技术领域
[0001] 本
发明涉及一种微生物技术领域，具体涉及一种微生物菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
[0002] 我国重金属污染源农田和耕地的在面积扩大，使得
农作物种植生产方面也受到重金属累积和迁移的影响，
土壤是
生态系统的重要组成部分，其理化性状会影响
植物的生长。生长在土壤重金属污染区域的植物会在繁殖代谢过程中积累重金属，并产生毒害效应，进而通过食物链循环危害动物、人类的生命健康。
[0003]
生物修复因其安全、环保、低耗的优势，在实际重金属污染治理中，以生物修复技术为中心的多种联合修复将会是主要研究方向。因此，微生物菌剂资源的开发尤为重要。
[0004] 针对上述问题，有必要开发一种专用于土壤或农田重金属污染的修复，同时降低作物中重金属含量、并能够促进作物生长，并提高其产量的微生物菌剂产品。
发明内容
[0005] 为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种微生物菌剂及其制备方法和应用。其中微生物菌剂可原位固定化重金属镉离子，有效降低土壤中镉离子的生物有效性，抑制作物对镉离子的吸收，同时还可作为
钾肥促进作物生长。微生物菌剂的制备方法简单、方便。本发明的微生物菌剂可应用于土壤中重金属的
吸附和去除、提高作物产量。
[0006] 为实现本发明目的，本发明提供了一种微生物菌剂，包括吸附载体和混合微生物，所述混合微生物包括胶冻样芽孢杆菌、欧文氏菌和敏捷食酸菌。
[0007] 上述的微生物菌剂，优选的，所吸附载体为伊利石粉和可溶性糖在
乙醇溶液中形成的混合凝聚物。
[0008] 上述的微生物菌剂，优选的，所述可溶性糖为
葡萄糖、
蔗糖、乳糖、麦芽糖、可溶性
淀粉、
纤维素、葡聚糖、甘露醇中的一种或多种。
[0009] 上述的微生物菌剂，优选的，所述吸附载体和混合微生物重量比为70～80：20～30。
[0010] 上述的微生物菌剂，优选的，所述伊利石粉和可溶性糖的
质量比为5～10︰1。
[0011] 本发明还提供了一种所述微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
[0012] S1、制备包含胶冻样芽孢杆菌、欧文氏菌、敏捷食酸菌的混合微生物
发酵液；制备吸附载体；
[0013] S2、将所述混合微生物发酵液和吸附载体混合得到微生物菌剂。
[0014] 上述微生物菌剂的制备方法，优选的，所述S1中所述吸附载体的制备方法为：
[0015] S1-A1、将可溶性糖制备成
水溶液，将伊利石粉浸润在所述水溶液中得到混悬液；
[0016] S1-A2、在所述混悬液中添加乙醇溶液得到混合凝聚物；
[0017] S1-A3、将所述混合凝聚物洗涤、烘干得到吸附载体。
[0018] 上述微生物菌剂的制备方法，优选的，所述S1-A1中所述伊利石粉和可溶性糖的质量比为5～10：1。
[0019] 上述微生物菌剂的制备方法，优选的，所述S1-A2中所述乙醇溶液的质量百分含量为70％～90％。
[0020] 上述微生物菌剂的制备方法，优选的，所述混合微生物的制备方法为：
[0021] S1-B1、将胶冻样芽孢杆菌、欧文氏菌、敏捷食酸菌活化后分别接种到
种子培养基中进行种子培养得到胶冻样芽孢杆菌种子液、欧文氏菌种子液、敏捷食酸菌种子液；
[0022] S1-B2、将所述胶冻样芽孢杆菌种子液、欧文氏菌种子液、敏捷食酸菌种子液均接种到液体发酵培养基中进行液体发酵培养得到液体发酵产物；所述液体发酵培养基的配方包括：5.0～8.0g/L可溶性淀粉、5.0～8.0g/L麸皮粉、1.0～3.0g/L蛋白胨、1.0～3.0g/L
酵母粉、0.5～1.5g/L
碳酸
钙、0.5～1.5g/L
磷酸氢二钾、0.3～0.5g/L
硫酸镁，pH为7.0±0.1。
[0023] 上述微生物菌剂的制备方法，优选的，所述S1-B1中所述活化具体为：30～37℃
温度下培养16～20h。
[0024] 上述微生物菌剂的制备方法，优选的，所述S1-B1中所述种子培养具体为：30～37℃、140～200r/min条件下培养14～18h。
[0025] 上述微生物菌剂的制备方法，优选的，所述S1-B2中所述液体发酵培养具体为：在pH 6.5～7.2、罐压0.05～0.06MPa、温度30～37℃、通
风量1︰0.4～0.6vvm的条件下，培养48～56h，检测活菌数达到10～20亿cfu/mL时，进行离心、
喷雾干燥浓缩。
[0026] 上述微生物菌剂的制备方法，优选的，所述S1-B2中，所述胶冻样芽孢杆菌种子液、欧文氏菌种子液、敏捷食酸菌种子液接种到液体发酵培养基的接种量均为12v/v％～20v/v％。
[0027] 本发明还提供了一种所述微生物菌剂在降低土壤中的重金属含量中的应用。
[0028] 上述微生物菌剂在降低土壤中的重金属含量中的应用，所述应用方法为：
[0029] 将微生物菌剂喷施在农田里，10～15天后进行作物移栽，喷施量为20～30kg/亩。进一步的，所述微生物菌剂单次施用量为28kg/亩。
[0030] 与
现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0031] (一)本发明提供的微生物菌剂中，微生物种类搭配合理，其中胶冻样芽孢杆菌、欧文氏菌具有促生作用，且后者具有解钾功能；敏捷食酸菌能耐受并吸附重金属镉离子，即在降低土壤中重金属生物有效性的同时能够促进作物的生长。
[0032] (二)本发明提供的微生物菌剂中，伊利石具有
比表面积大、多微孔结构、阳离子交换性能良好等特征，对环境中的重
金属离子具有很强的吸附能
力。所述可溶性糖来源广泛，成本低廉，可为微生物菌种生长代谢提供营养物质，同时两者通过乙醇溶液改性后，充分去除了材料中的
水溶性杂质，利于后期功能菌种的存活。
[0033] (三)本发明提供的微生物菌剂中，伊利石粉为富含高钾的层状含水
硅酸盐矿物，整地时施用，可原位固定化重金属离子，抑制作物果实对重金属镉离子的吸收，其释放的钾离子可作为钾肥促进作物的生长。
[0034] (四)本发明提供的微生物菌剂的制备方法，制备过程简单、可控，可应用于工业化生产。
具体实施方式
[0035] 以下
实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的
修改或替换，均属于本发明的范围。
[0036] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用
试剂均为市售。
[0037] 本发明涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100ml溶液中含有溶质的克数。
[0038] 本发明所述重量份可以是μg、mg、g、kg等本领域公知的重量单位，也可以是其倍数，如1/10、1/100、10倍、100倍等。
[0039] 本发明中用于微生物菌剂中的菌株购于中国农业微生物菌种保藏管理中心，胶冻样芽孢杆菌的保藏编号为ACCC 01434、欧文氏菌的保藏编号为ACCC 01443、敏捷食酸菌的保藏编号为ACCC 01080。
[0040] 实施例1
[0041] 一种本发明的微生物菌剂，采用以下制备方法制备得到：
[0042] (1)吸附载体的制备：
[0043] 1.1、将葡聚糖400g溶于1000ml水中，搅拌至溶液透明。伊利石粉、葡萄糖二者粒径为100目。
[0044] 1.2、在葡聚糖溶液中添加伊利石粉50g，使葡聚糖和伊利石粉的质量比为8︰1。充分浸润后搅拌30min得到混悬液。
[0045] 1.3、在上述混悬液中添加3000ml质量分数为80％的乙醇溶液，得到混合凝聚物。将混合凝聚物用去离子洗涤3次，过滤、烘干，得到吸附载体。
[0046] (2)混合微生物的制备：
[0047] 2.1、将胶冻样芽孢杆菌、欧文氏菌、敏捷食酸菌的原始菌种分别在无菌条件下接种于斜面培养基(斜面培养基配方为：
牛肉粉3.0g/L，蛋白胨5.0g/L，
氯化钠5.0g/L，琼脂粉18.0g/L，pH 7.0±0.1)上，37℃条件下培养20h。
[0048] 2.2、将斜面培养基上的菌种在无菌条件下分别接种于种子培养基中(种子培养基配方为：蔗糖10.0g/L，蛋白胨10.0g/L，酵母膏5.0g/L，pH 7.0±0.1)，37℃、160r/min条件下培养16h得到种子液。
[0049] 2.3、分别将各菌种的种子液在无菌条件下共同接种于液体发酵培养基(发酵培养基配方为：可溶性淀粉6.0g/L，麸皮粉6.0g/L，蛋白胨2.0g/L，酵母粉1.5g/L，碳酸钙0.9g/L、
磷酸氢二钾1.0g/L，
硫酸镁0.45g/L、pH 7.0±0.1)中，接种量按体积比均设置为15％，在pH 7.0、罐压0.055MPa、30℃、
通风量1︰0.5vvm的条件下，培养56h。检测活菌数达到18亿cfu/mL时，进行离心、喷雾干燥浓缩，得混合微生物。检测混合微生物的活菌数为175亿cfu/mL。其中，活菌数的检测采用平板计数法。
[0050] (3)将吸附载体和混合微生物按重量份组分80︰20混合，并采用
搅拌机混匀，即制得微生物菌剂。
[0051] 实施例2
[0052] 一种本发明的微生物菌剂，采用以下制备方法制备得到：
[0053] 将所述步骤(1)中涉及的葡聚糖替换为可溶性淀粉，其他步骤同实施例1。
[0054] 实施例3
[0055] 一种本发明的微生物菌剂，采用以下制备方法制备得到：
[0056] 将所述步骤(1)中涉及的葡聚糖替换为葡萄糖，其他步骤同实施例1。
[0057] 实施例4
[0058] 一种本发明的微生物菌剂，采用以下制备方法制备得到：
[0059] 将所述步骤(1)中涉及的葡聚糖替换为
纤维素，其他步骤同实施例1。
[0060] 实施例5
[0061] 一种本发明的微生物菌剂，采用以下制备方法制备得到：
[0062] (1)吸附载体的制备：
[0063] 1.1、将葡聚糖400g溶于1000ml水中，搅拌至溶液透明。伊利石粉、葡聚糖二者粒径为100目。
[0064] 1.2、在葡聚糖溶液中添加伊利石粉80g，使葡聚糖和伊利石粉的质量比为5︰1。充分浸润后搅拌20min得到混悬液。
[0065] 1.3、在上述混悬液中添加3000ml质量分数为70％的乙醇溶液，得到混合凝聚物。将混合凝聚物用去离子洗涤3次，过滤、烘干，得到吸附载体。
[0066] (2)混合微生物的制备：
[0067] 2.1、将胶冻样芽孢杆菌、欧文氏菌、敏捷食酸菌的原始菌种分别在无菌条件下接种于斜面培养基(斜面培养基配方为：牛肉粉3.0g/L，蛋白胨5.0g/L，氯化钠5.0g/L，琼脂粉18.0g/L，pH 7.0±0.1)上，37℃条件下培养20h。
[0068] 2.2、将斜面培养基上的菌种在无菌条件下分别接种于种子培养基中(种子培养基配方为：蔗糖10.0g/L，蛋白胨10.0g/L，酵母膏5.0g/L，pH 7.0±0.1)，37℃、160r/min条件下培养16h得到种子液。
[0069] 2.3、分别将各菌种的种子液在无菌条件下共同接种于液体发酵培养基(发酵培养基配方为：可溶性淀粉6.0g/L，麸皮粉6.0g/L，蛋白胨2.0g/L，酵母粉1.5g/L，碳酸钙0.9g/L、磷酸氢二钾1.0g/L，硫酸镁0.45g/L、pH 7.0±0.1)中，接种量按体积比均设置为12％，在pH 7.0、罐压0.055MPa、30℃、通风量1︰0.5vvm的条件下，培养56h。检测活菌数达到12亿cfu/mL时，进行离心、喷雾干燥浓缩，得混合微生物。检测混合微生物的活菌数为125亿cfu/mL。其中，活菌数的检测采用平板计数法。
[0070] (3)将吸附载体和混合微生物按重量份组分75︰25混合，并采用搅拌机混匀，即制得微生物菌剂。
[0071] 实施例6
[0072] 一种本发明的微生物菌剂，采用以下制备方法制备得到：
[0073] (1)吸附载体的制备：
[0074] 1.1、将葡聚糖溶于400g溶于1000ml水中，搅拌至溶液透明。伊利石粉、葡聚糖二者粒径为90目。
[0075] 1.2、在葡聚糖溶液中添加伊利石粉40g，使纤维素和伊利石粉的质量比为10︰1。充分浸润后搅拌40min得到混悬液。
[0076] 1.3、在上述混悬液中添加3000ml质量分数为90％的乙醇溶液，得到混合凝聚物。将混合凝聚物用去离子洗涤3次，过滤、烘干，得到吸附载体。
[0077] (2)混合微生物的制备：
[0078] 2.1、将胶冻样芽孢杆菌、欧文氏菌、敏捷食酸菌的原始菌种分别在无菌条件下接种于斜面培养基(斜面培养基配方为：牛肉粉3.0g/L，蛋白胨5.0g/L，氯化钠5.0g/L，琼脂粉18.0g/L，pH 7.0±0.1)上，37℃条件下培养20h。
[0079] 2.2、将斜面培养基上的菌种在无菌条件下分别接种于种子培养基中(种子培养基配方为：蔗糖10.0g/L，蛋白胨10.0g/L，酵母膏5.0g/L，pH 7.0±0.1)，37℃、160r/min条件下培养16h得到种子液。
[0080] 2.3、分别将各菌种的种子液在无菌条件下共同接种于液体发酵培养基(发酵培养基配方为：可溶性淀粉6.0g/L，麸皮粉6.0g/L，蛋白胨2.0g/L，酵母粉1.5g/L，碳酸钙0.9g/L、磷酸氢二钾1.0g/L，硫酸镁0.45g/L、pH 7.0±0.1)中，接种量按体积比均设置为20％，在pH 7.0、罐压0.055MPa、30℃、通风量1︰0.5vvm的条件下，培养56h。检测活菌数达到20亿cfu/mL时，进行离心、喷雾干燥浓缩，得混合微生物。检测混合微生物的活菌数为155亿cfu/mL。其中，活菌数的检测采用平板计数法。
[0081] (3)将吸附载体和混合微生物按重量份组分70︰30混合，并采用搅拌机混匀，即制得微生物菌剂。
[0082] 试验例1
[0083] 本试验例进一步提供了一种本发明降低辣椒中重金属含量的微生物菌剂的田间应用效果实验，主要为镉污染土壤。
[0084] 一、试验地点
[0085] 湖南省浏阳市
[0086] 二、试验时间
[0087] 4月至8月
[0088] 三、试验设计
[0089] 选取大小相近的6
块辣椒试验田，且水系互不影响，各试验组设置如下：
[0090] (1)对照组1：无污染辣椒试验田，无处理措施。
[0091] (2)对照组2：污染辣椒试验田，无处理措施。
[0092] (3)实验组1：污染辣椒试验田，于辣椒移栽前10～15天施用本发明微生物菌剂，喷施量为20kg/亩。
[0093] (4)实验组2：污染辣椒试验田，于辣椒移栽前10～15天施用本发明微生物菌剂，喷施量为25kg/亩。
[0094] (5)实验组3：污染辣椒试验田，于辣椒移栽前10～15天施用本发明微生物菌剂，喷施量为28kg/亩。
[0095] (6)实验组4：污染辣椒试验田，于辣椒移栽前10～15天施用本发明微生物菌剂，喷施量为30kg/亩。
[0096] 具体操作时，各试验组
播种或移栽、
施肥、浇水、除草、
病虫害防治均在1天内完成，将人为误差降低到最小程度；施肥按当地施肥水平和施肥方法进行，根据天气和土壤水分情况，开设沟渠，做好防涝抗旱准备。该微生物菌剂采用人工施入，辣椒
收获后，测定辣椒产量、土壤有效镉含量、辣椒果实镉含量。
[0097] 供试土壤主要农化特性见表1。
[0098] 表1：土壤的理化性状
[0099]项目 有机质(g/kg) 全氮(g/kg) 全钾(g/kg) 全磷(g/kg)
土壤 17.83 1.41 14.50 0.68
项目
碱解氮 速效钾 全镉(mg/kg) pH
土壤 (1m4g0/.k5g9) (1m0g8/.k9g9) 2.56 6.52
[0100] 四、试验结果
[0101] 下表2为根据实施例1、2、3、4所述的方法制备所得的微生物菌剂，应用试验例1中对照组1、2及实验组3的方法对土壤及辣椒的改良效果。
[0102] 表2：实施例1、2、3、4的微生物菌剂的改良效果
[0103]
[0104] 4由表2结果可知，本发明提供的微生物菌剂能够有效地降低土壤中镉的生物有效性，收获前后土壤中有效镉含量有明显的下降，且辣椒果实中的镉含量，相比于对照组2，含量减小，同时辣椒的亩产量得到有效提高。实施例1至实施例4分别采用不同的可溶性糖，可溶性淀粉、葡萄糖、纤维素、葡聚糖均能产生较好的实验效果，其中葡聚糖的效果最佳。同时，伊利石粉负载可溶性糖的制备过程中，可溶性糖为葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、可溶性淀粉、纤维素、葡聚糖、甘露醇中的一种或几种，均能产生与实施例1至4相似的实验效果。
[0105] 下表3为根据实施例1、5、6所述的方法制备所得的微生物菌剂，应用试验例1中的方法对土壤及辣椒的改良效果。
[0106] 表3：实施例1、5、6的微生物菌剂的改良效果
[0107]
[0108] 由表3结果可知，本发明提供的微生物菌剂能够有效地降低土壤中镉的生物有效性，收获前后土壤中有效镉含量有明显的下降，且辣椒果实中的镉含量，相比于对照组2，含量减小，同时辣椒的亩产量得到有效提高。葡聚糖与伊利石粉的质量比以5～10：1为宜，优选地，二者质量比为8：1；搅拌时间20～40min为宜，优选地，搅拌时间为30min；乙醇溶液的质量分数为70％～90％为宜，优选地，质量分数为80％；每亩农田中添加20～30kg该微生物菌剂为宜；优选地，每亩农田中添加28kg该伊利石粉微生物菌剂。
[0109] 由表2和表3所示的实验结果可知，本发明提供的微生物菌剂能够有效地降低土壤中镉的生物有效性，收获前后土壤中有效镉含量有明显的下降，且辣椒果实中的镉含量，相比于对照组2，含量减小，同时辣椒的亩产量得到有效提高。
[0110] 虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明
基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
