技术领域
[0001] 本
发明是关于一种叶绿素荧光成像仪补光装置及其测试方法，涉及叶绿素荧光成像技术领域。
背景技术
[0002] 叶绿素荧光成像系统开启了一种全新的叶绿素荧光测量方式，它的最大优点在于可以检测活体
叶片面积上每个
像素的光合活性，通过叶绿素荧光成像来反映叶片生理状态的异质性。叶绿素荧光成像系统主要由控制单元、LED
光源板、CCD检测器、样品台以及成像分析
软件等组成。LED光源板可以发出红色(或蓝色或远红光)光源，不仅可以提供调制测量光(ML)，还可以提供光化光(AL)和饱和脉冲(SP)，保证叶片表面受光均匀且光强足够强。
[0003] 德国WALZ公司生产的调制叶绿素荧光成像仪IMAGING-PAM，测量功能强大，数据直观可信，操作步骤简单，M系列的IMAGING-PAM更是实现了一个主机可以连接不同的
探头(MICROSCOPY-，MINI-和MAXI-探头)，可以分别在130×150μm、24×32mm和10×13cm的面积上测量荧光成像，满足了从单细胞到整个叶片光系统II的功能研究。其中，MAXI-探头的LED光源含有44个带平行光学校正的超强发光
二极管(LED)，在距光源17-20cm处能产生非常匀质的光场，这些LED提供ML，AL和SP。WALZ公司生产的MAXI-探头的IMAGING-PAM由于成像面积较小，相比其它成像系统可以得到高
精度的成像数据，但是该设备的光源板仅仅配置了单一
波长的光源，极大限制了该设备的应用范围。
发明内容
[0004] 针对上述问题，本发明的目的是提供一种测量范围广的叶绿素荧光成像仪补光装置及其测试方法。
[0005] 为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
[0006] 第一方面，本发明提供一种叶绿素荧光成像仪补光装置，包括红色LED光源，所述红色LED光源的数量与设置方式与现有调制叶绿素荧光成像仪相同，其特征在于，该装置还包括蓝色LED光源、远红光LED光源和控制
电路，所述蓝色LED光源与所述远红光LED光源间隔设置；所述蓝色LED光源布置在第二圈所述红色LED光源和第三圈所述红色LED光源之间，且所述蓝色LED光源排列成一个圆圈，相邻两个所述蓝色LED光源之间的夹
角为45°；所述远红光LED光源布置在第二圈所述红色LED光源和第三圈红所述色LED光源之间，且所述远红光LED光源排列成一个圆圈，相邻两个所述远红光LED光源之间的夹角为45°。
[0007] 进一步地，所述控制电路包括主控电路、跟随电路、加法电路、
信号放大电路、过流保护电路、可调稳压电路、LED驱动电路以及
电压/
电流取样电路；其中，所述可调稳压电路、电压/电流取样电路、过流保护电路和LED驱动电路依次
串联连接形成所述光源的供电电路；所述电压/电流取样电路输出端连接所述信号放大电路和主控电路的输入端，所述主控电路获取所述电压/电流取样电路的电压/电流值并根据设定的光照强度值调节相应所述光源供电电压，所述跟随电路的输入端连接所述主控电路的DA输出端，用于提升带负载能
力使得所述跟随电路
输出电压等于所述主控电路的实际输出电压；所述信号放大电路用于对所述电压/电流取样电路的电流
采样信号进行放大；所述加法电路用于将所述信号放大电路输出电压和所述跟随电路的输出电压进行相加后输出到所述可调稳压电路的反馈端，使得所述可调稳压电路对输出的电压信号进行调整保持所述LED驱动电路恒流。
[0008] 进一步地，所述信号放大电路包括康
铜丝电流采样
电阻和精密
仪表放大器，所述康铜丝电流采样电阻对电流进行采样经过所述精密
仪表放大器进行放大；所述可调稳压电路采用LM2596S-ADJ芯片，通过控制所述LM2596S-ADJ芯片的反馈引脚调控所述LM2596S-ADJ的输出电压，所述加法电路的输出端连接所述LM2596S-ADJ芯片的反馈引脚；所述主控电路采用意法
半导体公司的STM32F103RCT6
单片机控制单元。
[0009] 进一步地，LED驱动电路中的电流I为：
[0010] I＝(1.25-VDA)/(R×G)
[0011] 式中，VDA是所述主控电路的DA引脚输出电压，R所述康铜丝电流采样电阻，G为所述精密仪表放大器的放大倍数。
[0012] 进一步地，所述蓝色LED光源和远红光LED光源前设置有聚光镜。
[0013] 进一步地，所述蓝色光源的波长为480nm，提供的光强最大为350μmol m-2s-1，所述-2 -1远红光光源的波长为730nm，提供的光强最大为50μmol m s 。
[0014] 进一步地，所述蓝色光源和远红外光源的个数均设置为8个，且所述蓝色光源和远红外光源排列形成的圆圈直径为13.5cm，
[0015] 第二方面，本发明还提供一种叶绿素荧光成像仪补光装置的测试方法，包括以下内容：
[0016] A)：测量Fo'
[0017] 将经过暗适应一段时间的
植物放在样品台上，打开光强小于1μmolm-2s-1的红色LED光源作为调制测量光进行照射，得到最小荧光Fo；
[0018] 间隔设定时间后打开光强5000-10000μmolm-2s-1的红色LED光源作为饱和脉冲进行照射，得到最大荧光Fm；
[0019] 间隔设定时间后打开光强100μmolm-2s-1的红色LED光源或者蓝色LED光源作为活化光照射，叶绿素荧光经过一段时间后达到稳定，此时打开饱和脉冲得到光下最大荧光Fm'；
[0020] 间隔设定时间关闭活化光后，关闭活化光同时打开光强12μmolm-2s-1的远红光LED光源按照设定时间照射，叶绿素荧光下降达到最小值即Fo'，关闭远红光LED光源，测量结束；
[0021] B)：同时测量多个活体样品的状态转换
[0022] 将经过暗适应一段时间的植物放在样品台上，打开光强小于1μmolm-2s-1的红色LED光源很弱的调制测量光，得到最小荧光Fo；
[0023] 间隔设定时间后打开一个光强5000-10000μmolm-2s-1的红色LED光源作为饱和脉冲进行照射，得到最大荧光Fm；
[0024] 间隔设定时间后打开红色LED光源或蓝色LED光源作为活化光持续照射设定时间，叶绿素荧光达到稳定，打开光强12μmolm-2s-1的远红光LED光源持续照射设定时间，叶绿素荧光迅速下降并达到稳定，接着打开光强5000-10000μmolm-2s-1的红色LED光源持续照射设定时间，得到状态I下的最大荧光Fm1；
[0025] 间隔设定时间后关闭远红光LED光源，叶绿素荧光先迅速上升之后缓慢下降至稳定状态，按照设定间隔时间打开饱和脉冲持续照射设定时间，得到状态II下的最大荧光Fm2，在设定时间后关闭活化光，测量结束。
[0026] 进一步地，荧光淬灭系数的计算为：
[0027] 光化学淬灭系数qP:qP＝(Fm'-F)/(Fm'-Fo')；
[0028] 光化学淬灭系数qL:qL＝qP×(Fo'/F)；
[0029] 非光化学淬灭系数qN:qN＝1-(Fm'-Fo')/(Fm-Fo)。
[0030] 式中，光化学淬灭系数qP、qL反映PSII反应中心的开放程度，非光化学淬灭系数qN是
环境胁迫的指示剂，是检测早期胁迫最敏感的参数。
[0031] 本发明由于采取以上技术方案，其具有以下优点：1、相对于已有技术每次只能进行一个样本Fo'的测量，本发明实现了多个植物样本Fo'的同步测量，极大地缩短了测量时间。2、本发明实现了活体测量植物状态转换的功能，而且可以同步得到不同处理样本多个状态转换曲线，不仅提高了测量的准确性而且极大地缩短了测量时间，提高了测量效率。3、已有技术每次只能进行一个离体叶片状态转换曲线的测量，离体叶片在长达1小时的测量过程中，其生理活性很难保持在一个较好的状态，本发明可以直观的查看多个测量曲线和荧光参数是否正常，出现问题及时终止，提高了测量效率。本发明可以广泛应用于叶绿素荧光监测中。
附图说明
[0032] 图1是本发明叶绿素荧光成像仪补光装置的结构示意图；
[0033] 图2是本发明的控制电路原理示意图。
具体实施方式
[0034] 以下结合附图来对本发明进行详细的描绘。然而应当理解，附图的提供仅为了更好地理解本发明，它们不应该理解成对本发明的限制。
[0035] 如图1所示，本发明提供的叶绿素荧光成像仪补光装置，包括光源和控制电路，其中，光源包括红色LED光源1、蓝色LED光源2和远红光LED光源3，本发明的红色LED光源1的数量和布置与背景技术提到单一光源的光源板的布置方式相同，本发明不同点在于在现有的红色LED光源1
基础上增加了蓝色LED光源2和远红外LED光源3，本发明在原来的红色LED光源1的缝隙中增加了8个波长约为480nm的蓝色LED光源2，提供的光强最大为350μmol m-2s-1，以及8个波长约为730nm的远红光光源3，提供的光强最大为50μmol m-2s-1，其中，8个蓝色LED光源2布置在原有第2圈和第3圈红色LED光源1之间，蓝色LED光源2排列成一个圆圈，直径13.5cm，相邻两个蓝色LED光源2之间的夹角是45°。8个远红光LED光源3也布置在原有第2圈和第3圈红色LED光源1之间，远红光LED光源3排列成一个圆圈，直径13.5cm，相邻两个远红光LED光源3之间的夹角是45°。8个蓝色LED光源2与8个远红光LED光源3间隔排列，且蓝色LED光源2与远红光LED光源3的间隔距离可以为2.63cm，以此为例，不限于此。
[0036] 优选地，为了使蓝色LED光源1和远红光LED光源3达到足够的光强，可以在蓝色LED光源2以及远红光LED光源3前设置聚光镜。
[0037] 如图2所示，控制电路采用
硬件反馈闭环的方式进行恒流调控，使控制电路在保持恒流的控制上，具有很高的自我调节速度。控制电路包括可调稳压电路41、电压/电流取样电路42、过流保护电路43、LED驱动电路44、主控电路45、信号放大电路46、跟随电路47以及加法电路48。其中，可调稳压电路41、电压/电流取样电路42、过流保护电路43和LED驱动电路44依次串联连接形成光源的供电电路，且电压/电流取样电路42输出端连接主控电路45和信号放大电路46，主控电路45可以采用意法半导体公司的STM32F103RCT6单片机控制单元，主控电路45获取电压/电流取样电路42的电压/电流值并根据设定的光照强度值调节LED驱动电路44所需电压(本发明设置有两路完全独立的恒流源电路作为LED驱动电路分别控制蓝色LED光源1和远红光LED光源3)，跟随电路47的输入端连接主控电路45的DA输出端，用于提升带负载能力使得输出电压信号等于主控电路45的实际输出电压；信号放大电路46用于对电压/电流取样电路42的电流采样值进行放大；加法电路48用于将信号放大电路46和跟随电路47的电压进行相加后输出到可调稳压电路41的反馈端使得可调稳压电路41对输出的电压信号进行调整使得整个LED驱动电路44保持恒流，其中，信号放大电路46包括康铜丝电流采样电阻和精密仪表放大器AD623，康铜丝电流采样电阻是负载电路中电流的采样电阻，该采样电阻上的电压值可以直观的反应负载电路上的电流大小，采样电阻上的电压经过精密仪表放大器AD623进行放大。
[0038] 可调稳压电路41可以采用LM2596S-ADJ芯片，具有最高3A的输出电流，通过控制LM2596S-ADJ的反馈引脚调控LM2596S-ADJ的输出电压，从而控制负载电路中的电流大小。加法电路48得到的输出值作用在LM2596S-ADJ的反馈引脚FB上。由于LM2596S-ADJ的FB引脚为1.25V，当主控电路45输出DA值一定的时候，负载电路中的电流发生改变的时候，通过加法电路48将会引起LM2596S-ADJ的FB引脚的电压变化，从而LM2596S-ADJ的输出电压也会相应的改变，达到负载电路的电流恒定的硬件闭环调节，可以得到下述计算公式：
[0039] I＝(1.25-VDA)/(R G)
[0040] 其中，I为负载电路中的电流，VDA是主控电路的DA引脚输出电压，R为康铜丝电阻，G为AD623的放大倍数。
[0041] 下面通过具体
实施例详细说明本发明的叶绿素荧光成像仪补光装置的实际应用。
[0042] 光合作用是地球上最重要的化学反应，利用
太阳能裂解
水释放出了地球上绝大多数生命活动所需的
氧气，同时固定大气中的CO2合成
葡萄糖为新陈代谢提供
能量。目前叶绿素荧光、气体交换和光合放氧是光合作用研究的三个方面。
[0043] 叶绿素荧光的理论基础来源于光合作用的光反应。在叶绿体类囊体膜上分布着PSII、CYtb6/f(细胞色素b6f
复合体)、PSI、ATPase(腺苷三
磷酸酶)等多个复合体，PSII的捕光色素吸收光能后将能量传递给反应中心叶绿素P680，P680吸收光能后会放出
电子产生强+ +
氧化剂P680 ,P680/P680 的氧化还原电势可以引起H2O裂解放出O2、电子和质子。电子经过Phe(脱镁叶绿素)、QA(PSII原初醌受体)、QB(PSII次级醌受体)等电子传递体后传给质体醌PQ。质体醌PQ每次只能传递2个电子，是光合电子传递链的限速步骤，因此PQ被称为电子
门。
此后电子继续传递经过CYtb6/f和PSI后将NADP+(氧化型辅酶Ⅱ)还原得到还原力NADPH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，辅酶II)。在PSII裂解水时会释放出质子，在PQ处经过PQ循环会从基质中转运质子到类囊体腔中，这样在类囊体膜两侧就形成一个质子梯度。类囊体腔中的质子可以经过ATPase的质子通道回到基质中，在这个过程中会促进基质中的ADP(腺嘌呤核苷二磷酸)转
化成ATP(腺嘌呤核苷三磷酸)。由此，经过光反应产生的NADPH和ATP会参与Calvin循环，固定CO2合成葡萄糖。
[0044] 细胞内的叶绿素分子通过直接吸收光量子或间接通过捕光色素吸收光量子得到能量后，从基态(低能态)跃迁到激发态(高能态)。由于波长越短能量越高，故叶绿素分子吸收红光后，电子跃迁到最低激发态；吸收蓝光后，电子跃迁到比吸收红光更高的能级(较高激发态)。处于较高激发态的叶绿素分子很不稳定，在几百飞秒内，通过振动弛豫向周围环境
辐射热量，回到最低激发态。最低激发态的叶绿素分子可以稳定存在几纳秒。处于较低激发态的叶绿素分子可以通过几种途径释放能量回到稳定的基态：1)重新放出一个
光子，回到基态，即产生荧光；2)不放出光子，直接以热的形式耗散掉；3)将能量从一个叶绿素分子传递到邻近的另一个叶绿素分子，能量在一系列叶绿素分子之间传递，最后到达PSII反应中心，反应中心叶绿素分子通过电荷分离将能量传递给电子受体，从而进行光化学反应。以上三个过程是相互竞争的，当光合
生物处于正常的生理状态时，天线色素吸收的光能绝大部分用来进行光化学反应，荧光和热只占很小的一部分。
[0045] 1931年，Kautsky和Hirsch发现了叶绿素荧光诱导现象，他们将暗适应的叶子照光后，发现叶绿素荧光强度随时间而变化，并与CO2的固定有关。所以叶绿素荧光诱导是光照射植物的叶或其它含叶绿素材料时所产生的荧光随时间变化的现象。目前检测叶绿素荧光的仪器是脉冲-振幅-调制荧光仪(PAM)。调制技术是指用于激发荧光的测量光(ML)具有一定的调制(开/关)
频率，检测器只记录与测量光同频的荧光，因此调制荧光仪允许测量所有生理状态下的荧光。饱和脉冲技术是指打开一个持续时间很短(一般小于1s)的强光关闭所有的电子门(光合作用被暂时抑制)，从而使叶绿素荧光达到最大。
[0046] 实施例1：测量Fo'(蓝色LED光源2在测量过程中提供活化光)
[0047] 将经过暗适应(30min)的植物放在样品台上，打开很弱的调制测量光(ML，光强小于1μmolm-2s-1)，得到最小荧光Fo；
[0048] 5s后打开一个饱和脉冲(SP,持续800ms，光强5000-10000μmolm-2s-1)得到最大荧光Fm；
[0049] 40s后打开活化光(AL，红光或者蓝光，持续时间3-5min,光强100μmolm-2s-1)，叶绿素荧光经过几分钟(3-5min)后达到稳定，此时打开饱和脉冲，得到光下最大荧光Fm'，30s后关闭活化光。关闭活化光同时打开远红光LED光源3(FR，约持续5s，光强12μmolm-2s-1)，叶绿素荧光下降达到最小值即Fo'，关闭远红光LED光源3，测量结束。
[0050] 测量光的作用：当植物处于黑暗中时，PSII不再释放电子，但是累积在PQ(电子门)处的电子会逐渐向PSI传递。经过足够长的暗适应后，PQ处没有任何电子时，所有PSII的反应中心全部处于开放状态。此时如果打开一个很弱的调制测量光(ML)只激发色素的本底荧光但不足以引起任何的光合作用，就得到最小荧光Fo。
[0051] 饱和脉冲的作用：关闭所有的电子门(光合作用被暂时抑制)，植物吸收的光能只能以叶绿素荧光和热的形式耗散，此时检测到的叶绿素荧光达到最大值，即Fm。
[0052] 活化光的作用：引发植物进行光合作用(植物实际吸收利用进行光合作用的可见光400-700nm)。活化光打开后，植物吸收光能，PSII瞬间释放大量电子，导致许多电子门被关闭，实时荧光迅速上升。由于光合器官会迅速启动调节机制来适应这种光照状态，PSI逐渐从PQ处要电子。随着时间的延长，处于关闭态的电子门越来越少，实时荧光逐渐下降并达到稳态，活化光的强度可根据待测植物的生长光强不同进行调节。
[0053] 远红光作用：激发PSI，促进PSI迅速吸收积累在电子门处的电子，使电子门在很短的时间内回到开放状态，叶绿素荧光达到最小值即Fo’。
[0054] 远红光会优先激发光系统I(PSI，是整合于光合膜上的由多个蛋白亚基组成的色素蛋白复合物，它在光合电子传递链中催化电子从PC经过一系列电子传递体到Fd的传递，光系统(photosystem，PS)，是进行光吸收的功能单位，是由叶绿素、类胡萝卜素、脂和
蛋白质组成的复合物)并且快速地将PSII与PSI之间累积的电子传递下去，从而促使PSII反应中心再次完全开放，通过测量Fo'以及其它荧光参数，可以推导出三个重要的荧光淬灭系数：
[0055] 光化学淬灭系数qP:qP＝(Fm'-F)/(Fm'-Fo')；
[0056] 光化学淬灭系数qL:qL＝qP×(Fo'/F)；
[0057] 非光化学淬灭系数qN:qN＝1-(Fm'-Fo')/(Fm-Fo)。
[0058] 式中，光化学淬灭系数qP、qL可以反映PSII反应中心的开放程度，非光化学淬灭系数qN是环境胁迫的指示剂，是检测早期胁迫最敏感的参数。因此Fo'的准确测量，对研究植物光合作用以及植物对环境胁迫的响应是非常有意义的。但是现有的MAXI-探头的IMAGING-PAM没有设置远红光光源，无法直接测得Fo'，而采用公式近似估算出Fo'的值：Fo'＝Fo/(Fv/Fm+Fo/Fm')，本发明通过设置远红光LED光源可以直接测量活体样品的Fo'。
[0059] 实施例2：同时测量多个活体样品的状态转换(蓝色LED光源2在测量过程中提供活化光)
[0060] 将经过暗适应(30min)的植物放在样品台上，打开很弱的调制测量光(ML，光强小于1μmolm-2s-1)，得到最小荧光Fo；
[0061] 5s后打开饱和脉冲(SP,持续800ms，光强5000-10000μmolm-2s-1)，得到最大荧光Fm；
[0062] 40s后打开活化光(AL,持续时间15min,光强100μmolm-2s-1)，约15min后叶绿素荧光达到稳定，此时打开远红光LED光源3(FR，持续时间15min,光强12μmolm-2s-1)，叶绿素荧光迅速下降并在15min后达到稳定，接着打开饱和脉冲(SP,持续800ms，光强5000-10000μmolm-2s-1)，得到状态I下的最大荧光Fm1，30s后远红光LED光源3关闭，叶绿素荧光先迅速上升之后缓慢下降至稳定状态，15min后打开饱和脉冲(SP,持续800ms，光强5000-10000μmolm-2s-1)，得到状态II下的最大荧光Fm2，30s后活化光关闭,30s后关闭饱和脉冲，测量结束。
[0063] 状态转换的调节机理：在不同光强条件下，植物的PSII和PSI之间的能量分配不均衡，引起不同的能量分配，当PSII被能量溢出时，发生LHCII(光系统II的捕光色素蛋白复合体)的磷
酸化，而磷酸化的LHCII从富含PSII的基粒膜区迁移到富含PSI的间质膜区或基粒的边缘膜区并与PSI结合，光合机构向状态II转换；当PSI被过度激发时，LHCII激酶失活导致磷酸化的LHCII脱磷酸化，脱磷酸化的LHCII重新迁移回到PSII区域与PSII结合，光合机构向状态I转换。LHCII通过磷酸化和脱磷酸化参与两个光系统之间激发能分配的调节，此过程由PQ库的氧化还原状态控制的LHCII激酶所调节。当PQ库处于还原状态时，磷酸化的LHCII从PSII迁移并结合到PSI，从而减小PSII的光吸收截面，增大PSI的光吸收截面，使能量有利于向PSI的分配；当PQ库被氧化时，去磷酸化的LHCII又结合到PSII，使能量有利于向PSII分配。
[0064] 上述各参数的具体解释：Fo：暗适应后的最小荧光；Fm:暗适应后的最大荧光；Fo'：光适应下的最小荧光；Fm1：测量状态I时的最大荧光产量；Fm2：测量状态II时的最大荧光产量；Fi和Fii：分别指在状态I和状态II时的远红光打开时的实时荧光；Fi′和Fii′：分别指在状态I和状态II时的远红光关闭时的实时荧光；ML：光强小于1μmolm-2s-1的红色LED光源；
SP：光强5000-10000μmolm-2s-1的红色LED光源；AL：红色LED光源或者蓝色LED光源；FR：远红光LED光源。
[0065] 本发明的叶绿素荧光成像仪补光装置增加蓝色LED光源2和远红光LED光源3，不仅可以同时测量多个活体样品的状态转换，而且可以直观的查看测量曲线和荧光参数是否正常，出现问题及时终止程序，这不仅提高了测量的准确性而且极大地缩短了测量时间，提高了测量效率。
[0066] 上述各实施例仅用于说明本发明，其中各部件的结构、连接方式和制作工艺等都是可以有所变化的，凡是在本发明技术方案的基础上进行的等同变换和改进，均不应排除在本发明的保护范围之外。
