技术领域
[0001] 本
发明属于微
生物工程和除草技术领域，尤其涉及一种间型弯孢菌菌株及其应用和除草剂。
背景技术
[0002]
马唐(Digitaria sanguinalis)是世界公认的18种恶性
杂草之一，主要危害
棉花、玉米、
高粱、大豆、
烟草、花生等作物，在果园、蔬菜、草坪和
园艺作物田中也常有发生。马唐广泛分布于世界热带和温带地区，具有很强的繁殖能
力和抗逆性，生长速度快且生长周期长。对马唐的防除主要依赖化学方法，但化学除草剂的长期大量使用将造成环境污染和残毒
药害，还会导致杂草抗药性的产生。因此，亟需探寻针对马唐以及抗药性马唐的非化学防除方法。
[0003] 生物除草剂具备对目标杂草致病性强的特点，同时对环境安全，其研究与开发愈来愈受到重视。目前，全球已经成功商业化或正式获得登记的生物除草剂产品有Biochon、StumpOut、Camperico、双丙
氨膦钠和Myco-Tech Paste等20余个品种。其中在马唐研究方面，中隔弯孢霉(Curvularia intermedia)菌株被筛选出具有较强的致病力，已
申请了
专利；黑粉菌(Ustilago syntherismae)也被报道防除效果良好；另外我国有报道分离到画眉草弯孢霉(Curvularia eragrostidis)具有发展成为防除马唐的
真菌除草剂的潜力。然而这些菌株杀草谱不够广泛，
发酵工艺复杂，不利于推广应用。
发明内容
[0004] 本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和
缺陷，提供一种克服马唐抗药性的间型弯孢菌，具体为一种间型弯孢菌菌株及其应用和除草剂。
[0005] 为解决上述技术问题，从湖南地区棉花田自然发病的马唐中分离、筛选得到1株具有强致病力的菌株，从形态学和分子生物学方面对其进行了鉴定，同时对其
生物防治效果和作物安全性进行了评估，旨在为马唐真菌除草剂的研发提供依据，解决湖南棉田马唐的抗药性问题。本发明提出的技术方案为提供一种间型弯孢菌菌株，所述间型弯孢菌(Curvularia intermedia)菌株命名为mt-3，其于2016年12月23日被保藏于中国
微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.13376。
[0006] 本发明的间型弯孢菌，是一种马唐致病菌，寄主范围广，寄主范围包括马唐、
牛筋草、千金子、狗尾草、鳢肠和马齿苋等，对玉米和棉花等作物无害，可用作玉米和棉花等作物田间的微生物除草剂制备。间型弯孢菌(Curvularia intermedia)mt-3与背景技术提到的这些菌株比较，杀草谱更广泛，对马唐、牛筋草、旱稗、马齿苋等杂草均有防治效果，适合用于棉花田除草；另外，具有发酵工艺简单，制剂配方成熟，有推广应用前景。
[0007] 上述的间型弯孢菌菌株的分离方法，包括如下步骤：
[0008] (1)从马唐自然发病的
叶片病健交界处剪取组织
块，于
质量浓度为0.1％的氯化汞溶液中进行表面消毒3min，用无菌
水冲洗3次；
[0009] (2)将所述步骤(1)冲洗后得到的组织块置于PDA培养基上进行恒温培养，恒温培养的
温度为28℃；
[0010] (3)待所述步骤(2)恒温培养长出菌落后，从菌落边缘挑取菌丝，移入新的PDA培养基上培养，经过分离纯化得到所述的间型弯孢菌菌株。
[0011] 基于一个总的技术构思，本发明还提供一种上述间型弯孢菌mt-3在制备除草剂中的应用，包括以下步骤：利用间型弯孢菌mt-3接种于PD培养液(
酵母浸出粉胨
葡萄糖培养液)后进行震荡培养，
真空抽滤培养液，经微孔滤
膜过滤后得到包含间型弯孢孢子的发酵液，再利用发酵液或发酵液中的间型弯孢孢子制备所述的除草剂。
[0012] 上述的应用，优选的，所述震荡培养的温度为28℃，震荡培养的转速为150r/min，震荡培养的时间为7d；
[0013] 更优选的，所述发酵液中含有20-1000亿间型弯孢孢子/克。
[0014] 一种除草剂，剂型为水剂，主要由所述间型弯孢菌mt-3的发酵液组成，所述发酵液中含有间型弯孢孢子。
[0015] 优选的，所述水剂的除草剂包括质量分数的发酵液95-99％和吐温801-5％，所述发酵液中含有20-1000亿间型弯孢孢子/克。
[0016] 更优选的，所述发酵液由间型弯孢菌mt-3接种于PD培养液后经震荡培养、真空抽滤及微孔滤膜过滤后制得；所述震荡培养的温度为28℃，震荡培养的转速为150r/min，震荡培养的时间为7d。
[0017] 一种除草剂，剂型为
可湿性粉剂，主要由所述间型弯孢菌mt-3的间型弯孢孢子组成。
[0018] 优选的，所述可湿性粉剂的除草剂包括以下质量分数的各组分：间型弯孢孢子70％、崩悬剂DK83％、润湿剂1％、白
炭黑3％和
高岭土23％。
[0019] 更优选的，所述间型弯孢孢子由间型弯孢菌mt-3接种于PD培养液后经震荡培养、真空抽滤及微孔滤膜过滤得到发酵液，然后从发酵液中分离得到；所述震荡培养的温度为28℃，震荡培养的转速为150r/min，震荡培养的时间为7d。
[0020] 本发明的除草剂，成分简单，环境友好，施用简单，杀草谱广，在对玉米和棉花等作物无害的前提下，对马唐、牛筋草、千金子、狗尾草、旱稗、鳢肠和马齿苋等杂草的防治效果达到了75％以上，除草效果见效快，是一种可长期投入使用的生物除草剂。
[0021] 与
现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0022] 1、本发明的间型弯孢菌，命名为间型弯孢菌mt-3，是一种马唐致病菌，寄主范围广，寄主范围包括马唐、牛筋草、千金子、狗尾草、鳢肠和马齿苋等，对玉米和棉花等作物无害，可用作玉米和棉花等作物田间的微生物除草剂制备。
[0023] 2、本发明的除草剂，成分简单，环境友好，施用简单，杀草谱广，在对玉米和棉花等作物无害的前提下，对马唐、牛筋草、千金子、狗尾草、鳢肠和马齿苋等杂草的防治效果达到了75％以上，除草效果见效快，是一种可长期投入使用的生物除草剂。
[0025] 一种间型弯孢菌菌株，所述间型弯孢菌(Curvularia intermedia)菌株命名为mt-3，其于2016年12月23日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该保藏机构的简称为CGMCC，该保藏机构的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.13376。
附图说明
[0026] 为了更清楚地说明本发明
实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0027] 图1是实施例中马唐植株上接种菌株发酵液和无菌PDA培养液的致病性测定对比图。
[0028] 图2是实施例中马唐整株喷施菌株发酵液和无菌PDA培养液的致病性测定对比图。
具体实施方式
[0029] 为了便于理解本发明，下文将结合
说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
[0030] 除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
[0031] 除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、
试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
[0032] 实施例：
[0033] 一种间型弯孢菌菌株，所述间型弯孢菌(Curvularia intermedia)菌株命名为mt-3，其于2016年12月23日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该保藏机构的简称为CGMCC，该保藏机构的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.13376。
[0034] 1.病原真菌的分离
[0035] 采集湖南棉田马唐自然发病的叶片，记录植株发病症状。从病健交界处剪取组织块，于0.1％的升汞溶液中表面消毒3分钟，无菌水冲洗3次，置于PDA培养基上，28℃恒温培养，待长出菌落后，从菌落边缘挑取部分菌丝，移入新的PDA平板上培养，经过分离纯化得到一种间型弯孢菌(Curvularia intermedia)菌株，命名为mt-3，其于2016年12月23日保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.13376。
[0036] 2.菌株mt-3的致病性测定
[0037] 采用离体法测定菌株mt-3对马唐叶片的致病性。用打孔器打取已培养7d的菌落菌丝块，接种至PD培养液(100mL/瓶)，每瓶接种3块直径为9毫米的菌丝块，28℃、150r/min振荡培养。7d后真空抽滤培养液，再用微孔滤膜过滤，获得发酵液。用微型
喷雾器喷洒接种至1叶1心～2叶期的马唐植株上(Treantment)，接种量20mL/盆。以无菌PDA培养液为对照(CK)，每处理重复3次。接种后3d叶片上出现轻微病变，菌丝块长出大量菌丝，逐渐向叶片周围侵染，叶片开始变黄，5d后叶片出现褐色斑点，并逐渐扩大，叶片变黑腐烂(图1)。整株喷施菌株发酵液后2d，抗性马唐植株表现出病变症状，叶片变黄褪绿，5d后逐渐萎蔫，最终整株呈枯萎死亡状(图2)。
[0038] 为了进一步测定菌株mt-3对不同生育期马唐的致病性，我们采用菌丝块接种法，分别于马唐的1叶1心～2叶、3叶～3叶1心和4叶1心～5叶期进行接种。每处理1盆，每盆保留10株生长一致的马唐。如表1所示，菌丝体发酵液接种不同生育期的马唐植株后5d，1叶1心～2叶、3叶～3叶1心和4叶1心～5叶期的抗性马唐植株的发病率高达100％、95％和
88.33％，平均鲜重防效分别达到了82.78％、79.24％和63.37％，其中1叶1心～2叶期的马唐对菌丝体发酵液最敏感。
[0039] 表1菌株mt-3对不同生育期马唐的致病性
[0040]
[0041] 注：表中数值为平均值±标准误，同列数据后的不同字母表示在0.05水平上差异显著。
[0042] 3.菌株mt-3的寄主范围测定
[0043] 除了马唐之外，我们还准备供试杂草牛筋草、千金子、狗尾草、鳢肠和马齿苋，与棉花和玉米种苗一起同时处理，在三叶一心期，利用mt-3发酵液进行喷雾处理，保湿48小时，以未施用mt-3发酵液的
植物作为对照，调查施用mt-3发酵液的植物的发病情况。结果如表2所示，菌株mt-3对供试作物棉花表现为无症状(NS)，对供试杂草牛筋草、千金子和狗尾草表现为中等感病(MS)，在接种植株上端叶片出现病斑，后期株高和长势受到抑制，对鳢肠和马齿苋表现为轻微反应(LS)，叶片上产生少量较小的病斑。
[0044] 表2菌株mt-3的寄主范围测定
[0045]
[0046] 4.菌株mt-3的防治效果测定
[0047] 以异丙甲草胺
乳油为对照药剂，在2016年汉寿县棉花田进行田间试验，菌株mt-3发酵好后，棉花苗移栽7天后，用菌株mt-3发酵液，发酵液的制备方法同上，发酵液中含有20-1000亿间型弯孢孢子/克。菌株mt-3发酵液的浓度为每亩500、600、800、1200ml，选用异丙甲草胺作对照药剂，结果如表3所示，结果表明对总草的防治效果达到75％以上，尤其对马齿苋和牛筋草的防治效果达到80％以上，对旱稗的防治效果最高也达到了83％，与对照药剂和人工除草的防治效果相当，真正实现杂草的环境无害化生物防治。
[0048] 表3菌株mt-3的防治效果测定
[0049]
[0050]
[0051] 可以将发酵液与吐温80混配按质量分数发酵液95-99％和吐温801-5％的配比制成除草剂，发酵液中含有20-1000亿间型弯孢孢子/克；也可以将发酵液中的间型弯孢孢子分离出来，按质量份数间型弯孢孢子70％、崩悬剂DK83％、润湿剂1％、白炭黑3％和高岭土23％的配比制成除草剂，发酵液的制备方法同上。用除草剂对移栽7天后的棉花苗进行喷施，对杂草的防治效果均在75％以上。
