紫花苜蓿抗旱耐热基因MsMBF1c的编码序列及应用
阅读：625发布：2020-05-17
专利汇可以提供紫花苜蓿抗旱耐热基因MsMBF1c的编码序列及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种紫花苜蓿MsMBF1c的核苷酸序列和 氨 基酸序列以及它在调节 植物 抗旱耐热性中的应用，通过过量表达MsMBF1c来改变植物对干旱和高温的抵抗能 力 ，为在高温与干旱条件下改善植物抗逆性提供保证，以便用于牧草、 农作物 及经济作物的抗旱耐热品种选育，以减缓高温干旱等 环境胁迫 对作物产量和品质造成的伤害。属于植物基因工程领域。，下面是紫花苜蓿抗旱耐热基因MsMBF1c的编码序列及应用专利的具体信息内容。
紫花苜蓿抗旱耐热基因MsMBF1c的编码序列及应用
技术领域
背景技术
[0002] 植物在生长发育过程中经常受到病虫害、干旱、高温、盐碱化等多种生物和非生物胁迫，造成生长减缓、产量下降，因此农作物的高抗逆性一直是科研工作和农业生产追求的共同目标。干旱常常与高温胁迫同时出现，是农业生产最主要的非生物胁迫之一，每年因为干旱造成50％以上的农作物减产。草地生态畜牧业是农业可持续性发展的后盾，然而大多数牧草种植在土壤相对贫瘠的区域，往往面临更加严峻的环境胁迫。紫花苜蓿作为一种广泛种植的冷季型豆科牧草，抗旱耐热性与耐酸性是其在南方种植推广中遗传改良的两个主要目标。植物无法像动物那样通过移动来躲避干旱、高温等不利的生长环境，在长期进化过程中，其能够通过改变一些关键抗逆基因的表达、调整自身的生理状态以适应季节性和突发性灾害。通过正向或反向遗传学的方法已经成功鉴定出许多参与逆境调控的基因，主要可以分为三类：1，直接保护植物免受环境伤害的基因，包括编码用于合成各种渗透调节物质的酶类。2，编码膜脂修饰的酶以及信号转导类蛋白。3，通过调节其他基因表达间接保护植物免受干旱高温伤害的转录因子。
[0003] 通过对这些关键基因遗传转化已经成功获得了多种植物中的抗旱或耐热株系，然而它们大部分都是在实验室条件下针对干旱或者高温单种胁迫获得的，在实际生产中，干旱常常与其他不利因素一起发生，因此研究和利用能够应答多种逆境胁迫的转录因子成为解决该问题的有效途径。通过转基因的方法在模式植物和部分农作物已经培育出多抗的转基因株系。在拟南芥中过量表达FTL1/DDF1能够显著提高植物对低温、高温以及干旱的耐受能力。在水稻中过量表达NAC转录因子能够提高其对干旱与高盐的耐受性。OsDREB1能够显著提高转基因拟南芥和水稻对干旱、高盐以及低温的抗性。此外，将番茄的SlAREB1在土豆中过量表达能显著提高植物对干旱与高盐的耐受能力。这些研究为培育抵抗多种逆境的新品种提供了理论基础与技术支持。
[0004] 在具有多种抗逆性的基因中，MBF1(Multiprotein Bridging Factors 1)是一个在动植物中保守的转录激活辅助因子，通过连接转录因子与其他调控原件调节基因表达，参与细胞分化、激素调控、脂代谢以及组氨酸代谢等生物学过程。在拟南芥中存在3个拷贝的MBF1基因，MBF1a与MBF1b与动物中的MBF1基因同源性较高，不具备DNA结合能力；而MBF1c能够结合DNA并且被病害、干旱、高温、高盐、双氧水以及外源施加的脱落酸与水杨酸所诱导。最近研究发现MBF1c通过调节水杨酸、乙烯和海藻糖信号途径调控植物的抗热性，并且能够调节包括DREB2a、HSFs以及bZIP等在内的36个不同的转录因子的表达。在拟南芥中，过量表达MBF1c能够显著提高植物在高温、干旱以及高盐条件下的种子萌发力，并且这种抗性的增强在高温与干旱同时发生时依然存在。因此，MBF1c是一个培育抵抗多种逆境作物的重要候选基因。但是该基因在牧草抗旱耐热中的研究还没有报道，特别是营养生长期的耐热调节。
[0005] 紫花苜蓿因其优良的营养品质在畜牧业中起到十分重要的作用。随着南方草地生态畜牧业的发展，在西南喀斯特地区需要建植人工草地数千万亩，亟需紫花苜蓿这种高产优质的豆科牧草。然而目前在南方地区进行抗旱耐热品种筛选与种质创新往往只根据秋眠级这一个指标，具有一定的局限性，而且目前在紫花苜蓿中对其多效基因的系统性研究和种质创新还较少。
发明内容
[0006] 本发明的目的是提供一种紫花苜蓿抗旱耐热基因MsMBF1c的编码序列及应用，为培育抗旱耐热的紫花苜蓿新种质资源，在西南喀斯特地区推广应用有十分重要的理论研究价值与应用推广前景。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用如下方案：
[0009] 紫花苜蓿抗旱耐热基因MsMBF1c的编码序列是序列表中SEQ ID NO：2所示的蛋白质,属于多桥蛋白转录共激活子。
[0010] 紫花苜蓿抗旱耐热基因MsMBF1c显著受干旱、高温以及干旱与高温组合诱导；在MsMBF1c过量表达的拟南芥中，转基因植株比野生型植株在种子萌发与幼苗生长阶段对高温的耐受性都要增强；而在过量表达MsMBF1c的紫花苜蓿中，转基因植物的抗旱性和耐热性都显著增强。
[0011] 前述紫花苜蓿抗旱耐热基因MsMBF1c的编码序列的应用，其用于调节植物萌发和幼苗期的耐热性，以及调节植物在生长阶段对干旱和高温耐受性，紫花苜蓿抗旱耐热基因MsMBF1c的编码序列可提高植物抗旱性和耐热性。
[0012] 与现有技术相比，本发明的优点如下：
[0013] 本发明是国内外首次公开详细报道紫花苜蓿MsMBF1c的序列，其过量表达量能够增强拟南芥和紫花苜蓿的耐热性和抗旱性的功能目前没有相关报道，本发明发现在拟南芥中过量表达紫花苜蓿MsMBF1c基因能够提高高温条件下种子的发芽率，以及幼苗对高温的耐受性，在紫花苜蓿中过量表MsMBF1c基因能够提高紫花苜蓿植株对高温和干旱抵抗能力，因此本发明提出可利用过量表达MsMBF1c来改变植物抗旱和耐热性，为高温干旱条件下改善作物抗逆性提供保证，最终可用于牧草、农作物及经济作物等抗旱耐热新品种选育，减缓高温干旱等环境胁迫对作物产量和品质的伤害。附图说明
[0014] 图1为紫花苜蓿MsMBF1c与拟南芥MBF1c同源序列比对图；
[0016] 图2为植物表达载体示意图；
[0017] 克隆获得MsMBF1c基因编码区序列并将其与pMD18-T空载体连接获得pMD18-MsMBF1c，测序正确后，用Sma1和Sac1分别酶切pMD18-MsMBF1c与pBI121空载体，回收基因片段与载体片段，然后连接、转化、筛选获得pBI121-MsMBF1c阳性克隆；
[0018] 图3为MsMBF1c受高温、干旱诱导表达图；
[0019] 将四周大的紫花苜蓿幼苗分别进行高温和干旱处理，提取叶片中的RNA，反转录活获得cDNA，然后采用qRT-PCR分析MsMBF1c表达量；
[0020] 图4为筛选pBI121-MsMBF1c阳性转基因拟南芥；
[0021] 将消毒好的转基因种子播种于1/2MS+卡那霉素50mg/L+特美汀300mg/L培养基生长15天(A)；采用PCR方法用抗性标记引物与基因特异性引物检测pBI121-MsMBF1c转基因植株；
[0022] 图5MsMBF1c过量表达提高高温条件下拟南芥发芽率；
[0023] 将消毒好的种子播种于1/2MS培养基上，春化3d后将平皿置于恒温水浴锅中45℃高温处理4h，4.5h与5h，7d后统计发芽率，MsMBF1c过量表达提高高温条件下拟南芥发芽率；
[0024] 图6MsMBF1c过量表达提高高温条件下拟南芥幼苗存活率；
[0025] 将消毒好的种子播种于1/2MS培养基上，春化3d后平皿置于人工气候室生长7天，将幼苗浸入恒温水浴锅中42℃高温处理20min，25min，30min，转移到22℃正常生长条件下生长7天，照相并统计死亡率，突变体发芽率与存活率显著下降，而互补材料与野生型相当；
[0026] 图7为筛选pBI121-MsMBF1c阳性转基因苜蓿；
[0027] 采用组织培养的方法，以卡那霉素为筛选压，将阳性转基因植株移栽到腐殖土中进行练苗处理，阳性面分别进行了抗性基因和特异基因的分子鉴定。
具体实施方式
[0028] 下面通过具体实施例对本发明作进一步说明，具体如下：
[0029] 实施例1：紫花苜蓿MsMBF1c的克隆与序列比对分析。
[0030] 以拟南芥AtMBF1c基因为模板，在NCBI数据库中检索蒺藜苜蓿MBF1c基因的序列，以其为模板设计引物(正向引物：[5’-ATGTCAGGTCTAGGCCATATTTCTC-3’]；反向引物：[5’-TCATTTCTTGCCACGCAGTTTAG-3’])，以紫花苜蓿“中苜一号”cDNA为模板，克隆MsMBF1c的编码序列，回收纯化后将其连接到pMD18-T载体，利用ABI3700测序获得其编码序列。利用ClustalX 1.8.3软件比对MsMBF1c与AtMBF1c蛋白质序列，比对结果见图1。
[0031] 1、提取紫花苜蓿叶片总RNA。
[0034] (3)加入200μl氯仿，在涡旋振荡仪上(VORTEX-GENIE 2T)剧烈振荡30s，室温放置5min，
[0035] (5)12000g，4℃，离心10min，取500μl上清至新管中，加入1ml无水乙醇，混匀后-20℃放置20min，
[0036] (6)12000g，4℃，离心10min，倒掉上清，加入1ml预冷的75％乙醇(用DEPC H2O按照体积比稀释)，
[0037] (7)10000g，4℃，离心10min，倒掉上清，空气干燥15min，
[0038] (8)加20-30μl RNase-free H2O 50-60℃溶解5min。
[0039] 2、反转录合成cDNA第一链
[0040] cDNA第一链合成采用PrimeScriptTMⅡfirst strand cDNA synthesis Kit(Takara)反转录试剂盒，具体操作参照试剂盒说明进行，具体如下。
[0041] (1)在冰上配置以下反应液，轻轻震荡混匀，
[0042]
[0043] (2)42℃，在恒温水浴锅中孵育1h，
[0044] (3)75℃，在DNA扩增仪中孵育5min，终止反应。
[0045] 3、克隆MsMBF1c基因
[0046] (1)以拟南芥MBF1c为模板，在NCBI数据库进行BLST分析，挑选蒺藜苜蓿MBF家族基因序列采用primer premier5.0设计引物序列，以紫花苜蓿叶片cDNA为模板进行PCR扩增，按照以下方式和比例配置反应液：
[0047]
[0048] (2)按照以下程序进行PCR反应，94℃3min，94℃30s，52℃30s，72℃1min，30cycles，72℃5min，25℃5min。回收纯化MsMBF1c片段(上海生工，SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit)，并连接到pMD18-T载体(Takara)，测序获得紫花苜蓿MsMBF1c编码序列，其碱基序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。其对应的蛋白质序列为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
[0049] 采用ClustalX 1.8.3序列比对软件，对MsMBF1c与AtMBF1c蛋白序列进行比对，并做出序列比对图。
[0050] 结果：获得一个429bp的编码序列，编码142个氨基酸，通过ClustalX 1.8.3比对分析发现，MsMBF1c与AtMBF1c蛋白序列相似度达72％，说明MBF1c基因在苜蓿与拟南芥中功能比较保守。
[0051] 实施例2：紫花苜蓿MsMBF1c的诱导表达分析。
[0052] (1)在人工气候室条件下，将生长4周的野生型“中牧1号”紫花苜蓿分为4组，2个对照组,1个干旱处理组，1个高温处理组。
[0053] (2)高温处理组：在光照培养箱模拟高温处理，将处理组置于40℃条件下，高温胁迫1h，对照组在正常条件下(20-22℃)生长，处理完后，处理组和对照组一起取样。
[0054] (3)干旱处理组：在人工气候室模拟干旱处理，将处理组与对照组在正常条件下(20-22℃)生长，处理组连续干旱2周，对照组正常浇水，处理完后，处理组和对照组一起取样。
[0055] (4)RNA提取与反转录参考实施案例1，采用qRT-PCR检测MsMBF1c受高温与干旱诱导表达的变化。
[0056] (5)采用SYBR Green Realtime PCR Master Mix plus(TOYUBO，QPK-212)试剂盒，按照以下方法配制反应液：
[0057]
[0058] 引物组合为qMsMBF1cF+qMsMBF1cR,引物序列为qMsMBF1c F：CAATGAGAAGCCTCAAGTGATCCA,qMsMBF1c R:TGCCACGCAGTTTAGCTCCAAG。
[0059] (6)按照以下反应程序进行PCR反应：94℃2min，94℃15s，58℃15s，72℃30s，read plate，45cycles，72℃5min，25℃5min。
[0060] (7)数据分析采用Excel 2010，图形软件采用PowerPoint 2010处理。
[0061] 结果：高温胁迫条件下，MsMBF1c被显著上调表达4.21倍，在干旱胁迫条件下，MsMBF1c被上调表达2.21倍，在干旱和高温组合胁迫下MsMBF1c被显著上调表达4.92倍。
[0062] 实施例3：紫花苜蓿MsMBF1c在调节拟南芥发芽和幼苗耐热性中的应用。
[0063] 1、MsMBF1c表达载体的构建及拟南芥转化
[0064] (1)将实施案例1获得的pMD18-MsMBF1c与pBI121通过BamHⅠ与SmaⅠ酶切，切胶回收目的片段，通过T4DNA连接酶连接(Fermentas)构建pBI121-MsMBF1c过量表达载体，并通过CaCl2转化法将质粒转化到农杆菌GV3101菌株。
[0066] (3)从双抗(25mg/L Gent+50mg/L Km)平皿上挑取活化阳性农杆菌单菌落接种到5ml LB双抗培养基中，28℃,220rpm震荡活化24h。
[0067] (4)按照1:50的比例将活化的菌液接种到200ml LB双抗培养基中28℃,220rpm震荡培养8-12h。
[0068] (5)4000-6000r/min室温离心10-15min收集培养的农杆菌细胞，并将其用新鲜配置的诱导培养基悬浮。
[0069] (6)将处于生殖生长前中期的野生型拟南芥去除花和角果，直接浸泡至农杆菌悬浮液侵染30s。
[0070] (7)在暗室中放置过夜，然后正常培养条件下收获种子，即获得T0代转基因种子。
[0071] 2、MsMBF1c转基因拟南芥筛选
[0072] (1)将新收的MsMBF1c转基因拟南芥T0种子分装成200mg每份，分别装入1.5ml离心管中。
[0073] (2)用75％乙醇表面消毒1min，然后用50％84消毒液(洁阿姨，市售)消毒3min，上下颠倒，使种子与消毒液充分混匀。
[0074] (3)用无菌水清洗种子3-4次后用0.1％的琼脂糖悬浮，将种子均匀铺布于1/2MS+300mg/L特美汀+50mg/L卡那霉素的培养基上，4℃避光春化3天。
[0075] (4)将含有种子的培养皿转移到人工气候室中，黑暗条件培养3天，转移到光照条件下继续培养7-15天，人工培养室条件：温度为22℃，湿度为80％，光照强度为80-200μmol/m2/s，光周期为16h光照，8h黑暗。
[0076] (5)将绿色存活的拟南芥幼苗转移到营养土培养基中，继续置于光照培养室生长。
[0077] (6)3周后，取10-100mg新鲜叶片组织放入无菌的1.5ml离心管中。
[0078] (7)加入400μl抽提缓冲液(200mM Tris-HCl pH7.5，250mM NaCl，25mM EDTA，0.5％SDS)，室温迅速研磨。
[0079] (8)上下颠倒离心管混匀后，静置10min。
[0080] (9)12000rpm，室温离心10min，将上清转移到800μl预冷的无水乙醇中，-20℃沉淀1-2h。
[0081] (10)12000rpm，室温离心15min，倒到上清，沥干DNA。
[0082] (11)加100μl无菌水充分溶解DNA，取2μl为模板，进行分子验证。
[0083] (12)分别以抗性基因NPT和35S+基因下游引物进行分子鉴定，引物序列分别为NPTF[5’-GTGCCCTGAATGAACTGC-3’]，NPTR[5’-CAATATCACGGGTAGCCA-3’]35S[5’-TCCCACTATCCTTCGCAAG-3’]与MsMBF1cR[5’-TCATTTCTTGCCACGCAGTTTAG-3’]按照以下配方配制反应液(上海生工2×Taq PCR反应试剂盒)：
[0084]
[0085]
[0086] (13)按照以下程序进行DNA扩增，反应程序如下：94℃3min，94℃30s，58℃45s，72℃30s，30cycles，72℃5min，25℃5min。
[0087] (14)取5-10μl上样到琼脂糖凝胶进行电泳检测，挑选阳性转基因植株。
[0088] 2、MsMBF1c对拟南芥耐热性调节
[0089] (1)准备耐热性分析的材料，从T3株系中挑选纯合不分离的转基因株系；从ABRC购买获得mbf1c T-DNA插入突变体，参照过量表达的方法将MsMBF1c基因转化到mbf1c突变体中，获得功能互补株系。
[0090] (2)参照阳性转基因植株筛选的方法对MsMBF1c过量表达株系、mbf1c突变体、MsMBF1c互补mbf1c以及野生型拟南芥进行表面消毒。
[0091] (3)将消毒好的材料均匀播种在含有20ml培养基的9cm培养皿中，每个材料播种30颗种子，放于4℃避光纯化3d。
[0092] 高温处理发芽实验：
[0093] (4)将春化后的培养皿完全浸入45℃恒温水浴锅中，分别处理4h、4.5h和5h，每个时间点3个重复。
[0094] (5)将高温处理后的材料与对照材料一起，置于正常条件下(22℃)培养7-10天，每天统计发芽率，10天后将发芽的种子按照发芽势强弱依次排列照相。
[0095] 高温处理幼苗存活率实验：
[0096] (4)将春化后的材料转移到光照培养箱中培养7天，将材料分为两组，将处理组材料完全浸入到42℃恒温水浴锅中，进行高温处理20min、25min和30min，每个时间点3个重复。
[0097] (5)将高温处理后的材料与对照组一起置于正常条件下生长7d，统计幼苗存活率，并拍取照片。
[0098] 3、基因表达分析
[0099] (1)取14天大的野生型、MsMBF1c过量表达、mbf1c突变体拟南芥植株，38℃高温处理1h，收集正常条件和高温条件下的幼苗，RNA提取、反转录的方法与程序同实施案例一，荧光定量(qRT-PCR)采用SYBR Green Realtime PCR Master Mix plus(TOYUBO，QPK-212)试剂盒，按照以下方法配制反应液：
[0100]
[0101] 引物序列如表(1)
[0102] 表(1)使用的引物。
[0103]
[0104]
[0105] (2)按照以下反应程序进行PCR反应：94℃2min，94℃15s，58℃15s，72℃30s，read plate，45cycles，72℃5min，25℃5min。
[0106] (3)数据分析采用Excel 2010，图形软件采用Photoshop CS6与PowerPoint2010处理。
[0107] 结果：MsMBF1c能显著增强转基因拟南芥在高温条件下种子的发芽率以及幼苗存活率，紫花苜蓿MsMBF1c能互补拟南芥mbf1c突变体耐热性减弱的表型。
[0108] HsfA1a的表达受高温诱导，但是不受MsMBF1c影响；在正常条件下，HsfA2、WRKY18与DREB2a在mbf1c突变体中表达下调，而在MsMBF1c过量表达植株中上调表达，高温诱导后，HsfA2、WRKY18与DREB2a在野生型拟南芥、mbf1c突变体和MsMBF1c过量表达植株中都被诱导，其中在mbf1c突变体中，这些基因的热诱导程度显著低于在野生型和MsMBF1c过量表达植株；在正常条件下，HsfA3、HsfB1与WRKY25的表达在mbf1c突变体中没受影响，而在MsMBF1c过量表达植株中被诱导，在高温胁迫条件下，HsfA3、HsfB1与WRKY25的表达都能被不同程度诱导，但是在野生型和MsMBF1c过量表达植株中的诱导幅度显著高于mbf1c突变体。说明MsMBF1c能够参与HsfA2-HsfA3和DREB2a介导的耐热调节途径。
[0109] 实施例4：紫花苜蓿MsMBF1c在调节紫花苜蓿高温与干旱耐受性中的应用。
[0110] 1、MsMBF1c转基因紫花苜蓿的获得与筛选
[0111] (1)将新收的“中苜一号”紫花苜蓿种子采用75％乙醇表面消毒1min，然后用50％84消毒液(洁阿姨，市售)消毒15min，上下颠倒，使种子与消毒液充分混匀。
[0112] (2)用无菌水清洗种子3-4次后，将种子均匀点播于1/2MS培养基上，在人工培养室中培养10-20天，温度为22℃，湿度为80％，光照强度为80-200μmol/m2/s，光周期为16h光照，8h黑暗。
[0113] (3)取无菌苗叶片，用手术刀将其切割为3-5mm2的外植体，用活化好的农杆菌悬浮液(MS液体培养基+30％蔗糖+100μM乙酰丁香酮)侵染10-30min。
[0114] (4)将侵染后的外植体转移到共培养培养基上(MS+2mM TDZ+1mM 6BA)，在暗光条件下共培养2-3d。
[0115] (5)将共培养的外植体转移到愈伤诱导培养基上(MS+2mM TDZ+1mM 6BA+50mg/L Km+150mg/L Cr)，在光照光条件下共培养15-30d，平均每10天继代一次，直至长出黄绿色愈伤。
[0116] (6)将愈伤转移到分化培养基上(MS+2mM KT+1mM IAA+50mg/L Km+150mg/L Cr)，光照条件培养至分化成苗，每10-15天继代一次。
[0117] (7)将再生植株移栽到生根培养基(MS+1mM NAA+50mg/L Km+150mg/L Cr)进行生根培养。将长成的苜蓿幼苗移栽到营养土中炼苗7-10天后移栽大田隔离棚种植加代。
[0118] (8)参照拟南芥转基因苗的检测方法，利用NPT和35S+MsMBF1c两对引物组合对各个株系进行分子检测。
[0119] 2、MsMBF1c对紫花苜蓿高温与干旱的调节
[0120] (1)选取阳性转基因T1代株系，与野生型紫花苜蓿平行种植于营养土中，在现蕾期进行高温与干旱处理。
[0121] (2)利用人工气候室模拟自然界高温与干旱胁迫环境，设定处理程序为：8:00-8:30开始升温到40℃，维持到17:30,17:30-18:00降温到20℃，维持到次日8:00，并停止浇水。
1周后观察植株受损伤情况，统计死亡率与枯叶数，并拍取照片
1周后观察植株受损伤情况，统计死亡率与枯叶数，并拍取照片
[0122] 结果：转化MsMBF1c基因能显著增强紫花苜蓿对高温和干旱组合胁迫的抵抗能力。
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