技术领域
[0001] 本
发明涉及
植物抗逆生理学，具体涉及半野生棉萌发期对钠盐抗性鉴定方法。
背景技术
[0002] 半野生棉(semi-wild cotton)是陆地棉野生种系，共7个：阔叶棉(latifolium)、帕默尔棉(palmeri)、玛利加郎特棉(marie-galante)、雷奇蒙地棉(richmondi)、尤卡坦棉(yucatanese)、莫利尔棉(morrilli)和尖斑棉(punctatum)。半野生棉原产地主要在墨西哥，少量在巴西，其种类划分依据主要是自然分布的地理
位置和形态主体特征，每个种系又包含多个变异类型。半野生棉是陆地棉的原始类型，未经人工驯化过，由于其特殊的地理位置和多变的
气候条件，相较于经过人工和自然双重选择压
力的栽培品种，半野生棉具有丰富的遗传多样性，含有多种优良基因，包括抗病虫、耐干旱、耐盐
碱、
纤维高强等，同时因为陆地棉野生种系与栽培品种在遗传上具有
亲和性，容易杂交成功，因此具有极其重要的潜在应用价值。
[0003] 现如今关于棉花抗盐性的研究大多集中栽培棉(cultivated cotton)的抗盐性的研究上，然而我国并不是棉花的起源地，对我国陆地棉栽培种的遗传多样性分析发现育种资源多来自岱字棉等少数几个陆地棉种质资源材料，从而导致很难拥有遗传多样性丰富的群体来进行抗盐性筛选。同时现在栽培棉NaCl萌发期抗性的研究上大田中多采用0.5％NaCl溶液、0.4％地下咸
水溶液或者直接用
海水进行胁迫，实验室中的栽培棉鉴定时150mM NaCl为适宜
盐胁迫浓度、200mM NaCl为极限浓度，存在有胁迫浓度低、胁迫成分不确切等，不足以鉴定具有抗性多样性的半野生棉材料，而且进行盐池鉴定则存在盐分分布不均匀、受环境影响大、鉴定周期长(45天左右)等缺点，造成实验结果重复性差。因此，探索一种适合半野生棉萌发期抗盐性的方法以迅速准确的筛选出高抗盐的半野生棉材料，可以加快栽培棉的抗盐性遗传改良，具有实践利用价值和意义。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供半野生棉萌发期钠盐抗性鉴定方法，用来弥补针对半野生棉材料抗盐性鉴定时方法的不足，以期能够快速准确的对棉花半野生种质资源的进行客观鉴定，为棉花抗盐性遗传改良提供依据。
[0005] 根据本发明的半野生棉萌发期钠盐抗性鉴定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
[0006] 1)对半野生棉
种子进行均一化处理：首先是对
选定的半野生棉材料进行浓
硫酸脱绒，清水冲洗干净之后，
次氯酸钠消毒，然后置40烘箱中加热干燥24h以打破种子休眠，在种子珠孔端切剥一小口，露出种仁即可。由于半野生棉材料的收集与保藏不易，针对不同年份的半野生棉材料，采用此种方法处理之后的半野生棉材料种子可以保持在萌发前的状态是一致的，避免了因为某些材料自身特异性对萌发状态造成的影响，实验中出现过此类情况如尖斑棉6，在未进行切剥处理时，发芽率几乎为零，处理后发芽率达到了90％以上；
[0007] 2)制备盐胁迫基质：采用粒径为0.05-0.80mm的沙子，清水洗净后高温灭菌，以100g沙子：16ml盐液的比例加入盐浓度250mM的NaCl溶液，混匀后做为发芽基质。这样可以固定沙床
含水量为恒定16％。此种方法选用的为250mM NaCl浓度，高于栽培棉鉴定盐浓度，是专
门针对半野生棉的抗性多样性进行的设计，可以准确鉴定出高抗盐性的半野生棉材料，在之前的实验中发现用200mM的盐作为胁迫浓度，半野生棉材料会出现多个材料盐害率极低且极为接近的现象；
[0008] 3)
播种并培育棉苗：采用12cm*19cm*13cm发芽盒，把步骤2)基质放入发芽盒中，把种子均匀放入发芽盒中后，再覆上一层基质即可，置于
温度28℃，湿度85％，光照12h，黑暗12h的条件下，发芽并培养14d。此种方法可以保持每个材料在发芽盒中的状态的一致性，杜绝了因为外界环境变化所引起的鉴定错误的发生；
[0009] 4)统计与结果分析：待生长至14d时，统计发芽数，调查每一株棉苗的盐害情况，并评价每株棉苗的盐害指数，评价半野生棉材料的抗性水平。
[0010] 本发明为半野生棉萌发期抗盐性鉴定方法，具有以下优点：
[0011] 1、半野生棉材料萌发状态一致：通过均一化处理之后的半野生材料可以达到初始萌发状态的一致性，有利于棉花出苗整齐一致，而且材料和沙子经过前期灭菌处理，避免了细菌的干扰，实验中对照材料出苗均匀一致，根系发育完整，萌发期一致，保证了鉴定的准确性。
[0012] 2、专门为半野生棉材料选定的适合半野生棉抗性多态性的盐浓度250mM，相较于大田栽培种鉴定用0.4％的盐分和
温室栽培种鉴定200mM NaCl高了很多，适合具有抗性多样性的半野生棉材料鉴定。
[0013] 3、该方法不受季节控制，鉴定周期短，可短时间鉴定半野生棉材料的抗盐性。半野生棉萌发期抗盐性鉴定方法，鉴定周期为14d，播种后第14d统计发芽率，统计每株棉苗的生长状况进行评分。较大田盐池鉴定(45d左右)缩短30d，可快速进行半野生棉材料萌发期抗盐性筛选，为
加速抗逆育种提供技术支持。
[0014] 4、投入的人力物力小，省工又经济。半野生棉萌发期抗盐性鉴定方法，可以在温室之内进行鉴定，使用商品
河沙、分析纯
试剂和种子发芽盒，而且都是经过高温消毒，省去大量的人力和物力的投入，可进行大批量材料的鉴定；易于推广和利用。
具体实施方式
[0015]
实施例1采用萌发期单盐NaCl胁迫处理，对半野生棉(阔叶棉40、阔叶棉27、尖斑棉25、阔叶棉32、阔叶棉120、玛丽加朗特棉85)以及栽培棉(中棉所12、中棉所16、鄂荆1号、海
7124)的抗盐水平进行鉴定和评价。
[0016] 1、棉花材料：
[0017] 半野生棉(阔叶棉40、阔叶棉27、尖斑棉25、阔叶棉32、阔叶棉120、玛丽加朗特棉85)，栽培种鄂荆1号，海7124，栽培棉敏盐对照材料中棉所12、栽培棉耐盐对照材料中棉所
16。
[0018] 2、半野生棉种子进行均一化处理：
[0019] 对选定的半野生棉材料进行浓硫酸脱绒，洗净晾干后，再用NaClO消毒处理种子，洗净晾干后，置40℃烘箱24h打破种子休眠，选择籽粒饱满成熟的种子，用单面刀片在种子合点端(钝端)切小口，大小1mm×1mm，种壳切破露出种仁即可。
[0020] 3、制备盐胁迫基质：
[0021] 选择直径为0.05-0.80mm的沙子，清水洗涤至不浑浊，晾干后180℃，2h高温灭菌；称量试验所需的沙子重量，按照
质量比100g沙子：16ml水的比例计算所需水量，按照用水量进行计算所需盐分，进而用无菌水配制250mM的NaCl盐溶液，把配制好的盐溶液加入到称量好的沙子中，混匀后作为盐胁迫培养基质；对照基质按照质量比16％(水/干沙子)加入无菌水，混匀作为对照培养基质；
[0022] 4、播种并培育棉苗：
[0023] 首先在发芽盒下层铺合适厚度的沙子约10-15mm，种子均匀播在湿沙上，加盖10-15mm湿沙，每盒播种6行，每行5粒，每两行一个材料(或重复)，盖上
盖子，置于温度28℃，湿度85％，光照12h，黑暗12h的条件下，培养14d；按同样的方法设置对照组。
[0024] 5、统计与结果分析：
[0025] 播种后14d统计每一个半野生棉材料的出苗率以及针对每一株棉苗进行评分。对每一株棉苗进行客观分级评分是实验的关键。根据出苗率和评分结果对半野生棉抗性进行评价。
[0026] 根据标准进行伤害评分：然后计算材料的相对盐害率。
[0027] 0分-未萌发种子；
[0028] 1分-株高为对照的50％以下，种子刚破土、未破壳；
[0029] 2分-株高为对照的50％～70％，子叶边缘卷曲；
[0030] 3分-株高为对照的70％～100％，子叶卷曲、发黄；
[0031] 4分-株高与对照处理相当，棉苗正常生长，子叶展开。
[0032] 相对盐害率计算公式为：
[0033]
[0034] 得分率＝∑fx/(4n)，f为该级别的株数，x为相应级别的分值，n为播种数。
[0035] 结果见表2:
[0037]级别 相对盐害率(％) 耐盐性
1 0.0～20.0 高耐
2 20.1～40.0 耐
3 40.1～60.0 中耐
4 60.1～80.0 中敏
5 80.1～100.0 敏感
[0038] 表2：半野生棉抗盐性水平评价结果
[0039]
[0040]
