到拟南芥基因组中。使fHbp在种子中表达，简化了生产工序，降低了生产成本，使植物大量生产口服 疫苗 fHbp成为可能。，下面是一种脑膜炎球菌fHbp蛋白的表达系统专利的具体信息内容。
1.一种脑膜炎球菌fHbp蛋白的表达系统，其特征在于，所述的表达系统包含fHbp抗原基因和载体pCAMBIA1301，所述的表达系统为pCAMBIA-fHbp。
2.根据权利要求1所述的一种脑膜炎球菌fHbp蛋白的表达系统，其特征在于，所述的表达系统中包含能使Hbp抗原基因在植物中高效表达的启动子，所述的启动子为β-phaseolin启动子。
3.根据权利要求2所述的一种脑膜炎球菌fHbp蛋白的表达系统，其特征在于，所述的β-phaseolin启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.根据权利要求1所述的一种脑膜炎球菌fHbp蛋白的表达系统，其特征在于，所述的表达系统中包括筛选标记，所述的筛选标记为Bar基因。
5.权利要求2中所述的启动子在提高fHbp抗原基因在植物中高效表达中的应用。
6.权利要求4中所述的Bar基因在筛选表达系统pCAMBIA-fHbp中的应用。
一种脑膜炎球菌fHbp蛋白的表达系统
技术领域
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种脑膜炎球菌fHbp蛋白的表达系统。
背景技术
[0002] 脑膜炎球菌疾病因高发病率和高死亡率使其成为一个严峻的全球公共卫生问题。全世界几乎每年有50多万侵扰性脑膜炎疾病的病例，其中有6万的病人留下了严重的后遗症。在发展中国家2％的出生儿童5岁前死于脑膜炎。人类几乎所有的脑膜炎球菌病例是由A、B、C、W135和Y血清型引起的。Sanofi-Pasteur研制的A、C、W135和Y的四价荚膜多糖疫苗证明能有效预防这四种血清型。B群的荚膜多糖与人少数成熟组织神经细胞黏附分子同源。因此不能引起免疫。但是，Novartis利用“反向疫苗学”研制的含有4种外膜蛋白抗原的能预防脑膜炎球菌B群的疫苗已经进入III期临床，并且其中证明fHbp的免疫原性优于其他外膜蛋白。目前fHbp的基因工程化疫苗仍由原核表达系统表达。但其中高昂成本和产品中易含有热源的问题无法满足社会的需要，亟需一种全新的表达系统。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供一种脑膜炎球菌fHbp蛋白的表达系统。
[0005] 本发明具体通过以下技术方案实现：
[0006] 一种脑膜炎球菌fHbp蛋白的表达系统，所述的表达系统包含fHbp抗原基因和载体pCAMBIA1301，所述的表达系统为pCAMBIA-fHbp。
[0007] 所述的表达系统中包含能使fHbp抗原基因在植物中高效表达的启动子，所述的启动子为β-phaseolin启动子。
[0008] 所述的β-phaseolin启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009] 所述的表达系统中包括筛选标记，所述的筛选标记为Bar基因。
[0010] 本发明上述β-phaseolin启动子在提高fHbp抗原基因在植物中高效表达中的应用也在本发明的保护范围之内。
[0011] 所述的Bar基因在筛选表达系统pCAMBIA-fHbp中的应用也在本发明的保护范围之内。
[0012] 另一方法，本发明还提供了制备上述表达系统的方法，具体包括以下内容：将本发明的包含fHbp的抗原蛋白基因，亚克隆入能使该基因高效表达的载体中，将能提高表达量的种子特异启动子，以及能筛选出转化植株的筛选标记的基因引入该表达系统中。
[0013] 所述的表达系统引入的启动子为β-phaseolin启动子，所述的筛选标记为Bar基因，所述的载体为pCAMBIA1301。
[0014] 在本发明的一个具体实施例中，可通过农杆菌感染法将上述构建体的fHbp基因的表达框和Bar基因表达框随机整合入植物基因组中，使植物能生产fHbp抗原蛋白。
[0016] 优选的，对Bar基因PCR检测筛选出的“Bar基因阳性植株”进行fHbp目的基因的PCR检测。去除转化过程中只有Bar基因整合入植物基因组而fHbp未整合入植物基因组的植物。通过两轮的PCR检测，确定了所有筛选出的拟南芥均含有fHbp目的基因和Bar筛选标记基因。
[0017] 由于目前没有市售的fHbp抗体用于检测fHbp蛋白的表达量，但是，农杆菌的整合机制是把含有目的基因和筛选标记表达框的T-DNA区整合到植物基因组中。因此，在本发明中，通过检测筛选标记Bar基因表达量来间接确定目的基因fHbp基因的表达量。本发明中通过PCR筛选出的植物通过Bar基因胶体金试纸条检测Bar基因的表达量。将样品的浓度稀释10倍，进行试纸条检测，结果仍为阳性的，确定为Bar基因高表达的拟南芥，间接证明目的基因fHbp的高表达。
[0018] 农杆菌介导的外源基因整合是多位点和随机整合，植物在遗传时遗传因子会发生分离，由于外源基因在植物中不是单拷贝，这样外源基因不会随基因组稳定的遗传。本发明通过Southern-Blot检测外源基因的拷贝，来筛选出能稳定遗传的高表达植株。
[0019] 本发明的有益效果为：
[0020] 本发明首先在表达载体上有了突破，以种子特异启动子替换掉组成型启动子，使蛋白特异的在种子中表达提高了蛋白的表达量。农杆菌介导的拟南芥侵染方法是独有的技术平台。这在降低生产成本、简化生产工艺和提高产品的安全性等诸多方面体现出极大的优势。附图说明
[0021] 图1是表达载体p1301-phas-fHbp酶切鉴定；
[0022] 图2是转化拟南芥Bar基因PCR检测结果：M:DL100DNAmarker(Trans Gen)；阳：p1301-phas-fHbp；WT：未转化的拟南芥基因组DNA；1-21：转化的拟南芥；
[0023] 图3是转化拟南芥fHbp的PCR检测结果；M：DL2000DNAmarker(TAKARA)；阳：p1301-phas-fHbp；WT：未转化的拟南芥基因组DNA；1-23：转化的拟南芥；
[0024] 图4是试纸条检测Bar基因表达量的结果；左：Bar试纸条检测结果；右：稀释10倍后Bar试纸条检测结果；
[0025] 图5是目的蛋白fHbp的SDS-PAGE电泳结果；M：protein low marker(TAKARA)；WT：未转化的拟南芥；1-8：转化的拟南芥；
[0026] 图6是目的蛋白fHbp高表达植株的Southern-Blot检测结果；M：Trans 15K DNAmarker；+：p1301-phas-fHbp；-：未转化的拟南芥；01-06：fHbp高表达植株；
[0027] 图7是fHbp高表达植株纯化后SDS-PAGE检测结果；M:Protein Molecular Weight Marker(Low)；1：未转化的拟南芥总蛋白；2：转化的拟南芥总蛋白；3：纯化后的fHbp蛋白；
[0028] 图8是ELISA检测血清IgG的滴度：对照组为PBS缓冲溶液；实验组为fHbp/弗氏佐剂制备物。
具体实施方式
[0029] 下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0030] 实施例1 fHbp抗原基因的克隆与植物表达载体的构建
[0031] 将MenB标准株MC58划于巧克力固体培养基上。37℃，5％CO2培养36-48hr。挑取直径1.0-1.5mm的单菌落用PBS重悬，利用Universal Genomic DNA Extraction Kit提取MC58全基因组。根据已知的fHbp序列利用Primer Premier5.0设计fHbp上游和下游两条特异性引物并在5'和3'引入了NcoI和HindIII酶切位点，引物序列分别为：
[0032] 上游引物：5'ATCGTCCATGGGACATCATCATCATCATC 3'；
[0033] 下游引物：5'AAGCTTAATTAGCCATAGAAATAGCAGC 3'。
[0034] 扩增出fHbp片段并连入pEASY-T1中。载体命名为pEASY-T1-fHbp。
[0035] 通过Nco I和Hind III酶分别消化pEASY-T1-fHbp和p1301-phas，1％的琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，并分别回收pUC57-fHbp的小片段和p1301-phas的大片段。回收的产物用T4 DNA ligase 16℃过夜连接。连接产物转化大肠杆菌，接种在含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB固体培养基上。在固体培养基上挑取抗性单克隆菌落进行菌液PCR和Nco I和Hind III酶切鉴定。酶切结果如图1所示。
[0036] PCR反应体系：
[0037]
[0038] 酶切反应体系：
[0039]
[0040]
[0041] 连接反应体系：
[0042]
[0043] 实施例2植物表达载体转化农杆菌
[0044] 1)农杆菌EHA105感受态细胞的制备
[0045] 接种农杆菌EHA105单菌落于5mLYEP液体培养基中，28℃220rpm培养过夜。取2mL过夜培养菌液转入50mLYEP液体培养基中，28℃220rpm培养至OD600为0.5左右，冰浴30min，4℃5000rpm离心5min，弃上清，加入700μL 50mmol/L的CaCl2和300μL 80％甘油重悬菌体，每管
100μL分装，-80℃保存。
100μL分装，-80℃保存。
[0046] 2)转化农杆菌
[0047] 取20ng纯化的质粒pCAMBIA-fHbp，加入到100μL农杆菌感受态中，混匀，冰浴30min，转入液氮5min，迅速置于37℃温育5min，加入800μL YEP液体培养基，28℃220rpm培养4-5h。将菌液转移至含有50mg/L的卡那霉素固体YEP培养基中，涂布于整个平板，28℃培养1-2天。
[0048] 3)转化农杆菌的筛选鉴定
[0049] 筛选抗性菌落于5mL含有50mg/L卡那霉素的YEP液体培养基中，28℃220rpm培养1天，离心，提取质粒，酶切电泳检测片段大小。
[0050] 实施例3农杆菌介导的转化及转化植株除草剂抗性的筛选
[0051] 1)农杆菌工程菌的制备
[0052] 取带有表达载体的农杆菌菌种，菌种与培养基1:200的比例加入到含有50mg/L卡那霉素和含有25mg/L利福平霉素的YEP液体培养基中，28℃220rpm培养至OD600为0.5-0.6，5000rpm离心5min收集菌体。将收集的菌体重悬于侵染液中，调至OD600为1.0-1.2，备用。
[0053] 2)拟南芥的转化
[0054] A.将已抽薹含有花蕾的拟南芥整株浸泡在农杆菌菌液中，浸染5min，取出拟南芥，放置于暗处24h；
[0055] B.侵染后的植株待2-3周后，采集黄色的种荚；
[0056] C.将采集的种子均匀播种到花盆中，待长出两片真叶时，喷洒1％的草铵磷筛选，共喷洒3次，每次间隔5天。
[0057] 实施例4转化植株的分子生物学检测
[0058] 1)转化植株的fHbp基因和Bar基因的PCR检测
[0059] 取0.05g拟南芥叶片在液氮中研碎，加入1mL CTAB提取缓冲液(75mM 1M Tris-HCl(pH8.0)，100mM 0.5M EDTA(pH8.0)，1.05M NaCl，0.75％40K PVP，加水定容至1L)，65℃孵育30min，12000rpm离心10min，将上清液转入新离心管中，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(体积比25:24:1)充分混匀，12000rpm离心10min。将上清转入新离心管中，加入等体积的氯仿充分混匀，12000rpm离心10min。将上清转入新离心管中，加入二倍体积无水乙醇，-20℃沉淀DNA。30min后12000rpm离心10min，弃去上清，干燥沉淀，加入ddH2O回溶备用。以抗性植株总DNA为模板，为转化的拟南芥总DNA做阴性对照，以pUC57-fHbp质粒做阳性对照，根据fHbp设计特异性引物，两条引物分别为：
[0060] 上游引物：5'ATCGTCCATGGGACATCATCATCATCAT 3'；
[0061] 下游引物：5'AAGCTTAATTAGCCATAGAAATAGCAG 3'。
[0062] 根据Bar基因设计特异性引物，两条引物分别为：
[0063] 上游引物：5'TCAAATCTCGGTGACGGGCAGGA 3'；
[0064] 下游引物：5'ATGAGCCCAGAACGACGCCCGGC 3'。
[0065] 扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测。扩增fHbp基因反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸1min20s；30个循环；72℃后延伸7min；4℃终止反应。检测结果如图2。
[0066] PCR反应体系：
[0067]
[0068] Bar基因PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸50s；30个循环；72℃后延伸7min；4℃终止反应。检测结果如图3。
[0069] PCR反应体系：
[0070]
[0071]
[0072] 2)Bar基因高表达植株的检测
[0073] 利用Bar试纸条对PCR检测目的基因呈阳性的植株，按照Bar基因检测试剂盒说明检测Bar基因的表达量。将Bar基因试纸条呈阳性的结果稀释10倍后，再用Bar试纸条复检。保留结果仍为阳性的植株。检测结果见图4。
[0074] 3)抗原fHbp蛋白的表达
[0075] 称取0.1g种荚用PBS缓冲液(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4(pH7.4)，加水定容至1L)提取总蛋白，料液比为1:3.提取温度4℃，10000rpm，离心20min。上清即为电泳总蛋白样品。
[0076] 12％分离胶的配方(5mL)：
[0077]
[0078] 5％浓缩胶的配方(2mL)：
[0079]
[0080]
[0081] 按照上述配方制备分离胶和浓缩胶，蛋白与loading buffer5:1混合，沸水浴10min，取10μL进行蛋白fHbp的SDS-PAGE检测。结果见图5。
[0082] 4)转化植株Southern-Blot的检测
[0083] 取1g样品放入合适的离心管中，在液氮中研碎。加入5mL的CTAB提取缓冲液(75mM 1M Tris-HCl(pH8.0)，100mM 0.5M EDTA(pH8.0)，1.05M NaCl，0.75％40K PVP，加水定容至
1L)，65℃孵育45min，期间混匀2-3次。从水浴中取出放置室温，13000rpm离心10min，转移上清至一新离心管中。加入等体积氯仿，颠倒混匀2-3min。13000rpm离心10min。重复上述操作至上清无色。加入2倍体积无水乙醇沉淀DNA。13000rpm离心5-7min。弃去上清，干燥沉淀。加入100μL ddH2O回溶沉淀。选择合适的限制性内切酶消化提取的植物DNA。酶切体系：
1L)，65℃孵育45min，期间混匀2-3次。从水浴中取出放置室温，13000rpm离心10min，转移上清至一新离心管中。加入等体积氯仿，颠倒混匀2-3min。13000rpm离心10min。重复上述操作至上清无色。加入2倍体积无水乙醇沉淀DNA。13000rpm离心5-7min。弃去上清，干燥沉淀。加入100μL ddH2O回溶沉淀。选择合适的限制性内切酶消化提取的植物DNA。酶切体系：
[0084]
[0085] 酶切结束后，颠倒混匀，加入1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积无水乙醇，颠倒混匀。13000rpm离心2min，弃去上清，干燥沉淀DNA。加入40μL ddH2O回溶沉淀。阳性对照为pCAMBIA1301-fHbp，阴性对照为非转化的拟南芥DNA。50V电压，在0.8％琼脂糖凝胶中分离DNA。按照Southern-Blot试剂盒检测。结果见图6。
[0086] 实施例5 fHbp的分离纯化及含量测定
[0087] 1)拟南芥种荚总蛋白的提取
[0088] 将种子置于研钵中，加液氮研磨成粉末，加入1倍体积的PBS提取液，震荡匀浆，置于冰上静置30min，每隔5min颠倒混匀。将混合物置于离心机中10000g4℃离心40min。抽出上清液，重复离心一次。吸取上清。依照上面的方法检测OD595值，计算总蛋白的浓度。
[0089] 2)fHbp的Ni-NTA纯化
[0090] 将提取的植物总蛋白通过0.22μm滤膜过滤。每次取10mL植物总蛋白灌于用Binding Buffer(300mM NaCl，50mMNaH2PO4,10mM咪唑，10mM Tris base，pH8.0)平衡好的-1Ni-NTA亲和层析柱上。利用蠕动泵使流出液的流速控制在1mL·min ，收集流出液。用Wash Buffer(20mmol·L-1NaH2P04，500mmol·L-1NaCl，pH7.4，20mmol·L咪唑)冲洗大约5个柱体积后，再用Elution Buffer(20mmol·L-1NaH2P04，500mmol·L-1NaCl，pH 7.4，100mmol·L(咪唑)将fHbp从柱子上洗脱下来。结果见图7。
[0091] 3)纯化的fHbp浓度的测定
[0092] 取蛋白标准品(BSA 5mg·mL-1)10μL加PBS稀释至100μL，即浓度为0.5mg·mL-1。将稀释的标准品按0，2，4，6，8，12，16，20μL分别加到96孔板中，加PBS将所有标准品补至20μL。加纯化后的蛋白到96孔板中。各孔加入200μL Bradford染色液，用移液器轻轻吸打混匀，室温放置3-5min，用酶标仪测定A595处的吸光值。根据标准曲线算出蛋白浓度，蛋白浓度约为
3.437mg·mL-1。
3.437mg·mL-1。
[0093] 实施例6 fHbp亚基疫苗的免疫活性的鉴定
[0094] 1)免疫制剂的制备
[0095] 取纯化后fHbp蛋白，加PBS调整其浓度为1.000μg·μL-1，1:1弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂制成乳化剂，备用。
[0096] 2)动物免疫试验
[0097] 将20只6周龄的雌性BALB/C小鼠随机分为2组，即实验组和对照组(每组10只)，分别通过腹腔在0，15，30天注射制备好的免疫制剂，初次免疫注射为fHbp/弗氏完全佐剂，加强免疫注射为fHbp/弗氏不完全佐剂，实验组每只注射0.3mL(含fHbp蛋白为20μg)，对照组每只注射等量的PBS溶液。
[0098] 3)动物血清的取得
[0099] 在免疫前，和在初次免疫后10天，加强免疫后25天和40天对小鼠进行断尾取血，并分离血清，-80℃冷冻保存。
[0100] 4)fHbp抗血清的ELISA检测
[0101] 用纯化的fHbp，调整浓度使其为20μg·mL-1包被96孔酶标板。洗板3次。用含3％BSA的PBST封闭2hr，除净封闭液。加入在10,25,40天取得的血清，设置阴性对照，即非转化的拟南芥种子总蛋白，37℃反应2hr，洗板3次。加入封闭液5000倍稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG，除净抗体溶液。加入100μL底物邻苯二胺(OPD)在暗处显色。每孔加入50μL 2M硫酸终止反应。用酶标仪在492nm处样品的吸光值。血清样品的吸光值是阴性对照的2倍以上判定为阳性结果。抗体滴度以获得阳性结果最高稀释倍数的倒数表示，10只小鼠血清样本A492吸光值的平均数表示该时间抗体的滴度，结果如图8所示。
[0102] 5)MenB(菌号29315)毒株悬液的制备
[0103] 在巧克力固体培养基上接种MenB，37℃，5％CO2，培养36-48hr。挑取单菌落。在巧克力液体培养基上培养至OD600为0.5，收集菌体，用PBS缓冲液重悬菌体至终浓度为5x103cfu·mL-1。
[0104] 6)fHbp对MenB(菌号29315)毒株的免疫效应保护
[0105] 另取腹腔免疫fHbp和PBS 40天后的小鼠共20只(10只实验组，10只对照组)，注射100μL的菌液，72hr后观察小鼠的病死情况。并利用下式来计算免疫保护率(RPS)：RPS＝
100x(1-免疫组小鼠死亡百分比)/(对照组小鼠死亡百分比)。由此得出重组fHbp亚基疫苗对MenB免疫保护率为80％，故fHbp能保护小鼠抵御MenB的侵染。
100x(1-免疫组小鼠死亡百分比)/(对照组小鼠死亡百分比)。由此得出重组fHbp亚基疫苗对MenB免疫保护率为80％，故fHbp能保护小鼠抵御MenB的侵染。
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