大麦条纹病致病性基因Pgmiox及其应用
阅读：916发布：2020-05-11
专利汇可以提供大麦条纹病致病性基因Pgmiox及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且大麦 条纹病（Barley leaf stripe）是大麦的主要病害之一，在大麦种植区普遍发生，严重影响到大麦的经济和营养价值。本 发明 获得了一种大麦条纹病（麦类核腔菌Pyrenophora graminea）致病性基因Pgmiox，以应对该病害靶标基因的需求，通过RNA干扰技术获得Pgmiox干扰突变体，进一步提供了该基因参与调控菌株生长分化，增强盐、干旱和重金属Cu2+胁迫耐受性，降低细胞壁强度，加强 抑 真菌 剂 （异菌脲和咪鲜胺）敏感性，调控毒性和致病性中的应用。，下面是大麦条纹病致病性基因Pgmiox及其应用专利的具体信息内容。
1.大麦条纹病致病性基因Pgmiox，其特征在于，所述Pgmiox的全长序列如SEQ ID NO：1所示。
2.大麦条纹病致病性基因Pgmiox获取方法，包括：（1）大麦条纹病菌株的培养；（2）Pgmiox基因的克隆；（3）Pgmiox基因序列及生物信息学分析。
3.根据权利要求2所述的大麦条纹病致病性基因Pgmiox获取方法，其特征在于，所述步骤（1）大麦条纹病菌株的培养包括制备PDA培养基：将新鲜马铃薯削皮去芽眼切成0.5-2cm2的小方块，称取重量200g，加1L蒸馏水煮沸20-30min，过滤去残渣，在滤液中加入20g葡萄糖和15-17g琼脂，玻璃棒搅拌混匀，加蒸馏水定容至1L，高压蒸汽灭菌，倒平板；用直径为5-
10mm打孔器，将4℃保存的麦类核腔菌菌株QWC在边缘打取菌饼置于PDA培养基平板上生长
3-7d；所述步骤（2）Pgmiox基因的克隆包括以QWC基因组DNA和cDNA为模板，通过PCR扩增获得Pgmiox基因的DNA和cDNA序列，PCR产物经切胶、胶回收、连接载体pMD19-T Vector：
pMD19-T Vector 1μL、目的片段4μL、Solution Ⅰ 5μL，缓慢混匀，轻离心3-10sec，16℃水浴连接12-16h、转化DH5α感受态细胞、蓝白斑筛选及鉴定后测序；所述步骤（3）Pgmiox基因序列及生物信息学分析包括Pgmiox基因的DNA序列与cDNA序列一致，得出该基因没有内含子，利用网络在线SMART工具对Pgmiox进行蛋白结构域分析，运用网络在线GOR4工具对Pgmiox进行蛋白二级结构预测，用BLAST程序分析蛋白相似性，利用MEGA6.0软件进行多序列比对，以邻近相接法构建系统进化树。
4.权利要求1所述的大麦条纹病致病性基因Pgmiox在调控菌株生长分化中的应用，其特征在于，所述Pgmiox的全长序列如SEQ ID NO：1所示。
5.权利要求1所述的大麦条纹病致病性基因Pgmiox在增强盐、干旱和重金属Cu2+胁迫耐受性中的应用，其特征在于，所述Pgmiox的全长序列如SEQ ID NO：1所示。
6.权利要求1所述的大麦条纹病致病性基因Pgmiox在降低细胞壁强度，加强抑真菌剂敏感性，调控毒性和致病性中的应用，其特征在于，所述Pgmiox的全长序列如SEQ ID NO：1所示。
7.根据权利要求4、5和6中任何一项所述的Pgmiox基因的应用，其特征在于，所述应用的验证方法包括如下步骤：步骤（1）干扰载体pSilent-1miox的构建包括以菌株QWC的DNA为模板，使用引物miox1-F1/miox1-R1和miox2-F1/miox2-R1分别扩增获得片段miox1和miox2，用XhoⅠ和HindⅢ双酶切片段miox1和载体pSilent-1，用T4连接酶将片段miox1连接到载体pSilent-1的XhoI-HindⅢ位点，然后将片段miox2和pSilent-1miox1用ApaⅠ和StuⅠ双酶切，用T4连接酶将片段miox2连接到载体pSilent-1miox1的ApaⅠ-StuⅠ位点，得到Pgmiox基因的干扰载体pSilent-1miox；
（2）遗传转化与筛选包括用酶解液制备出QWC菌株的原生质体，通过PEG4000介导转化，获得转化子54株，用潮霉素B特异性引物HYG-1/HYG-2进行PCR鉴定筛选，随机选择6株能扩增出1026bp条带的菌株进行荧光定量PCR分析干扰率分别为：90.36%、89.87%、88.47%、
90.56%、90.75%和88.03%；
（3）突变菌株生长分化的鉴定包括将6个干扰菌株分别接种以下5种培养基中：基本培养基：NaNO3 6g、KCl 0.52g、MgSO4 0.152g、KH2PO4 1.52g、VB1 0.01g、微量元素1mL、葡萄糖
10g、琼脂15-17g，蒸馏水定容到1L；完全培养基：NaNO3 1.8g、葡萄糖10g、蛋白胨2g、酵母
1g、微量元素1mL，15-17g的琼脂，蒸馏水定容到1L；V8培养基：V8果汁100mL、CaCO3 0.2g、琼脂15-17g，蒸馏水定容到1L；大麦培养基：称取大麦50g置于1L蒸馏水中煮沸1小时，纱布过滤残渣，琼脂15-17g，蒸馏水定容到1L；PDA培养基：新鲜马铃薯200g，加1L蒸馏水煮沸，过滤去残渣，加20g葡萄糖，15-17g琼脂，混匀，加蒸馏水定容至1L，以野生菌株QWC为对照，每个菌株设置3次重复；
（4）突变菌株不同环境胁迫耐受性、细胞壁完整性和抑真菌剂敏感性的鉴定包括将6个干扰菌株和QWC菌株分别接种在添加15% PEG、0.01mol/L H2O2、0.8mol/L NaCl、1mol/L山梨醇、0.5mmol/L CuSO4·5H2O、0.2mg/mL刚果红、0.02% SDS、0.2mg/mL CFW、0.75μg/mL异菌脲、1.0μg/mL戊唑醇、5μg/mL苯并咪唑和1μg/mL咪鲜胺不同处理的PDA培养基上，以PDA培养基为对照，每个菌株设置3次重复；
（5）突变菌株毒性和致病性的鉴定包括将6个干扰菌株和QWC菌株接种到毒素诱导培养基中，25-30℃黑暗培养18-25d后，过滤，得到粗毒素液体，取20μl注射接种到离体大麦叶片中脉的一侧上，以毒素诱导培养基溶液作为空白对照，置于25℃，光照时间为12h（昼）/12h（夜）的环境下培养，2-3d后观察发病状况，将含菌丝的琼脂块种到离体大麦叶片上，将接种的大麦叶片置于温度为25℃，光照时间为12h（昼）/12h（夜）的环境下培养，2-3d后观察叶片的病斑发生状况，采用“夹心法”将大麦种子用QWC和干扰菌株置于6℃感染20d，盆栽播种
20d后计算观察发病率及发病状况。
大麦条纹病致病性基因Pgmiox及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体涉及大麦条纹病菌致病性基因Pgmiox的生物信息学分析及其调控菌丝生长速率；增强盐胁迫（0.8mol/L NaCl）、干旱胁迫（15% PEG）、和重金属胁迫（0.05mmol/L CuSO4·5H2O）耐受性；降低细胞壁强度；加强抑真菌剂（异菌脲和咪鲜胺）敏感性，该基因还有可能为抑真菌剂（戊唑醇和苯并咪唑）的靶位点；以及沉默该基因降低大麦条纹病（麦类核腔菌）的毒性和致病性的应用。
背景技术
[0002] 大麦条纹病（Barley leaf stripe）是大麦的主要病害之一，在大麦种植区普遍发生。近年来，由于耕作制度的变化以及多年的连茬种植，该病害发生日趋严重，研究该病病原菌的致病机制就显得尤为重要。现已得知，该病是由种子带菌引起的系统侵染性真菌病害，其病原菌的无性阶段Drechslera graminea ( Rabenh & Schlecht) Schoemaker为禾内脐蠕孢，半知菌亚门、内脐蠕孢属，有性阶段Pyrenophora graminea为麦类核腔菌，子囊菌亚门、核腔菌属。
[0003] R.W.Medd等通过大量研究发现，大麦条纹病菌侵染植株的发病情况与是否产生植物毒素有关。A.HAEGI等研究该病原菌毒素成分得出，其中一类葡萄糖醛酸（D-Glucuronate）物质被抑制时，毒素危害能力明显降低。实验室前期分离甘肃大麦产区不同地区的条纹病病原菌，鉴定其致病力，筛选得到强致病力菌株QWC，并运用Illumina Hiseq 2000平台对其进行全基因组测序。经KEGG和PHI基因功能注释得到与葡萄糖醛酸相关的两条通路，分别是抗坏血酸醛酸代谢途径（ascorbate and aldarate metabolism）和戊糖葡糖醛酸转化途径（pentose and glucuronate interconversions），并在此化合物上游分别注释出一个基因。
[0004] 本研究运用RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术研究抗坏血酸醛酸代谢途径上注释的基因Pgmiox，构建Pgmiox的干扰载体，通过PEG介导方法转化QWC菌株，并对干扰突变菌株和野生菌株的生长分化、不同环境胁迫耐受性、细胞壁完整性、抑真菌剂敏感性、毒性和致病性等方面进行分析，明确Pgmiox在大麦条纹病菌中致病性的功能机制，以期为大麦条纹病菌的致病机理和调控机理奠定基础，同时也为设计新型杀真菌剂筛选候选靶标基因。
[0005] 现有技术存在的问题：现有技术中未见大麦条纹病（麦类核腔菌）Pgmiox基因及RNA干扰该基因应用的报道。
[0006] 鉴于现有技术的不足，本发明提供了一种大麦条纹病（麦类核腔菌）致病性基因Pgmiox，以应对该病害靶标基因的需求，运用RNA干扰技术获得Pgmiox干扰突变体，进一步提供了该基因在生长分化、不同环境胁迫耐受性、细胞壁完整性、抑真菌剂敏感性、毒性和致病性等方面的应用。
[0007] 为了达到上述目的，本发明采用了如下的技术方案：一种大麦条纹病（麦类核腔菌）致病性基因Pgmiox，该基因全长序列如SEQ ID NO：1所示，具体步骤如下：
1、大麦条纹病菌株的培养
制备PDA培养基：将新鲜马铃薯削皮去芽眼切成0.5-2cm2的小方块，称取重量200g，加
1L蒸馏水煮沸20-30min，过滤去残渣，在滤液中加入20g葡萄糖和15-17g琼脂，玻璃棒搅拌混匀，加蒸馏水定容至1L，高压蒸汽灭菌，倒平板；用直径为5-10mm打孔器，将4℃保存的麦类核腔菌菌株QWC在边缘打取菌饼置于PDA培养基平板上生长3-7d。
1、大麦条纹病菌株的培养
制备PDA培养基：将新鲜马铃薯削皮去芽眼切成0.5-2cm2的小方块，称取重量200g，加
1L蒸馏水煮沸20-30min，过滤去残渣，在滤液中加入20g葡萄糖和15-17g琼脂，玻璃棒搅拌混匀，加蒸馏水定容至1L，高压蒸汽灭菌，倒平板；用直径为5-10mm打孔器，将4℃保存的麦类核腔菌菌株QWC在边缘打取菌饼置于PDA培养基平板上生长3-7d。
[0008] 2、Pgmiox基因的克隆以QWC基因组DNA和cDNA为模板，使用引物miox-F1/ miox-R1（附图1）通过PCR扩增获得Pgmiox基因的DNA和cDNA序列，PCR产物经切胶、胶回收、连接载体pMD19-T Vector：pMD19-T Vector（Simple） 1μL、目的片段 4μL、SolutionⅠ 5μL，缓慢混匀，轻离心3-10sec，16℃水浴连接12-16h、转化DH5α感受态细胞：制备含有100μg/mL氨苄青霉素（Amp）的LBA固体培养基平板，将80μL X-gal和20μL IPTG混匀后均匀地涂布在每个平板上，晾干备用；取出-80℃保存的DH5α感受态细胞，冰上溶解，每50μL感受态细胞加入5μL过夜连接液，轻弹混匀，冰浴
30min，42℃热激90s，迅速冰浴3min，期间操作需平稳；每1.5mL离心管加入400μL LB液体培养基，37℃ 200rpm振荡培养1-2h；取200μL菌液均匀地涂布在平板上，封口膜密封，倒置于
37℃培养箱中黑暗培养12-16h、蓝白斑筛选及鉴定后测序。
30min，42℃热激90s，迅速冰浴3min，期间操作需平稳；每1.5mL离心管加入400μL LB液体培养基，37℃ 200rpm振荡培养1-2h；取200μL菌液均匀地涂布在平板上，封口膜密封，倒置于
37℃培养箱中黑暗培养12-16h、蓝白斑筛选及鉴定后测序。
[0009] 3、Pgmiox基因序列及生物信息学分析测序结果表明Pgmiox基因的ORF框全长981bp，且DNA序列与cDNA序列一致，得出该基因没有内含子（附图2A）。利用网络在线SMART工具（http://smart.embl-heidelberg.de/）对Pgmiox进行蛋白结构域分析，该基因有一个Pfam域miox结构域（Myo-inositol oxygenase；
78AA 326AA）（附图2B）。运用网络在线GOR4工具（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin ... ~
page=npsa_gor4.html）对Pgmiox进行蛋白二级结构预测，该基因编码326个氨基酸，其二级结构以α-螺旋（Alpha helix，Hh）为主（46.93%），其次为无规卷曲（Random coil，Cc）占
37.73%，最后为延伸链（Extended strand，Ee）占15.34%，（附图2C）。根据BLAST程序将麦类核菌（P.graminea）Pgmiox基因的326个氨基酸序列与Pyrenophora tritici-repentis、Alternaria alternate、Periconia macrospinosa、Aureobasidium namibiae和Aspergillus fumigatus中miox基因比对，得出相似性分别为99%、94%、79%、81%和73%。利用MEGA6.0软件进行多序列比对，以邻近相接法（Neighbor-jointing，NJ）构建系统进化树，得出麦类核菌（P.graminea）和小麦褐斑长蠕孢霉菌（Pyrenophora tritici-repentis）的miox基因蛋白序列组合在一起（附图2D）。
78AA 326AA）（附图2B）。运用网络在线GOR4工具（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin ... ~
page=npsa_gor4.html）对Pgmiox进行蛋白二级结构预测，该基因编码326个氨基酸，其二级结构以α-螺旋（Alpha helix，Hh）为主（46.93%），其次为无规卷曲（Random coil，Cc）占
37.73%，最后为延伸链（Extended strand，Ee）占15.34%，（附图2C）。根据BLAST程序将麦类核菌（P.graminea）Pgmiox基因的326个氨基酸序列与Pyrenophora tritici-repentis、Alternaria alternate、Periconia macrospinosa、Aureobasidium namibiae和Aspergillus fumigatus中miox基因比对，得出相似性分别为99%、94%、79%、81%和73%。利用MEGA6.0软件进行多序列比对，以邻近相接法（Neighbor-jointing，NJ）构建系统进化树，得出麦类核菌（P.graminea）和小麦褐斑长蠕孢霉菌（Pyrenophora tritici-repentis）的miox基因蛋白序列组合在一起（附图2D）。
[0010] Pgmiox基因在生长分化、不同环境胁迫耐受性、细胞壁完整性、抑真菌剂敏感性、毒性和致病性等方面的应用，包括如下步骤：1、干扰载体pSilent-1miox的构建
以菌株QWC的DNA为模板，使用引物miox1-F1/miox1-R1和miox2-F1/miox2-R1（附图1）分别扩增获得片段miox1（334bp）和miox2（334bp）。用XhoⅠ和HindⅢ双酶切片段miox1和载体pSilent-1，用T4连接酶将片段miox1连接到载体pSilent-1的XhoI-HindⅢ位点。然后将片段miox2和pSilent-1miox1用ApaⅠ和StuⅠ双酶切，用T4连接酶将片段miox2连接到载体pSilent-1miox1的ApaⅠ-StuⅠ位点，得到Pgmiox基因的干扰载体pSilent-1miox（附图3）。
以菌株QWC的DNA为模板，使用引物miox1-F1/miox1-R1和miox2-F1/miox2-R1（附图1）分别扩增获得片段miox1（334bp）和miox2（334bp）。用XhoⅠ和HindⅢ双酶切片段miox1和载体pSilent-1，用T4连接酶将片段miox1连接到载体pSilent-1的XhoI-HindⅢ位点。然后将片段miox2和pSilent-1miox1用ApaⅠ和StuⅠ双酶切，用T4连接酶将片段miox2连接到载体pSilent-1miox1的ApaⅠ-StuⅠ位点，得到Pgmiox基因的干扰载体pSilent-1miox（附图3）。
[0011] 2、遗传转化与筛选将QWC菌株置于酶解液（1%溶壁酶（Lywallzyme）+0.5%蜗牛酶（Snailase），以0.7mol/L NaCl稳渗剂配制）30℃温育4-6h，过滤未酶解菌丝，制备出原生质体，置于STC缓冲液（0.7mol/L蔗糖，50mmol/L CaCl2，10mmol/L Tris-HCl（pH=7.5））中保存。通过PEG4000介导进行转化：取100-200μL STC重悬沉淀与5-10μg pSilent-1miox的质粒DNA混合，冰浴
20min，加入100μL PTC（60% PEG4000，溶解在STC缓冲液中）混匀，冰浴20min，再逐滴加入
800μL PTC，室温静置15min，将原生质体转化混合物（500μL/板）用玻璃涂布器轻轻涂布在
15-20mL再生培养基（rPDA，含有0.7mol/L蔗糖的PDA）平板上，倒置于25℃培养箱中静置培养。观察平板表面形成可见菌落后，加盖10-15mL含有70-90μg/mL潮霉素B的PDA培养基，25℃培养至长出单菌落。将这些菌落直接转移到含有90-100μg/mL潮霉素B的PDA培养基平板中。连续培养3代，获得能稳定生长的转化子54株，用潮霉素B特异性引物HYG-1/HYG-2（附图
1）进行PCR鉴定筛选（附图4），随机选择6株能扩增出1026bp条带的菌株（△miox32、△miox33、△miox35、△miox43、△miox44和△miox54）进行荧光定量PCR分析得出干扰率分别为：90.36%、89.87%、88.47%、90.56%、90.75%和88.03%，所需引物如附图1所示。
20min，加入100μL PTC（60% PEG4000，溶解在STC缓冲液中）混匀，冰浴20min，再逐滴加入
800μL PTC，室温静置15min，将原生质体转化混合物（500μL/板）用玻璃涂布器轻轻涂布在
15-20mL再生培养基（rPDA，含有0.7mol/L蔗糖的PDA）平板上，倒置于25℃培养箱中静置培养。观察平板表面形成可见菌落后，加盖10-15mL含有70-90μg/mL潮霉素B的PDA培养基，25℃培养至长出单菌落。将这些菌落直接转移到含有90-100μg/mL潮霉素B的PDA培养基平板中。连续培养3代，获得能稳定生长的转化子54株，用潮霉素B特异性引物HYG-1/HYG-2（附图
1）进行PCR鉴定筛选（附图4），随机选择6株能扩增出1026bp条带的菌株（△miox32、△miox33、△miox35、△miox43、△miox44和△miox54）进行荧光定量PCR分析得出干扰率分别为：90.36%、89.87%、88.47%、90.56%、90.75%和88.03%，所需引物如附图1所示。
[0012] 3、突变菌株生长分化的鉴定将6个干扰菌株分别接种以下5种培养基中：基本培养基（MM）：NaNO3 6g、KCl 0.52g、MgSO4 0.152g、KH2PO4 1.52g、VB1 0.01g、微量元素1mL（母液：H3BO3 0.570g、MnCl2·4H2O
0.360g、ZnSO4·7H2O 0.045g、CuSO4·5H2O 0.016g、(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.087g，蒸馏水定容到1L）、葡萄糖10g、琼脂15-17g，蒸馏水定容到1L；完全培养基（CM）：NaNO3 1.8g、葡萄糖
10g、蛋白胨2g、酵母1g、微量元素1mL，15-17g的琼脂，蒸馏水定容到1L；V8培养基（V8）：V8果汁100mL、CaCO3 0.2g、琼脂15-17g，蒸馏水定容到1L；大麦培养基（BM）：称取大麦50g置于1L蒸馏水中煮沸1小时，纱布过滤残渣，琼脂15-17g，蒸馏水定容到1L；PDA培养基（PDA）：新鲜马铃薯200g，加1L蒸馏水煮沸，过滤去残渣，加20g葡萄糖，15-17g琼脂，混匀，加蒸馏水定容至1L。以野生菌株QWC为对照，25℃黑暗培养，按照十字交叉法每天测量菌落直径，每个菌株重复3皿（附图5）。如附图6所示，菌株均呈现缓慢增长的趋势。CM、V8、BM和PDA培养基中，6个RNA干扰株较对照QWC菌株的增长速度差异较大，MM培养基中，菌株生长速率趋于一致，但6个干扰菌株速率均低于对照QWC，Pgmiox基因的干扰突变显著影响了麦类核菌的生长。在CM、MM、V8、BM和PDA培养基上生长速度分别为：QWC：1.05，0.80，0.93，1.06，1.11cm/d；△miox32：0.80，0.71，0.68，0.93，0.79cm/d；△miox33：0.76，0.76，0.76，0.91，0.75cm/d；△miox35：0.72，0.76，0.76，0.93，0.75cm/d；△miox43：0.74，0.76，0.74，0.80，0.78cm/d；△miox44：0.60，0.73，0.55，0.68，0.77cm/d和△miox54：0.82，0.75，0.76，0.96，0.81cm/d，以上结果表明Pgmiox参与了调节麦类核腔菌的生长发育。
0.360g、ZnSO4·7H2O 0.045g、CuSO4·5H2O 0.016g、(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.087g，蒸馏水定容到1L）、葡萄糖10g、琼脂15-17g，蒸馏水定容到1L；完全培养基（CM）：NaNO3 1.8g、葡萄糖
10g、蛋白胨2g、酵母1g、微量元素1mL，15-17g的琼脂，蒸馏水定容到1L；V8培养基（V8）：V8果汁100mL、CaCO3 0.2g、琼脂15-17g，蒸馏水定容到1L；大麦培养基（BM）：称取大麦50g置于1L蒸馏水中煮沸1小时，纱布过滤残渣，琼脂15-17g，蒸馏水定容到1L；PDA培养基（PDA）：新鲜马铃薯200g，加1L蒸馏水煮沸，过滤去残渣，加20g葡萄糖，15-17g琼脂，混匀，加蒸馏水定容至1L。以野生菌株QWC为对照，25℃黑暗培养，按照十字交叉法每天测量菌落直径，每个菌株重复3皿（附图5）。如附图6所示，菌株均呈现缓慢增长的趋势。CM、V8、BM和PDA培养基中，6个RNA干扰株较对照QWC菌株的增长速度差异较大，MM培养基中，菌株生长速率趋于一致，但6个干扰菌株速率均低于对照QWC，Pgmiox基因的干扰突变显著影响了麦类核菌的生长。在CM、MM、V8、BM和PDA培养基上生长速度分别为：QWC：1.05，0.80，0.93，1.06，1.11cm/d；△miox32：0.80，0.71，0.68，0.93，0.79cm/d；△miox33：0.76，0.76，0.76，0.91，0.75cm/d；△miox35：0.72，0.76，0.76，0.93，0.75cm/d；△miox43：0.74，0.76，0.74，0.80，0.78cm/d；△miox44：0.60，0.73，0.55，0.68，0.77cm/d和△miox54：0.82，0.75，0.76，0.96，0.81cm/d，以上结果表明Pgmiox参与了调节麦类核腔菌的生长发育。
[0013] 4、突变菌株不同环境胁迫耐受性、细胞壁完整性和抑真菌剂敏感性的鉴定将6个干扰菌株和QWC菌株分别接种在添加15% PEG、0.01mol/L H2O2、0.8mol/L NaCl、1mol/L山梨醇、0.5mmol/L CuSO4·5H2O、0.2mg/mL刚果红、0.02% SDS、0.2mg/mL CFW、0.75μg/mL异菌脲、1.0μg/mL戊唑醇、5μg/mL苯并咪唑和1μg/mL咪鲜胺不同处理的PDA培养基上，以PDA培养基为对照，25℃黑暗培养7d后，按照十字交叉法测量菌落直径，计算菌落生长速率V=T/P×100%,（T是在处理培养基上,野生株QWC和干扰株菌落的直径，P是在对照PDA培养基上菌落生长的直径），每个菌株处理重3皿（附图7）。如附图8A所示，在H2O2胁迫下，干扰株与QWC生长速率无显著差异。山梨醇胁迫下，野生株QWC和干扰株△miox32、△miox33、△miox35、△miox43、△miox44和△miox54的径向生长速度分别是1.06，0.90，0.89，0.87，
0.88，0.80和0.88 cm/d。6个干扰株生长速率显著高于对照QWC，且均大于在PDA培养基的生长速率。如附图8B所示，在NaCl胁迫下，6个干扰菌株的生长速率显著低于野生菌株，QWC和它们的径向生长速度分别是0.58，0.40，0.42，0.42，0.42，0.35和0.43cm/d。PEG胁迫下，菌株的生长速率均大于PDA培养基的速率，6个干扰株较QWC差异显著。重金属CuSO4·5H2O胁迫下，干扰株的生长速率显著低于对照菌株，QWC和6个干扰株的径向生长速度分别是0.65，
0.49，0.48，0.48，0.42，0.43和0.48cm/d。如附图8C所示，3种细胞壁抑制剂中，6个干扰菌株的生长速率与对照QWC菌株差异显著。相比较于刚果红培养基上QWC的生长速率38.02%，干扰株的速率介于39.70%—45.78%，SDS培养基上，QWC的生长速率74.07%，干扰株的速率在
77.78%—81.33%之间。CFW培养基上，QWC和6个干扰株的生长速率分别为69.89%，96.67%，
97.29%，97.60%，88.27%，100.33%和89.94%。这些结果表明，Pgmiox能够调节细胞壁的完整性。如附图8D所示，4种真菌抑制剂培养基上，干扰株较对照QWC菌株均表现显著差异。异菌脲和咪鲜胺胁迫时，干扰株较QWC菌株生长速率显著降低，突变菌株降低了对异菌脲和咪鲜胺的耐受性，Pgmiox基因加强了病菌对真菌抑制剂（异菌脲和咪鲜胺）的敏感性。戊唑醇和苯并咪唑胁迫时，干扰株速率显著升高，Pgmiox基因突变菌株增加了对其耐受性，该基因有可能为戊唑醇和苯并咪唑的靶位点，敲除后，药剂失去靶位点，菌丝不受药剂影响，生长速度快于对照。
0.88，0.80和0.88 cm/d。6个干扰株生长速率显著高于对照QWC，且均大于在PDA培养基的生长速率。如附图8B所示，在NaCl胁迫下，6个干扰菌株的生长速率显著低于野生菌株，QWC和它们的径向生长速度分别是0.58，0.40，0.42，0.42，0.42，0.35和0.43cm/d。PEG胁迫下，菌株的生长速率均大于PDA培养基的速率，6个干扰株较QWC差异显著。重金属CuSO4·5H2O胁迫下，干扰株的生长速率显著低于对照菌株，QWC和6个干扰株的径向生长速度分别是0.65，
0.49，0.48，0.48，0.42，0.43和0.48cm/d。如附图8C所示，3种细胞壁抑制剂中，6个干扰菌株的生长速率与对照QWC菌株差异显著。相比较于刚果红培养基上QWC的生长速率38.02%，干扰株的速率介于39.70%—45.78%，SDS培养基上，QWC的生长速率74.07%，干扰株的速率在
77.78%—81.33%之间。CFW培养基上，QWC和6个干扰株的生长速率分别为69.89%，96.67%，
97.29%，97.60%，88.27%，100.33%和89.94%。这些结果表明，Pgmiox能够调节细胞壁的完整性。如附图8D所示，4种真菌抑制剂培养基上，干扰株较对照QWC菌株均表现显著差异。异菌脲和咪鲜胺胁迫时，干扰株较QWC菌株生长速率显著降低，突变菌株降低了对异菌脲和咪鲜胺的耐受性，Pgmiox基因加强了病菌对真菌抑制剂（异菌脲和咪鲜胺）的敏感性。戊唑醇和苯并咪唑胁迫时，干扰株速率显著升高，Pgmiox基因突变菌株增加了对其耐受性，该基因有可能为戊唑醇和苯并咪唑的靶位点，敲除后，药剂失去靶位点，菌丝不受药剂影响，生长速度快于对照。
[0014] 5、突变菌株毒性和致病性的鉴定将6个干扰菌株和QWC菌株接种到毒素诱导培养基（9g蔗糖、5g酒石酸铵、1g NH4NO3、1g K2HPO4、0.5g MgSO4·7H2O、0.13g CaCl2·2H2O、0.1g NaCl、18.3mg FeSO4·7H2O、3.5mg ZnSO4·7H2O、2mg MnCl2·4H2O）中，25-30℃黑暗培养18-25d后，过滤，得到粗毒素液体（附图9A），取20μl注射接种到离体大麦（两叶期）叶片中脉的一侧上，以毒素诱导培养基溶液作为空白对照，置于温度为25℃，光照时间为12h（昼）/12h（夜）的环境下，2-3d后观察发病状况，如附图9B所示，注射QWC菌株毒素的叶片完全发病，呈深褐色，叶片尖端发黄，注射干扰菌株毒素的叶片明显发病减弱，叶片呈绿色，仅注射部位呈褐色。
[0015] 将含菌丝的琼脂块（直径：d=0.50cm）接种到离体大麦（两叶期）叶片上，将接种的大麦叶片置于温度为25℃，光照时间为12h（昼）/12h（夜）的环境下培养，2-3d后观察叶片的病斑发生状况。如附图10C所示，菌株侵染离体大麦叶片，野生株QWC菌饼侵染处，叶片明显发病，出现病变，呈黄褐色病斑，干扰株侵染的叶片，发病较弱。采用“夹心法”将大麦种子用QWC和干扰菌株置于6℃感染18-25d，盆栽播种14-20d后计算观察发病率及发病状况，野生株QWC和干扰株△miox32、△miox33、△miox35、△miox43、△miox44和△miox54的发病率分别为：63.05%，40.99%，41.20%，43.12%，41.21%，39.87%和41.56%（附图10A），6个干扰菌株的发病率与对照比较显著降低。如附图10B所示，大麦叶片明显萎缩，发病较为严重，干扰株处理的叶片发病较弱。综上所述，大麦条纹病菌菌株Pgmiox基因与致病性相关，参与麦类核菌菌株致病性。
附图说明
[0016] 图1为本发明所用引物序列。
[0017] 图2为Pgmiox基因生物信息学分析图。
[0018] 其中A为Pgmiox基因全长DNA（1）和cDNA（2）扩增结果图，B为Pgmiox基因的功能域图，C为Pgmiox基因的蛋白二级结构预测图，D为Pgmiox基因系统发育分析图。
[0019] 图3为Pgmiox基因干扰载体示意图。
[0020] 图4为干扰株的PCR验证。1泳道为阴性对照野生菌株QWC，2泳道为阳性对照干扰载体pSilent-1miox。3-8号泳道分别为：△miox32、△miox33、△miox35、△miox43、△miox44和△miox54，6个干扰突变菌株均含有潮霉素片段。
[0021] 图5为干扰株和野生株在5种营养培养基的生长形态。
[0022] 图6为干扰株和野生株在5种营养培养基的生长曲线。
[0023] 图7为干扰株和野生株在不同环境胁迫、细胞壁抑制剂和抑真菌剂培养基的生长形态。
[0024] 其中A为0.01mol/L H2O2和1mol/L山梨醇胁迫，B为0.8mol/L NaCl、15% PEG和0.5mmol/L CuSO4·5H2O胁迫，C为0.2mg/mL刚果红、0.02% SDS和0.2mg/mL CFW胁迫，D为
0.75μg/mL异菌脲、1.0μg/mL戊唑醇、5μg/mL苯并咪唑和1μg/mL咪鲜胺胁迫。
0.75μg/mL异菌脲、1.0μg/mL戊唑醇、5μg/mL苯并咪唑和1μg/mL咪鲜胺胁迫。
[0025] 图8为干扰株和野生株在不同环境胁迫、细胞壁抑制剂和抑真菌剂培养基的生长速率图。
[0026] 其中A为0.01mol/L H2O2和1mol/L山梨醇胁迫，B为0.8mol/L NaCl、15% PEG和0.5mmol/L CuSO4·5H2O胁迫，C为0.2mg/mL刚果红、0.02% SDS和0.2mg/mL CFW胁迫，D为
0.75μg/mL异菌脲、1.0μg/mL戊唑醇、5μg/mL苯并咪唑和1μg/mL咪鲜胺胁迫。
0.75μg/mL异菌脲、1.0μg/mL戊唑醇、5μg/mL苯并咪唑和1μg/mL咪鲜胺胁迫。
[0027] 图9为毒素试验图其中A图为菌株粗毒素提取图，B图为菌株粗毒素注射大麦叶片图（标尺为1cm）图10为致病性试验图
其中A图为菌株发病率图，B图为盆栽大麦叶片致病性图，C图为离体大麦叶片致病性图（标尺为1cm）。
其中A图为菌株发病率图，B图为盆栽大麦叶片致病性图，C图为离体大麦叶片致病性图（标尺为1cm）。
具体实施方式
[0028] 为使发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在附图中进行了例示。附图中所示和根据附图描述的本发明的实施方式仅仅是示例性的，并且本发明并不限于这些实施方式。
[0029] 在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明的技术方案，在附图中仅仅示出了与根据本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。
[0031] 实施例2本实施例提供一种大麦条纹病致病基因Pgmiox基因克隆及其RNA干扰转化子获得的方法，包括如下步骤：
1、Pgmiox基因的克隆及其生物信息学分析分析
制备PDA培养基：将新鲜马铃薯削皮去芽眼切成1cm2的小方块，称取重量200g，加1L蒸馏水煮沸20min，过滤去残渣，在滤液中加入20g葡萄糖和17g琼脂，玻璃棒搅拌混匀，加蒸馏水定容至1L，高压蒸汽灭菌，倒平板；用直径为5mm打孔器，将4℃保存的麦类核腔菌菌株QWC在边缘打取菌饼置于PDA培养基平板上生长7d。
1、Pgmiox基因的克隆及其生物信息学分析分析
制备PDA培养基：将新鲜马铃薯削皮去芽眼切成1cm2的小方块，称取重量200g，加1L蒸馏水煮沸20min，过滤去残渣，在滤液中加入20g葡萄糖和17g琼脂，玻璃棒搅拌混匀，加蒸馏水定容至1L，高压蒸汽灭菌，倒平板；用直径为5mm打孔器，将4℃保存的麦类核腔菌菌株QWC在边缘打取菌饼置于PDA培养基平板上生长7d。
[0032] 以QWC基因组DNA和cDNA为模板，使用引物miox-F1/ miox-R1（附图1）通过PCR扩增获得Pgmiox基因的DNA和cDNA序列，PCR产物经切胶、胶回收、连接载体pMD19-T Vector：pMD19-T Vector（Simple） 1μL、目的片段 4μL、SolutionⅠ 5μL，缓慢混匀，轻离心5sec，16℃水浴连接14h、转化DH5α感受态细胞：制备含有100μg/mL氨苄青霉素（Amp）的LBA固体培养基平板，将80μL X-gal和20μL IPTG混匀后均匀地涂布在每个平板上，晾干备用；取出-80℃保存的DH5α感受态细胞，冰上溶解，每50μL感受态细胞加入5μL过夜连接液，轻弹混匀，冰浴
30min，42℃热激90s，迅速冰浴3min，期间操作需平稳；每1.5mL离心管加入400μL LB液体培养基，37℃ 200rpm振荡培养1.5h；取200μL菌液均匀地涂布在平板上，封口膜密封，倒置于
37℃培养箱中黑暗培养13h、蓝白斑筛选及鉴定后测序。
30min，42℃热激90s，迅速冰浴3min，期间操作需平稳；每1.5mL离心管加入400μL LB液体培养基，37℃ 200rpm振荡培养1.5h；取200μL菌液均匀地涂布在平板上，封口膜密封，倒置于
37℃培养箱中黑暗培养13h、蓝白斑筛选及鉴定后测序。
[0033] 测序结果表明Pgmiox基因的ORF框全长981bp，且DNA序列与cDNA序列一致，得出该基因没有内含子（附图2A）。利用网络在线SMART工具（http://smart.embl-heidelberg.de/）对Pgmiox进行蛋白结构域分析，该基因有一个Pfam域miox结构域（Myo-inositol oxygenase；78AA 326AA）（附图2B）。运用网络在线GOR4工具（http://npsa-~
pbil.ibcp.fr/cgi-bin ... page=npsa_gor4.html）对Pgmiox进行蛋白二级结构预测，该基因编码326个氨基酸，其二级结构以α-螺旋（Alpha helix，Hh）为主（46.93%），其次为无规卷曲（Random coil，Cc）占37.73%，最后为延伸链（Extended strand，Ee）占15.34%，（附图
2C）。根据BLAST程序将麦类核菌（P.graminea）Pgmiox基因的326个氨基酸序列与Pyrenophora tritici-repentis、Alternaria alternate、Periconia macrospinosa、Aureobasidium namibiae和Aspergillus fumigatus中miox基因比对，得出相似性分别为
99%、94%、79%、81%和73%。利用MEGA6.0软件进行多序列比对，以邻近相接法（Neighbor-jointing，NJ）构建系统进化树，得出麦类核菌（P.graminea）和小麦褐斑长蠕孢霉菌（Pyrenophora tritici-repentis）的miox基因蛋白序列组合在一起（附图2D）。
pbil.ibcp.fr/cgi-bin ... page=npsa_gor4.html）对Pgmiox进行蛋白二级结构预测，该基因编码326个氨基酸，其二级结构以α-螺旋（Alpha helix，Hh）为主（46.93%），其次为无规卷曲（Random coil，Cc）占37.73%，最后为延伸链（Extended strand，Ee）占15.34%，（附图
2C）。根据BLAST程序将麦类核菌（P.graminea）Pgmiox基因的326个氨基酸序列与Pyrenophora tritici-repentis、Alternaria alternate、Periconia macrospinosa、Aureobasidium namibiae和Aspergillus fumigatus中miox基因比对，得出相似性分别为
99%、94%、79%、81%和73%。利用MEGA6.0软件进行多序列比对，以邻近相接法（Neighbor-jointing，NJ）构建系统进化树，得出麦类核菌（P.graminea）和小麦褐斑长蠕孢霉菌（Pyrenophora tritici-repentis）的miox基因蛋白序列组合在一起（附图2D）。
[0034] 2、干扰载体pSilent-1miox的构建以菌株QWC的DNA为模板，使用引物miox1-F1/miox1-R1和miox2-F1/miox2-R1（附图1）分别扩增获得片段miox1（334bp）和miox2（334bp）。用XhoⅠ和HindⅢ双酶切片段miox1和载体pSilent-1，用T4连接酶将片段miox1连接到载体pSilent-1的XhoI-HindⅢ位点。然后将片段miox2和pSilent-1miox1用ApaⅠ和StuⅠ双酶切，用T4连接酶将片段miox2连接到载体pSilent-1miox1的ApaⅠ-StuⅠ位点，得到Pgmiox基因的干扰载体pSilent-1miox（附图3）。
[0035] 3、遗传转化与筛选将QWC菌株置于酶解液（1%溶壁酶（Lywallzyme）+0.5%蜗牛酶（Snailase），以0.7mol/L NaCl稳渗剂配制）30℃温育4h，过滤未酶解菌丝，制备出原生质体，置于STC缓冲液（0.7mol/L蔗糖，50mmol/L CaCl2，10mmol/L Tris-HCl（pH=7.5））中保存。通过PEG4000介导进行转化：取100μL STC重悬沉淀与10μg pSilent-1miox的质粒DNA混合，冰浴20min，加入100μL PTC（60% PEG4000，溶解在STC缓冲液中）混匀，冰浴20min，再逐滴加入800μL PTC，室温静置
15min，将原生质体转化混合物（500μL/板）用玻璃涂布器轻轻涂布在15mL再生培养基（rPDA，含有0.7mol/L蔗糖的PDA）平板上，倒置于25℃培养箱中静置培养。观察平板表面形成可见菌落后，加盖10mL含有90μg/mL潮霉素B的PDA培养基，25℃培养至长出单菌落。将这些菌落直接转移到含有100μg/mL潮霉素B的PDA培养基平板中。连续培养3代，获得能稳定生长的转化子54株，用潮霉素B特异性引物HYG-1/HYG-2（附图1）进行PCR鉴定筛选（附图4），随机选择6株能扩增出1026bp条带的菌株（△miox32、△miox33、△miox35、△miox43、△miox44和△miox54）进行荧光定量PCR分析得出干扰率分别为：90.36%、89.87%、88.47%、
90.56%、90.75%和88.03%，所需引物如附图1所示。
15min，将原生质体转化混合物（500μL/板）用玻璃涂布器轻轻涂布在15mL再生培养基（rPDA，含有0.7mol/L蔗糖的PDA）平板上，倒置于25℃培养箱中静置培养。观察平板表面形成可见菌落后，加盖10mL含有90μg/mL潮霉素B的PDA培养基，25℃培养至长出单菌落。将这些菌落直接转移到含有100μg/mL潮霉素B的PDA培养基平板中。连续培养3代，获得能稳定生长的转化子54株，用潮霉素B特异性引物HYG-1/HYG-2（附图1）进行PCR鉴定筛选（附图4），随机选择6株能扩增出1026bp条带的菌株（△miox32、△miox33、△miox35、△miox43、△miox44和△miox54）进行荧光定量PCR分析得出干扰率分别为：90.36%、89.87%、88.47%、
90.56%、90.75%和88.03%，所需引物如附图1所示。
[0036] 实施例3本实施例提供一种大麦条纹病致病基因Pgmiox的应用，包括如下步骤：
1、一种大麦条纹病致病基因Pgmiox参与调控麦类核腔菌毒性和致病性方面应用将6个干扰菌株和QWC菌株接种到毒素诱导培养基（9g蔗糖、5g酒石酸铵、1g NH4NO3、1g K2HPO4、0.5g MgSO4·7H2O、0.13g CaCl2·2H2O、0.1g NaCl、18.3mg FeSO4·7H2O、3.5mg ZnSO4·7H2O、2mg MnCl2·4H2O）中，25℃黑暗培养20d后，过滤，得到粗毒素液体，空白诱导培养基为对照CK，6个干扰菌株的颜色明显比QWC淡，野生株粗毒素液体呈现深褐色，干扰株液体呈淡黄色（附图9A）。取20μl注射接种到离体大麦（两叶期）叶片中脉的一侧上，以毒素诱导培养基溶液作为空白对照，置于温度为25℃，光照时间为12h（昼）/12h（夜）的环境下，
3d后观察发病状况，如附图9B所示，注射QWC菌株毒素的叶片完全发病，呈深褐色，叶片尖端发黄，注射干扰菌株毒素的叶片明显发病减弱，叶片呈绿色，仅注射部位呈褐色。
1、一种大麦条纹病致病基因Pgmiox参与调控麦类核腔菌毒性和致病性方面应用将6个干扰菌株和QWC菌株接种到毒素诱导培养基（9g蔗糖、5g酒石酸铵、1g NH4NO3、1g K2HPO4、0.5g MgSO4·7H2O、0.13g CaCl2·2H2O、0.1g NaCl、18.3mg FeSO4·7H2O、3.5mg ZnSO4·7H2O、2mg MnCl2·4H2O）中，25℃黑暗培养20d后，过滤，得到粗毒素液体，空白诱导培养基为对照CK，6个干扰菌株的颜色明显比QWC淡，野生株粗毒素液体呈现深褐色，干扰株液体呈淡黄色（附图9A）。取20μl注射接种到离体大麦（两叶期）叶片中脉的一侧上，以毒素诱导培养基溶液作为空白对照，置于温度为25℃，光照时间为12h（昼）/12h（夜）的环境下，
3d后观察发病状况，如附图9B所示，注射QWC菌株毒素的叶片完全发病，呈深褐色，叶片尖端发黄，注射干扰菌株毒素的叶片明显发病减弱，叶片呈绿色，仅注射部位呈褐色。
[0037] 将含菌丝的琼脂块（直径：d=0.50cm）接种到离体大麦（两叶期）叶片上，将接种的大麦叶片置于温度为25℃，光照时间为12h（昼）/12h（夜）的环境下培养，3d后观察叶片的病斑发生状况。如附图10C所示，菌株侵染离体大麦叶片，野生株QWC菌饼侵染处，叶片明显发病，出现病变，呈黄褐色病斑，干扰株侵染的叶片，发病较弱。采用“夹心法”将大麦种子用QWC和干扰菌株置于6℃感染20d，盆栽播种20d后计算观察发病率及发病状况，野生株QWC和干扰株△miox32、△miox33、△miox35、△miox43、△miox44和△miox54的发病率分别为：63.05%，40.99%，41.20%，43.12%，41.21%，39.87%和41.56%（附图10A），6个干扰菌株的发病率与对照比较显著降低。如附图10B所示，大麦叶片明显萎缩，发病较为严重，干扰株处理的叶片发病较弱。综上所述，大麦条纹病菌菌株Pgmiox基因与致病性相关，参与麦类核菌菌株致病性。
[0038] 2、一种大麦条纹病致病基因Pgmiox参与调控麦类核腔菌生长分化方面应用将6个干扰菌株分别接种以下5种培养基中：基本培养基（MM）：NaNO3 6g、KCl 0.52g、MgSO4 0.152g、KH2PO4 1.52g、VB1 0.01g、微量元素1mL（母液：H3BO3 0.570g、MnCl2·4H2O 0.360g、ZnSO4·7H2O 0.045g、CuSO4·5H2O 0.016g、(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.087g，蒸馏水定容到1L）、葡萄糖10g、琼脂17g，蒸馏水定容到1L；完全培养基（CM）：NaNO3 1.8g、葡萄糖10g、蛋白胨2g、酵母1g、微量元素1mL，17g的琼脂，蒸馏水定容到1L；V8培养基（V8）：V8果汁
100mL、CaCO3 0.2g、琼脂17g，蒸馏水定容到1L；大麦培养基（BM）：称取大麦50g置于1L蒸馏水中煮沸1小时，纱布过滤残渣，琼脂17g，蒸馏水定容到1L；PDA培养基（PDA）：新鲜马铃薯
200g，加1L蒸馏水煮沸，过滤去残渣，加20g葡萄糖，17g琼脂，混匀，加蒸馏水定容至1L。以野生菌株QWC为对照，25℃黑暗培养，按照十字交叉法每天测量菌落直径，每个菌株重复3皿（附图5）。如附图6所示，菌株均呈现缓慢增长的趋势。CM、V8、BM和PDA培养基中，6个RNA干扰株较对照QWC菌株的增长速度差异较大，MM培养基中，菌株生长速率趋于一致，但6个干扰菌株速率均低于对照QWC，Pgmiox基因的干扰突变显著影响了麦类核菌的生长。在CM、MM、V8、BM和PDA培养基上生长速度分别为：QWC：1.05，0.80，0.93，1.06，1.11cm/d；△miox32：0.80，
0.71，0.68，0.93，0.79cm/d；△miox33：0.76，0.76，0.76，0.91，0.75cm/d；△miox35：0.72，
0.76，0.76，0.93，0.75cm/d；△miox43：0.74，0.76，0.74，0.80，0.78cm/d；△miox44：0.60，
0.73，0.55，0.68，0.77cm/d和△miox54：0.82，0.75，0.76，0.96，0.81cm/d，以上结果表明Pgmiox参与了调节麦类核腔菌的生长发育。
100mL、CaCO3 0.2g、琼脂17g，蒸馏水定容到1L；大麦培养基（BM）：称取大麦50g置于1L蒸馏水中煮沸1小时，纱布过滤残渣，琼脂17g，蒸馏水定容到1L；PDA培养基（PDA）：新鲜马铃薯
200g，加1L蒸馏水煮沸，过滤去残渣，加20g葡萄糖，17g琼脂，混匀，加蒸馏水定容至1L。以野生菌株QWC为对照，25℃黑暗培养，按照十字交叉法每天测量菌落直径，每个菌株重复3皿（附图5）。如附图6所示，菌株均呈现缓慢增长的趋势。CM、V8、BM和PDA培养基中，6个RNA干扰株较对照QWC菌株的增长速度差异较大，MM培养基中，菌株生长速率趋于一致，但6个干扰菌株速率均低于对照QWC，Pgmiox基因的干扰突变显著影响了麦类核菌的生长。在CM、MM、V8、BM和PDA培养基上生长速度分别为：QWC：1.05，0.80，0.93，1.06，1.11cm/d；△miox32：0.80，
0.71，0.68，0.93，0.79cm/d；△miox33：0.76，0.76，0.76，0.91，0.75cm/d；△miox35：0.72，
0.76，0.76，0.93，0.75cm/d；△miox43：0.74，0.76，0.74，0.80，0.78cm/d；△miox44：0.60，
0.73，0.55，0.68，0.77cm/d和△miox54：0.82，0.75，0.76，0.96，0.81cm/d，以上结果表明Pgmiox参与了调节麦类核腔菌的生长发育。
[0039] 3、一种大麦条纹病致病基因Pgmiox参与调控麦类核腔菌在不同环境胁迫耐受性、细胞壁完整性和抑真菌剂敏感性方面应用将6个干扰菌株和QWC菌株分别接种在添加15% PEG、0.01mol/L H2O2、0.8mol/L NaCl、
1mol/L山梨醇、0.5mmol/L CuSO4·5H2O、0.2mg/mL刚果红、0.02% SDS、0.2mg/mL CFW、0.75μg/mL异菌脲、1.0μg/mL戊唑醇、5μg/mL苯并咪唑和1μg/mL咪鲜胺不同处理的PDA培养基上，以PDA培养基为对照，25℃黑暗培养7d后，按照十字交叉法测量菌落直径，计算菌落生长速率V=T/P×100%,（T是在处理培养基上,野生株QWC和干扰株菌落的直径，P是在对照PDA培养基上菌落生长的直径），每个菌株处理重3皿（附图7）。如附图8A所示，在H2O2胁迫下，干扰株与QWC生长速率无显著差异。山梨醇胁迫下，野生株QWC和干扰株△miox32、△miox33、△miox35、△miox43、△miox44和△miox54的径向生长速度分别是1.06，0.90，0.89，0.87，
0.88，0.80和0.88 cm/d。6个干扰株生长速率显著高于对照QWC，且均大于在PDA培养基的生长速率。如附图8B所示，在NaCl胁迫下，6个干扰菌株的生长速率显著低于野生菌株，QWC和它们的径向生长速度分别是0.58，0.40，0.42，0.42，0.42，0.35和0.43cm/d。PEG胁迫下，菌株的生长速率均大于PDA培养基的速率，6个干扰株较QWC差异显著。重金属CuSO4·5H2O胁迫下，干扰株的生长速率显著低于对照菌株，QWC和6个干扰株的径向生长速度分别是0.65，
0.49，0.48，0.48，0.42，0.43和0.48cm/d。如附图8C所示，3种细胞壁抑制剂中，6个干扰菌株的生长速率与对照QWC菌株差异显著。相比较于刚果红培养基上QWC的生长速率38.02%，干扰株的速率介于39.70%—45.78%，SDS培养基上，QWC的生长速率74.07%，干扰株的速率在
77.78%—81.33%之间。CFW培养基上，QWC和6个干扰株的生长速率分别为69.89%，96.67%，
97.29%，97.60%，88.27%，100.33%和89.94%。这些结果表明，Pgmiox能够调节细胞壁的完整性。如附图8D所示，4种真菌抑制剂培养基上，干扰株较对照QWC菌株均表现显著差异。异菌脲和咪鲜胺胁迫时，干扰株较QWC菌株生长速率显著降低，突变菌株降低了对异菌脲和咪鲜胺的耐受性，Pgmiox基因加强了病菌对真菌抑制剂（异菌脲和咪鲜胺）的敏感性。戊唑醇和苯并咪唑胁迫时，干扰株速率显著升高，Pgmiox基因突变菌株增加了对其耐受性，该基因有可能为戊唑醇和苯并咪唑的靶位点，敲除后，药剂失去靶位点，菌丝不受药剂影响，生长速度快于对照。
1mol/L山梨醇、0.5mmol/L CuSO4·5H2O、0.2mg/mL刚果红、0.02% SDS、0.2mg/mL CFW、0.75μg/mL异菌脲、1.0μg/mL戊唑醇、5μg/mL苯并咪唑和1μg/mL咪鲜胺不同处理的PDA培养基上，以PDA培养基为对照，25℃黑暗培养7d后，按照十字交叉法测量菌落直径，计算菌落生长速率V=T/P×100%,（T是在处理培养基上,野生株QWC和干扰株菌落的直径，P是在对照PDA培养基上菌落生长的直径），每个菌株处理重3皿（附图7）。如附图8A所示，在H2O2胁迫下，干扰株与QWC生长速率无显著差异。山梨醇胁迫下，野生株QWC和干扰株△miox32、△miox33、△miox35、△miox43、△miox44和△miox54的径向生长速度分别是1.06，0.90，0.89，0.87，
0.88，0.80和0.88 cm/d。6个干扰株生长速率显著高于对照QWC，且均大于在PDA培养基的生长速率。如附图8B所示，在NaCl胁迫下，6个干扰菌株的生长速率显著低于野生菌株，QWC和它们的径向生长速度分别是0.58，0.40，0.42，0.42，0.42，0.35和0.43cm/d。PEG胁迫下，菌株的生长速率均大于PDA培养基的速率，6个干扰株较QWC差异显著。重金属CuSO4·5H2O胁迫下，干扰株的生长速率显著低于对照菌株，QWC和6个干扰株的径向生长速度分别是0.65，
0.49，0.48，0.48，0.42，0.43和0.48cm/d。如附图8C所示，3种细胞壁抑制剂中，6个干扰菌株的生长速率与对照QWC菌株差异显著。相比较于刚果红培养基上QWC的生长速率38.02%，干扰株的速率介于39.70%—45.78%，SDS培养基上，QWC的生长速率74.07%，干扰株的速率在
77.78%—81.33%之间。CFW培养基上，QWC和6个干扰株的生长速率分别为69.89%，96.67%，
97.29%，97.60%，88.27%，100.33%和89.94%。这些结果表明，Pgmiox能够调节细胞壁的完整性。如附图8D所示，4种真菌抑制剂培养基上，干扰株较对照QWC菌株均表现显著差异。异菌脲和咪鲜胺胁迫时，干扰株较QWC菌株生长速率显著降低，突变菌株降低了对异菌脲和咪鲜胺的耐受性，Pgmiox基因加强了病菌对真菌抑制剂（异菌脲和咪鲜胺）的敏感性。戊唑醇和苯并咪唑胁迫时，干扰株速率显著升高，Pgmiox基因突变菌株增加了对其耐受性，该基因有可能为戊唑醇和苯并咪唑的靶位点，敲除后，药剂失去靶位点，菌丝不受药剂影响，生长速度快于对照。
[0040] 综上所述：Pgmiox具有促进菌丝生长分化，增强盐、干旱和重金属Cu2+胁迫耐受性，加强抑真菌剂（异菌脲和咪鲜胺）敏感性，调控菌株毒性和致病性的功能。沉默该基因具有降低大麦条纹病（麦类核腔菌）的毒性和致病性的应用，敲除Pgmiox使抑真菌剂（戊唑醇和苯并咪唑）失去靶位点，在灭真菌剂方面具有应用。
[0041] 有益效果：本发明提供了一种大麦条纹病（麦类核腔菌）致病性基因Pgmiox，以应对该病害靶标基因的需求，通过RNA干扰技术获得Pgmiox干扰突变体，进一步提供了该基因在生长分化、不同环境胁迫耐受性、细胞壁完整性、抑真菌剂敏感性、毒性和致病性等方面的应用。
[0042] 以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。
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