一种改良禾谷类作物耐盐性状的方法
阅读：928发布：2021-09-17
专利汇可以提供一种改良禾谷类作物耐盐性状的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供一种 禾谷类作物 耐盐性 状改良的方法，该方法包括在游离后小孢子、胚状体诱导、再生植株的分化培养过程中分别给予NaCl胁迫筛选，用NaCl对所述作物的小孢子进行离体处理，在诱导培养期、植株分化期分别给予NaCl胁迫筛选，层层淘汰，获得生根的再生植株后，移栽至 温室 ，成熟后按株 收获 。收获后的 种子 置于添加NaCl的胁迫培养基上发芽，从中筛选出耐盐性强的加倍单倍体株系。本发明实施方法简便，易于掌握，整个筛选过程都在实验室完全一致的可控条件下进行，使结果真实可靠。，下面是一种改良禾谷类作物耐盐性状的方法专利的具体信息内容。
1.一种改良禾谷类作物耐盐性状的方法，该方法包括：
1)取该作物孕穗期的花药游离小孢子，置于添加有NaCl 50～500mg/L的预处理液中，获取存活、耐盐的小孢子；
2)收集步骤1)获得的小孢子置于添加NaCl 50～500mg/L、2，4，5-T 0.5～2.0mg/L、KT 0.3～1.0mg/L，麦芽糖60～120g/L，pH 5.6～6.0的N6诱导培养基上培养，获取胚状体；
3)将步骤2)所得胚状体置于添加NaCl 50～500mg/L、6-BA 0.5～1.5mg/L、KT 0.5～
2.0mg/L、NAA 0.01～0.1mg/L和麦芽糖10～50g/L，pH为5.6～6.0的2/3MS分化培养基上培养，获取再生植株；
4)将步骤3)获得的再生植株置于添加添加NAA 0.02～0.08mg/L、多效唑2.0～
10.0mg/L和蔗糖10～40g/L，pH5.6～6.0的1/2MS生根壮苗培养基上培养，获取根、茎、叶完整的再生植株；
从而获得耐盐的禾谷类作物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
5)将步骤4)所得的再生植株移入土壤，待成熟后收获种子；和
6)将种子置于添加NaCl 50～500mg/L的培养基上发芽，选择NaCl耐性强的材料。
3.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其特征在于，所述禾谷类作物是大麦、小麦和水稻。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述N6诱导培养基含有200～400mg/L的NaCl，0.8～1.5mg/L的2，4，5-T，0.4～0.8mg/L的KT，和80～100g/L的麦芽糖，pH为
5.6～5.9。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述2/3MS分化培养基含有200～400mg/L的NaCl，0.4～1.0mg/L的6-BA，1.0～1.8mg/L的KT，0.02～0.08mg/L的NAA，20～40g/L的麦芽糖，pH为5.7～5.8。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述1/2MS生根壮苗培养基含有0.03～
0.06mg/L的NAA，3.0～8.0mg/L的MET，20～30g/L的蔗糖，pH为5.8～5.9。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法包括：
1)取所述作物孕穗期花药游离小孢子，置于添加NaCl 50～500mg/L的预处理液中，获取存活、耐盐的小孢子；
2)收集处理后的小孢子置于添加NaCl 50～500mg/L、2，4，5-T 0.5～2.0mg/L、KT
0.5～1.0mg/L，麦芽糖90g/L，pH 5.8的N6诱导培养基上培养，获取胚状体；
3)胚状体置于添加NaCl 50～500mg/L、6-BA 0.5～1.5mg/L、KT 0.5～2.0mg/L、NAA
0.01～0.1mg/L和麦芽糖30g/L，PH为5.8的2/3MS分化培养基上培养，获取再生植株；
4)再生植株置于添加NAA 0.05mg/L、多效唑(MET)5.0mg/L和蔗糖20g/L，pH5.8的
1/2MS生根壮苗培养基上培养，获取根、茎、叶完整的再生植株；
5)再生植株移入土壤，待成熟后收获种子；和
6)将种子置于添加NaCl 50～500mg/L的培养基上发芽，选择NaCl耐性强的材料。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预处理液含有NaCl 50～500mg/L、甘露醇40～80g/L、CaCl2 0.8～1.5g/L和MES 0.6～1.5g/L。
9.一种用于实施权利要求1-8中任一项所述的方法的套盒，其特征在于，所述套盒含有权利要求1所述的预处理液、N6诱导培养基、2/3MS分化培养基和/或1/2MS生根壮苗培养基。
10.如权利要求9所述的套盒，其特征在于：
所述预处理液含有NaCl 50～500mg/L、甘露醇40～80g/L、CaCl2 0.8～1.5g/L、和MES 0.6～1.5g/L；
所述N6诱导培养基含有200～400mg/L的NaCl，0.8～1.5mg/L的2，4，5-T，0.4～
0.8mg/L的KT，和80～100g/L的麦芽糖，pH为5.6～5.9；
所述2/3MS分化培养基含有200～400mg/L的NaCl，0.4～1.0mg/L的6-BA，1.0～
1.8mg/L的KT，0.02～0.08mg/L的NAA，20～40g/L的麦芽糖，pH为5.7～5.8；
所述1/2MS生根壮苗培养基含有0.03～0.06mg/L的NAA，3.0～8.0mg/L的MET，20～
30g/L的蔗糖，pH为5.8～5.9。
一种改良禾谷类作物耐盐性状的方法
技术领域
背景技术
[0002] 以种子作为繁殖方式的禾谷类作物中，小麦和水稻是我国的主要粮食作物，大麦是我国制造啤酒的主要原料和藏区人民的主要粮食作物。随着国民经济和社会的迅速发展，人口增长与可耕地减少的矛盾日益突出。我国拥有大片含盐量不等的土壤，培育耐盐性提高的禾谷类作物可以增加我国的可耕地面积，提高粮食总产。
[0003] 以种子作为繁殖方式的禾谷类作物，例如小麦和水稻的耐盐性较差，大麦的耐盐性一般，急需通过遗传改良的方法，培育耐盐性提高的新品种。通常大多采用诱变手段，在其后代中筛选耐盐性提高的变异材料；采用杂交育种方法，在其后代中筛选耐盐性提高的性状重组优良株系。也有通过花药培养方法获取耐盐性提高的株系的报道。
[0004] 小孢子培养是真正意义上的单倍体细胞培养，对NaCl胁迫的反应比花药更为敏感，并且每一携带抗盐基因的细胞所受的胁迫更为相当一致，小孢子经NaCl胁迫培养后存活的再生植株全部为单倍体或加倍单倍体植株。在小孢子诱导培养、分化培养和生根培养三个过程中连续给予NaCl胁迫处理后更易获得耐盐性提高的变异体或重组体材料。
[0005] 本领域仍需要获得以种子作为繁殖方式的禾谷类作物耐盐性状的种质材料，在我国滨海盐渍土上能够大量种植，有效利用有限资源。
发明内容
[0006] 本发明针对禾谷类现有种质材料中缺乏耐盐品种的不足，提供一种新的禾谷类耐盐株系的获得及离体筛选的方法，且筛选条件易于统一控制，不受外界自然条件的限制。
[0007] 因此，本发明第一方面涉及一种改良禾谷类作物耐盐性状的方法，该方法包括：
[0008] 1)取该作物孕穗期的花药游离小孢子，置于添加有NaCl 50～500mg/L的预处理液中，获取存活、耐盐的小孢子；
[0009] 2)收集步骤1)获得的小孢子置于添加NaCl 50～500mg/L、2，4，5-T 0.5～2.0mg/L、KT 0.3～1.0mg/L，麦芽糖60～120g/L，pH 5.6～6.0的N6诱导培养基上培养，获取胚状体；
[0010] 3)将步骤2)所得胚状体置于添加NaCl 50～500mg/L、6-BA 0.5～1.5mg/L、KT0.5～2.0mg/L、NAA 0.01～0.1mg/L和麦芽糖10～50g/L，pH为5.6～6.0的2/3MS分化培养基上培养，获取再生植株；
[0011] 4)将步骤3)获得的再生植株置于添加NAA 0.02～0.08mg/L、多效唑2.0～10.0mg/L和蔗糖10～40g/L，pH5.6～6.0的1/2MS生根壮苗培养基上培养，获取根、茎、叶完整的再生植株；
[0012] 从而获得耐盐性提高的禾谷类作物。
[0013] 在一个具体实施例中，所述方法还包括：
[0014] 5)将步骤4)所得的再生植株移入土壤，待成熟后收获种子；和
[0015] 6)将种子置于添加NaCl 50～500mg/L的培养基上发芽，选择NaCl耐性强的材料。
[0016] 在一优选实施例中，所述禾谷类作物是大麦、小麦和水稻。
[0017] 在一优选实施例中，所述N6诱导培养基含有200～400mg/L的NaCl，0.8～1.5mg/L的2，4，5-T，0.4～0.8mg/L的KT，和80～100g/L的麦芽糖，pH为5.6～5.9。
[0018] 在一优选实施例中，所述2/3MS分化培养基含有200～400mg/L的NaCl，0.4～1.0mg/L的6-BA，1.0～1.8mg/L的KT，0.02～0.08mg/L的NAA，20～40g/L的麦芽糖，pH为5.7～5.8。
[0019] 在一优选实施例中，所述1/2MS生根壮苗培养基含有0.03～0.06mg/L的NAA，3.0～8.0mg/L的MET，20～30g/L的蔗糖，pH为5.8～5.9。
[0020] 在一优选实施例中，该方法包括：
[0021] 1)取所述作物孕穗期花药游离小孢子，置于添加NaCl 50～500mg/L的预处理液中，获取存活、耐盐的小孢子；
[0022] 2)收集处理后的小孢子置于添加NaCl 50～500mg/L、2，4，5-T 0.5～2.0mg/L、KT 0.5～1.0mg/L，麦芽糖90g/L，pH 5.8的N6诱导培养基上培养，获取胚状体；
[0023] 3)胚状体置于添加NaCl 50～500mg/L、6-BA 0.5～1.5mg/L、KT 0.5～2.0mg/L、NAA 0.01～0.1mg/L和麦芽糖30g/L，PH为5.8的2/3MS分化培养基上培养，获取再生植株；
[0024] 4)再生植株置于添加NAA 0.05mg/L、多效唑(MET)5.0mg/L和蔗糖20g/L，pH5.8的1/2MS生根壮苗培养基上培养，获取根、茎、叶完整的再生植株；
[0025] 5)再生植株移入土壤，待成熟后收获种子；和
[0026] 6)将种子置于添加NaCl 50～500mg/L的培养基上发芽，选择NaCl耐性强的材料。
[0027] 在一优选实施例中，所述预处理液含有NaCl 50～500mg/L、甘露醇40～80g/L、CaCl20.8～1.5g/L和MES 0.6～1.5g/L。
[0028] 本发明另一方面涉及一种用于实施本发明所述的方法的套盒，所述套盒含有本文所述的预处理液、N6诱导培养基、2/3MS分化培养基和/或1/2MS生根壮苗培养基。
[0029] 在一优选实施例中，在所述套盒中：
[0030] 所述预处理液含有NaCl 50～500mg/L、甘露醇40～80g/L、CaCl20.8～1.5g/L、和MES 0.6～1.5g/L；
[0031] 所述N6诱导培养基含有200～400mg/L的NaCl，0.8～1.5mg/L的2，4，5-T，0.4～0.8mg/L的KT，和80～100g/L的麦芽糖，pH为5.6～5.9；
[0032] 所述2/3MS分化培养基含有200～400mg/L的NaCl，0.4～1.0mg/L的6-BA，1.0～1.8mg/L的KT，0.02～0.08mg/L的NAA，20～40g/L的麦芽糖，pH为5.7～5.8；
[0033] 所述1/2MS生根壮苗培养基含有0.03～0.06mg/L的NAA，3.0～8.0mg/L的MET，20～30g/L的蔗糖，pH为5.8～5.9。
[0034] 在一方面，本申请也包括本文所述的预处理液、N6诱导培养基、2/3MS分化培养基和1/2MS生根壮苗培养基。
具体实施方式
[0035] 本申请涉及一种改良禾谷类作物耐盐性状的方法，该方法包括：
[0036] 1)取该作物孕穗期的花药游离小孢子，置于添加NaCl 50～500mg/L的预处理液中，获取存活、耐盐的小孢子；
[0037] 2)收集处理后的小孢子置于添加NaCl 50～500mg/L、2，4，5-T 0.5～2.0mg/L、KT 0.3～1.0mg/L，麦芽糖60～120g/L，pH 5.6～6.0的N6诱导培养基上培养，获取胚状体；
[0038] 3)胚状体置于添加NaCl 50～500mg/L、6-BA 0.5～1.5mg/L、KT 0.5～2.0mg/L、NAA 0.01～0.1mg/L和麦芽糖10～50g/L，pH为5.6～6.0的2/3MS分化培养基上培养，获取再生植株；
[0039] 4)再生植株置于添加NAA 0.02～0.08mg/L、多效唑2.0～10.0mg/L和蔗糖10～40g/L，pH5.6～6.0的1/2MS生根壮苗培养基上培养，获取根、茎、叶完整的再生植株；
[0040] 由此可获得耐盐性提高的禾谷类作物。
[0041] 实施本申请时，可从大田选取中部小花小孢子发育处于单核早期、中期的穗子，放入冰箱冷藏12～20天左右。接种时，先用例如饱和的漂白粉溶液消毒穗子大约15～20min，然后用无菌水冲洗2～4次。每个试管接大约10～15个穗子，倒入约15～20ml的NaCl 50～500mg/L、甘露醇40～80g/L、CaCl20.8～1.5g/L、MES 0.6～1.5g/L的提取液，用高速分散器超速(例如3000-4000rpm)旋切，150目筛网过滤，低速(例如800～
100rpm)离心滤液，重复2～3次，收集小孢子。
100rpm)离心滤液，重复2～3次，收集小孢子。
[0042] 然后用NaCl 50～500mg/L、甘露醇40～80g/L、CaCl20.8～1.5g/L、MES(2-吗啉乙磺酸)0.6～1.5g/L的提取液(预处理液)于25℃左右、黑暗预处理小孢子1～3天。
[0043] 提取液中NaCl的优选浓度范围为200～400mg/L，更优选可以为约300mg/L。
[0044] 甘露醇的优选浓度范围为50～70g/L，更优选为约60g/L。
[0045] CaCl2的优选浓度范围为1.0～1.3g/L，更优选为约1.1g/L。
[0046] MES的优选浓度范围为0.8～1.2g/L，更优选为约1.0～1.2g/L。在一个具体实施例中，MES的浓度为0.976g/L。
[0047] 可用诱导培养基诱导胚状体。诱导培养基以N6培养基为基本培养基，添加有NaCl50～500mg/L、2，4，5-T 0.5～2.0mg/L、KT 0.3～1.0mg/L，麦芽糖60～120g/L，pH 5.6～
6.0。
6.0。
[0048] 诱导培养基中，NaCl的优选浓度范围为200～400mg/L。在一具体实施例中，NaCl的浓度为300mg/L。
[0050] KT(6-糠氨基嘌呤)的优选浓度范围为0.4～0.8mg/L，更优选为0.5～0.6mg/L。
[0051] 麦芽糖的优选浓度范围为80～100g/L。在一具体实施例中，麦芽糖的浓度为90g/L。
[0052] pH优选为5.6～5.9，更优选为5.8。
[0053] 诱导培养前可将现有诱导培养基洗涤小孢子1到2次，然后用诱导培养基将5
小孢子密度调节至1.0～1.2×10/ml，取大约1.5～2ml小孢子悬浮液接种于培养皿(30×15mm)，Parafilm封口，室温下(大约25～28℃)暗培养约15～25天。
小孢子密度调节至1.0～1.2×10/ml，取大约1.5～2ml小孢子悬浮液接种于培养皿(30×15mm)，Parafilm封口，室温下(大约25～28℃)暗培养约15～25天。
[0054] N6培养基的配方如下表1所示(单位：mg/L)：
[0055] 表1
[0056] N6大量元素：
[0057] (NH4)2SO4 463
[0058] KNO3 2830
[0059] CaCl2·2H2O 166
[0060] MgSO4·7H2O 185
[0061] KH2PO4 400
[0062] N6微量元素：
[0063] H3BO3 1.6
[0064] KI 0.83
[0065] MnSO4·4H2O 5.0
[0066] ZnSO4·7H2O 1.5
[0068] Na2EDTA 37.3
[0069] FeSO4·7H2O 27.8
[0070] N6有机元素：
[0071] 盐酸硫胺素 1.0
[0072] 盐酸吡多辛 0.5
[0073] 甘氨酸 2.0
[0074] 烟酸 0.5
[0075] 肌醇 100.0
[0076] N6培养基可自行按上述配方配制，也可向Sigma等化学试剂公司购买成品。然后根据本文所述配方配制本文的N6诱导培养基。本领域技术人员将理解，可对上述表1所示的浓度作出适当的变动，例如有大约5％(例如3％左右、2％左右、1％左右，或更低的变动范围)或更低的变动，由此配制得到的培养基仍然具有所需的生物学功能，仍能用于实施本发明。例如，以肌醇为例，每升N6培养基中可含有大约95～105mg的肌醇(5％的变动幅度)。其它成分的浓度也如此变动。此外，N6培养基中的成分也可使用功能和性质相同或相似的成分加以替换。
[0077] 诱导培养后可将所得胚状体转移至分化培养基上。分化培养基以2/3MS为基本培养基，其中加有NaCl 50～500mg/L、6-BA 0.5～1.5mg/L、KT 0.5～2.0mg/L、NAA 0.01～0.1mg/L和麦芽糖10～50g/L，pH为5.6～6.0。
[0078] 分化培养基中所添加的NaCl优选为200～400mg/L，更优选300～400mg/L。
[0079] 6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)的优选浓度为0.4～1.0mg/L，更优选为0.5～0.8mg/L。
[0080] KT的优选浓度为1.0～1.8mg/L，更优选为1.2～1.5mg/L。
[0081] NAA(萘乙酸)的优选浓度0.02～0.08mg/L，更优选为0.03～0.06mg/L。在一具体实施方式中，NAA的浓度为0.05mg/L。
[0082] 麦芽糖的浓度为20～40g/L，更优选为20～30g/L。
[0083] 分化培养基的pH优选为5.7～5.8。
[0084] MS培养基的配方如下表2所示(单位：mg/L)：
[0085] 表2
[0086] MS大量元素：
[0087] NH4NO4 1650
[0088] KNO3 1900
[0089] CaCl2·2H2O 440
[0090] MgSO4·7H2O 370
[0091] KH2PO4 170
[0092] MS微量元素：
[0093] H3BO3 36.2
[0094] KI 0.83
[0095] MnSO4·4H2O 22.3
[0096] ZnSO4·7H2O 8.6
[0097] Na2MoO4·2H2O 0.25
[0098] CuSO4·5H2O 0.025
[0099] CoCl2·6H2O 0.025
[0100] MS铁盐：
[0101] Na2EDTA 37.3
[0102] FeSO4·7H2O 27.8
[0103] MS有机元素：
[0104] 盐酸硫胺素 0.1
[0105] 盐酸吡多辛 0.5
[0106] 烟酸 0.5
[0107] 甘氨酸 2.0
[0108] 肌醇 100.0
[0109] MS可自行按上述配方配制，也可向Sigma等化学试剂公司购买成品。2/3MS培养基则是将MS培养基的大量元素减少1/3，而微量元素、铁盐和有机元素不变。然后根据本文所述配方配制本文的2/3MS诱导培养基。本领域技术人员将理解，可对上述表1所示的浓度作出适当的变动，例如有大约5％(例如3％左右、2％左右、1％左右，或更低的变动范围)或更低的变动，由此配制得到的培养基仍然具有所需的生物学功能，仍能用于实施本发明。例如，以肌醇为例，每升2/3MS培养基中可含有大约95～105mg的肌醇(5％的变动幅度)。
其它成分的浓度也如此变动。此外，2/3MS诱导培养基中的成分也可使用功能和性质相同或相似的成分加以替换。
其它成分的浓度也如此变动。此外，2/3MS诱导培养基中的成分也可使用功能和性质相同或相似的成分加以替换。
[0110] 在一具体实施例中，使用添加了NaCl 300mg/L、6-BA 0.5mg/L、KT 1.5mg/L、NAA0.05mg/L和麦芽糖30g/L，PH为5.8的2/3MS分化培养基来培养胚状体。
[0111] 可在25±1℃，每天10～12小时光照的条件下分化胁迫培养25～30天，直至分化出绿色再生植株。
[0112] 分化出的再生植株可转入NAA 0.02～0.08mg/L、多效唑(MET)2.0～10.0mg/L和蔗糖10～40g/L，pH5.6～6.0的1/2MS生根壮苗培养基。在25±1℃，每天10～12小时光照的条件下进行25～30天的生根壮苗培养。
[0113] 生根壮苗培养基中，NAA的优选浓度范围为0.03～0.06mg/L，更优选为0.04～0.05mg/L。
[0114] MET的优选浓度范围为3.0～8.0mg/L，更优选为4.0～6.0mg/L。
[0115] 在一具体实施例中，MET的浓度为5.0mg/L。
[0116] 蔗糖的优选浓度范围为20～30g/L。在一具体实施例中，蔗糖的浓度为20g/L。
[0117] 生根壮苗培养基的pH优选为5.8～5.9。
[0118] 1/2MS生根壮苗培养基是将表2所示的MS培养基的大量元素减半，并加入本申请所述的添加成分后而配制得到。
[0119] 在一具体实施例中，生根壮苗培养基是添加NAA 0.05mg/L、多效唑(MET)5.0mg/L和蔗糖20g/L，pH5.8的1/2MS生根壮苗培养基。
[0120] 经生根壮苗培养基培养获得的再生植株即为耐盐植株。
[0121] 在本申请的具体实施方式中，本申请的方法还可包括：
[0122] 5)将经生根壮苗培养的再生植株移入土壤，待成熟后收获种子；和[0123] 6)将种子置于添加NaCl 50～500mg/L的培养基上发芽，选择NaCl耐性强的材料。
[0124] 经过生根壮苗培养的耐盐植株成为根茎叶齐全的完整植株，移栽前1天先将培养瓶打开，在实验室中炼苗。炼苗结束后，用镊子小心地把植株从培养瓶中移出，尽量保持根系的完整，洗去附着的培养基，将苗移入育苗钵中，浇水后用塑料薄膜罩住，保湿2～3天。去掉塑料薄膜后在20±1℃，每天10～12小时光照的条件下生长至成熟。成熟后的种子按株收获。
[0125] 可选用直径9cm的培养皿，清洗干净后灭菌并烘干，放入两张滤纸。每个株系选取大约30～40粒健康种子，用例如3％双氧水(H2O2)消毒6～10min，蒸馏水冲洗2～3次，然后在大约30℃左右将种子浸泡于蒸馏水6～8小时，结束后保湿过夜。等种子露白后均匀排放于培养皿中间，加入5～15g/L、较佳8～12g/L的NaCl溶液，用蒸馏水作对照，并将所有培养皿置于约27℃恒温每天10～12小时光照的光照培养箱中发芽。5天后统计发芽率、主根长度、胚芽鞘长度。
[0126] 可选择发芽率高、主根长度、胚芽鞘长度与对照相比差异小的株系种植于大田。
[0127] 因此，本申请也包括采用本申请方法筛选得到的植株、及其它繁殖材料等。
[0128] 本申请也包括用于实施本申请方法的上述各种提取液和培养基。
[0129] 本申请另一方面提供一种提取液，所述提取液含有NaCl 50～500mg/L、甘露醇40～80g/L、CaCl20.8～1.5g/L、MES 0.6～1.5g/L。
[0130] 本申请也包括一种诱导培养基，用于实施本申请所述的筛选方法。该诱导培养基以N6培养基为基本培养基，添加有NaCl 50～500mg/L、2，4，5-T 0.5～2.0mg/L、KT 0.3～1.0mg/L，麦芽糖60～120g/L，pH 5.6～6.0。
[0131] 诱导培养基中，NaCl的优选浓度范围为200～400mg/L。在一具体实施例中，NaCl的浓度为300mg/L。
[0132] 2，4，5-T的优选浓度范围为0.8～1.5mg/L，更优选为1.0～1.2mg/L。
[0133] KT的优选浓度范围为0.4～0.8mg/L，更优选为0.5～0.6mg/L。
[0134] 麦芽糖的优选浓度范围为80～100g/L。在一具体实施例中，麦芽糖的浓度为90g/L。
[0135] pH优选为5.6～5.9，更优选为5.8。
[0136] 本申请还包括含有上述甘露醇提取液、诱导培养基、分化培养基和生根壮苗培养基的套盒。各提取液和培养基可分装在不同的容器中。任选地，该套盒还可包括指导使用其中所包含的试剂实施获得耐盐性状稳定的材料的方法的说明书。
[0137] 本申请中，所述禾谷类作物包括大麦、小麦和水稻。
[0138] 与传统育种方法相比，本发明方法简便，易于掌握、实施；耐盐株系的获得和耐盐性状的筛选都在实验室完全一致的条件下进行，不受外界条件的影响；利用小孢子作为起始材料，可获得大量的胚状体，在小孢子培养过程中进行耐盐性状离体筛选，可严格筛选，大胆淘汰；整个过程都在培养室中进行，同时又降低了劳动力和农田的使用，且可周年重复试验，不断提供筛选材料，既缩短了育种时间，又能获得大量的种质材料；采用小孢子、胚状体诱导和再生植株分化三个阶段分别进行离体耐盐筛选，并结合耐盐株系种子萌发过程中的回复筛选，筛选结果真实可信。
[0139] 申请人的实验表明，利用本发明可在不到半年的时间内完成禾谷类株系筛选，获得耐盐性状稳定的材料种植后获得种子用于进一步的田间检测。本发明可大大缩短育种时间。所得材料是经过三步筛选，经过染色体加倍后耐盐性状得以纯合、固定，同一株系的后代，表现统一。利用本发明，在一年时间内，已离体筛选获得5份耐盐株系。
[0140] 因此，本发明另一方面还包括采用本发明方法获得的各步骤所产生的胚状体、最后所获得的耐盐株系等。
[0141] 下文将以大麦为例对本发明进行描述。应理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下可对本发明做出各种修改和变动。且也可采用本发明的方法用于其它禾谷类作物，并能产生相同的效果。以下实施例仅仅是阐述性的，本发明的范围由本申请的权利要求加以限定。如无特别说明，本发明所用的百分比为重量体积百分比。此外，应理解，上述各试剂的优选范围可任意组合，只要其能实现本发明的发明目的即可。
[0142] 实施例
[0143] 实施例1：大麦小孢子的耐盐筛选
[0144] 从大田选取中部小花小孢子发育处于单核早期、中期的穗子，放入冰箱冷藏15天。接种时，穗子用饱和的漂白粉溶液消毒15min，无菌水冲洗3～4次。每个试管接10个穗子，倒入15ml NaCl 300mg/L、甘露醇60g/L、CaCl21.1g/L、MES 0.976g/L的提取液，用3000rpm的高速分散器超速旋切，150目筛网过滤，滤液以800rpm低速离心，重复3次，收集小孢子。小孢子用NaCl 300mg/L、甘露醇60g/L、CaCl21.1g/L、MES 0.976g/L的提取液于
25℃、黑暗预处理2d。
25℃、黑暗预处理2d。
[0145] 实施例2：耐盐胚状体的获取
[0146] 诱导培养基以N6培养基为基本培养基，其中加有NaCl 300mg/L、2，4，5-T1.0mg/L、KT 0.5mg/L，麦芽糖90g/L，pH 5.8。培养前将小孢子用培养基洗涤1次，然后用培养基将5
小孢子密度调节至1.0～1.2×10/ml，取1.5ml小孢子悬浮液接种于培养皿(30×15mm)，Parafilm封口，25℃暗培养21d。
小孢子密度调节至1.0～1.2×10/ml，取1.5ml小孢子悬浮液接种于培养皿(30×15mm)，Parafilm封口，25℃暗培养21d。
[0147] 实施例3：耐盐再生植株的获取
[0148] 诱导培养21d后将胚状体转移至分化培养基上。分化培养基以2/3MS为基本培养基，其中加有NaCl 300mg/L、6-BA 0.5mg/L、KT 1.5mg/L、NAA 0.05mg/L和麦芽糖30g/L，PH为5.8。在25±1℃，每天10～12小时光照的条件下分化胁迫培养25～30天，直至分化出绿色再生植株。
[0149] 实施例4：耐盐再生植株的生根培养
[0150] 选取分化出的再生植株，转入添加NAA 0.05mg/L、多效唑(MET)5.0mg/L和蔗糖20g/L，pH5.8的1/2MS生根壮苗培养基。在25±1℃，每天10～12小时光照的条件下进行
25～30天的生根壮苗培养。
25～30天的生根壮苗培养。
[0151] 实施例5：耐盐植株的移栽及种子收获
[0152] 经过生根壮苗培养的耐盐植株成为根茎叶齐全的完整植株，移栽前1天先将培养瓶打开，在实验室中炼苗。炼苗结束后，用镊子小心地把植株从培养瓶中移出，尽量保持根系的完整，洗去附着的培养基，将苗移入育苗钵中，浇水后用塑料薄膜罩住，保湿3d。去掉塑料薄膜后在20±1℃，每天10～12小时光照的条件下生长至成熟。成熟后的种子按株收获。
[0153] 实施例6：耐盐株系的再次筛选
[0154] 选用直径9cm的培养皿，清洗干净后灭菌并烘干，放入两张滤纸。每个株系选取30粒健康种子，用3％双氧水(H2O2)消毒8min，蒸馏水冲洗3次，然后将种子浸泡于蒸馏水，30℃、8h，结束后保湿过夜，等种子露白后均匀排放于培养皿中间，加入NaCl 10g/L溶液，用蒸馏水作对照，并将所有培养皿置于27℃恒温每天10～12小时光照的光照培养箱中发芽。5d后统计发芽率、主根长度、胚芽鞘长度。选择发芽率高、主根长度、胚芽鞘长度与对照相比差异小的株系种植于大田。
[0155] 实施例7
[0156] 按实施例1收集大麦品种“花30”的小孢子并处理，按实施例2进行小孢子培养诱导胚状体，按实施例3获取耐盐的再生植株，按实施例4进行生根壮苗培养，按实施例5移栽并收获种子，收获后的种子按实施例6进行进一步的耐盐株系筛选，在含NaCl 10g/L萌发液中，耐盐株系自交一代的萌发率在50％～70％、主根长度2.10～3.60cm、胚芽鞘长度1.79～2.96cm，选择5个耐盐性强的株系种植于大田，结实后收获种子。
[0157] 将收获的自交二代种子30粒如实施例6进行耐盐萌发试验，并以原始材料的种子作为对照，同时进行耐盐萌发。
[0158] 实验证明，在含NaCl 10g/L萌发液中，在27±1℃，每天10～12小时光照的条件下培养，5天后，5份耐盐株系自交二代种子萌发率在60％～70％、主根长度2.59～3.59cm、胚芽鞘长度在1.95～3.02cm，而起始材料花30的萌发率只有33.3％、主根长度
1.70cm、胚芽鞘长度1.47cm。由此可见，耐盐株系的耐盐性状稳定。具体结果见下表3。
1.70cm、胚芽鞘长度1.47cm。由此可见，耐盐株系的耐盐性状稳定。具体结果见下表3。
[0159] 表3
[0160]
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