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利用荧光定量PCR技术鉴定陆地棉品种抗黄萎病的基因及方法

阅读：251发布：2024-01-30

专利汇可以提供利用荧光定量PCR技术鉴定陆地棉品种抗黄萎病的基因及方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了利用荧光定量PCR技术鉴定陆地棉品种抗黄萎病的基因及方法，所述基因见序列表中的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。鉴定步骤包括：①待测棉花品种营养钵培养室育苗；②黄萎病病菌培养；③浸根接种；④总RNA提取；⑤cDNA合成；⑥与陆地棉抗性相关关键基因和内参基因GhACTIN14的荧光定量PCR特异引物的合成；⑦荧光定量PCR检测；⑧结果分析。本发明能够在陆地棉品种6叶期就可鉴定其对黄萎病的抗性，鉴定结果可靠，准确率可达100％，并且操作简便易行。，下面是利用荧光定量PCR技术鉴定陆地棉品种抗黄萎病的基因及方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.陆地棉品种抗黄萎病鉴定相关基因，其特征在于包括序列表中SEQ ID NO：1所示的多向耐毒性基因和SEQ ID NO：2所示的转录子基因。
2.陆地棉品种抗黄萎病鉴定相关基因的PCR扩增特异引物，其特征在于多向耐毒性基因的特异引物上游序列见SEQ ID NO：3，下游序列见SEQ ID NO：4；转录子基因特异引物上游序列见SEQ ID NO：5，下游序列见SEQ ID NO：6。
3.利用荧光定量PCR技术鉴定陆地棉品种抗黄萎病的方法，其特征在于包括如下步骤：
①待测棉花品种营养钵培养室育苗；②黄萎病病菌培养；③病菌浸根接种：用步骤②培养的病菌菌液对步骤①育成的幼苗进行浸根接种；④总RNA提取：摘取步骤③中被病菌侵染过的幼苗嫩片，提取叶片总RNA；⑤cDNA合成；⑥与陆地棉抗性相关关键基因即SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示基因，以及内参基因GhACTIN14的荧光定量PCR特异引物的合成；⑦荧光定量PCR检测；⑧结果分析。
4.根据权利要求3所述的利用荧光定量PCR技术鉴定陆地棉品种抗黄萎病的方法，其特征在于步骤①所述的待测棉花品种营养钵培养室育苗采用塑料周转箱内纸质营养钵培养室育苗，培养条件：平均温度28℃左右，每天保持光照14个小时。
5.根据权利要求3所述的利用荧光定量PCR技术鉴定陆地棉品种抗黄萎病的方法，其特征在于步骤③所述的病菌浸根接种，是指当待测棉花品种幼苗长至6叶期开始进行病菌浸根接种，病菌孢子浓度为106-108个/ml的孢子悬浮液。
6.根据权利要求3所述的利用荧光定量PCR技术鉴定陆地棉品种抗黄萎病的方法，其特征在于步骤④所述的总RNA提取，提取的是病菌接种侵染0h和48h时的幼苗嫩片中的总RNA。
7.根据权利要求3所述的利用荧光定量PCR技术鉴定陆地棉品种抗黄萎病的方法，其特征在于步骤⑤所述的cDNA合成反应体系为步骤④中提取的总RNA 2ul，Anchored oligo(dT)18primer(0.5ug/ul)1ul，2×TS Reaction Mix 10ul，Transcript RT/R1 Enzyme Mix
1ul，gDNA Remover 1ul，Rnase-free water 5ul。
8.根据权利要求3所述的利用荧光定量PCR技术鉴定陆地棉品种抗黄萎病的方法，其特征在于步骤⑥所述的与陆地棉抗性相关关键基因和内参基因GhACTIN14的的荧光定量PCR特异引物的合成，合成引物GC含量50％，Tm在60℃-62℃，长度18-22个核苷酸，扩增片段80-
150bp；合成的多向耐毒性基因特异引物序列：上游序列见SEQ ID NO：3，下游序列见SEQ ID NO：4；合成的lateral organ boundaries domain family protein转录子基因特异引物序列：上游序列见SEQ ID NO：5，下游序列见SEQ ID NO：6；合成的内参基因GhACTIN14特异引物序列：上游序列见SEQ ID NO：7，下游序列见SEQ ID NO：8。
9.根据权利要求3所述的利用荧光定量PCR技术鉴定陆地棉品种抗黄萎病的方法，其特征在于步骤⑦所述的荧光定量PCR检测，反应体系为 Premix Ex Taq TM 10ul，步骤⑥中合成的相应被检测基因的特异上游引物(10pm/ul)0.4ul，下游引物(10pm/ul)
0.4ul，ROX Reference Dye 0.4ul，灭菌蒸馏水7.8ul，cDNA 2ul。RT-PCR反应程序：预变性
95℃，30s；95℃，5s，60℃，34s，40个循环。
10.根据权利要求3所述的利用荧光定量PCR技术鉴定陆地棉品种抗黄萎病的方法，其特征在于步骤⑧结果分析所依据的检测标准是，利用荧光定量PCR数据采用相对定量2-ΔΔCt法，在接种黄萎病菌后48h多向耐毒性基因相对表达量倍值大于2和lateral organ boundaries domain family protein转录子基因相对表达量倍值小于1的判定为抗病品种；在接种黄萎病菌后48h多向耐毒性基因相对表达量倍值小于1和lateral organ boundaries domain family pr tein转录子基因相对表达量倍值大于2的判定为感病品种。

说明书全文

利用荧光定量PCR技术鉴定陆地棉品种抗黄萎病的基因及

方法

技术领域

[0001] 本发明属于棉花育种领域，涉及鉴定陆地棉品种抗黄萎病的基因及方法，具体地说，涉及利用荧光定量PCR技术鉴定陆地棉品种抗黄萎病的基因及方法。

背景技术

[0002] 棉花黄萎病是由大丽轮枝菌引起的影响陆地棉品种最严重的病害之一，由于缺乏有效的化学防治药剂，只有依赖棉花品种抗性的提高来减少产量损失，因此棉花品种抗黄萎病鉴定是培育抗黄萎病品种的必要手段。目前用于棉花品种黄萎病抗性鉴定方法主要有两大类，一类是田间鉴定方法，如自然病圃鉴定和人工病圃鉴定；一类是室内苗期鉴定方法，如裸根蘸菌法、针刺接菌法、纸钵撕底法、无底塑钵菌液浇根法和毒素鉴定。

[0003] 田间鉴定方法中人工病圃鉴定被认为是最接近自然实际，最为可靠的抗病鉴定方法，在抗病育种过程中应用最为普遍，但此鉴定方法受鉴定病圃限制，并易受气候条件的影响，一般需要2-3年重复鉴定才能出结果，历时太长。温室病圃鉴定也需要半年左右的时间，鉴定时间长，不能做到早期诊断。

[0004] 室内苗期鉴定方法目前应用最多的主要有纸钵撕底法、无底塑钵菌液浇根法等，但由于这些方法伤根程度很难做到统一，致使实验产生误差(简桂良，2001.简桂良,孙文姬,马存.棉花黄萎病抗性鉴定新方法--无底塑钵菌液浇根法[J].棉花学报,2001,13(2):67-69.)。而针刺接菌法使黄萎病菌强制侵入到棉株维管束系统，违背了病菌在自然条件下的侵染规律，使棉花自身的部分防卫系统失效，不能客观反映鉴定材料的抗性(史认辉.棉花抗黄萎病鉴定技术研究.华中农业大学硕士学位论文,2010))。毒素鉴定法，需要提取粗毒素，较繁琐，且与上述方法相比，棉苗往往表现为发病偏重(杜威世，2003，杜威世.棉花黄萎病抗性遗传及分子标记研究.[硕士学位论文〕.保定：河北农业大学图书馆，2003)。

[0005] 郭宝生等(郭宝生,王凯辉,刘素恩,赵存鹏,耿军义,张香云,华金平.陆地棉抗黄萎病种质创新与抗病基因挖掘.棉花学报,2014,26(3):252-259.)研究表明，陆地棉植株受到黄萎病菌侵染后，植株内部会形成物理障碍或生化障碍来遏制棉花黄萎病菌在体内扩展，但是由于不同品种的抗病基因表达调控水平不一，从而出现抗病差异。与黄萎病抗性相关基因主要有植物抗毒素合成相关基因、植株组织结构防御蛋白相关基因等。这种黄萎病菌侵染下不同陆地棉品种抗病相关基因的表达差异可以通过荧光定量PCR技术进行检测((郭宝生，师恭曜，等，黄萎病菌侵染下棉花Dirigent-like蛋白基因表达差异分析.中国农业科学,2014,47(22):4349-4359.)。荧光定量PCR技术(Bustin S A，Benes V，Nolan T，Pfaffl M W.Quantitative real-time RT-PCR-A perspective.Journal of Molecular Endocrinology，2005,34:597-601.)是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时监控反应过程。随着PCR反应的进行，反应产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化。

发明内容

[0006] 本发明的目的就是为了避免上述田间和室内苗期鉴定方法的缺陷，提供利用荧光定量PCR技术鉴定陆地棉品种黄萎病抗性的基因及方法。本发明是在棉花品种幼苗6叶期，利用与陆地棉受黄萎病菌侵染下2个抗性相关关键基因，即植物抗毒素合成相关基因类---多向耐毒性基因和植株组织结构防御蛋白相关基因---lateral organ boundaries domain family protein转录子荧光定量的表达差异鉴定出陆地棉品种是否为抗黄萎病品种。

[0007] 陆地棉品种抗黄萎病鉴定相关基因，其包括序列表中SEQ ID NO：1所示的多向耐毒性基因和SEQ ID NO：2所示的转录子基因。

[0008] 陆地棉品种抗黄萎病鉴定相关基因的PCR扩增特异引物，多向耐毒性基因的特异引物上游序列见SEQ ID NO：3，下游序列见SEQ ID NO：4；转录子基因特异引物上游序列见SEQ ID NO：5，下游序列见SEQ ID NO：6。

[0009] 利用荧光定量PCR技术鉴定陆地棉品种抗黄萎病的方法，该方法包括如下步骤：①待测棉花品种营养钵培养室育苗；②黄萎病病菌培养；③病菌浸根接种：用步骤②培养的病菌菌液对步骤①育成的幼苗进行浸根接种；④总RNA提取：摘取步骤③中被病菌侵染过的幼苗嫩片，提取叶片总RNA；⑤cDNA合成；⑥与陆地棉抗性相关关键基因即SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示基因，以及内参基因GhACTIN14的荧光定量PCR特异引物的合成；⑦荧光定量PCR检测；⑧结果分析。

[0010] 步骤①所述的待测棉花品种营养钵培养室育苗采用塑料周转箱内纸质营养钵培养室育苗，培养条件：平均温度28℃左右，每天保持光照14个小时。

[0011] 步骤③所述的病菌浸根接种，是指当待测棉花品种幼苗长至6叶期开始进行病菌浸根接种，病菌孢子浓度为106-108个/ml的孢子悬浮液。

[0012] 步骤④所述的总RNA提取，提取的是病菌接种侵染0h和48h时的幼苗嫩片中的总RNA；

[0013] 步骤⑤所述的cDNA合成反应体系为步骤④中提取的总RNA 2ul，Anchored oligo(dT)18 primer(0.5ug/ul)1ul，2×TS Reaction Mix 10ul，Transcript RT/R1 Enzyme Mix 1ul，gDNA Remover 1ul，Rnase-free water 5ul。

[0014] 步骤⑥所述的与陆地棉抗性相关关键基因和内参基因GhACTIN14的的荧光定量PCR特异引物的合成，合成引物GC含量50％，Tm在60℃-62℃，长度18-22个核苷酸，扩增片段80-150bp；合成的多向耐毒性基因特异引物序列：上游序列AAGGCTGACGATAGGAGAAATG(SEQ ID NO：3)，下游序列GAAAGGTGGTGGAGCTATCTAAG(SEQ ID NO：4)；合成的lateral organ boundaries domain family protein转录子基因特异引物序列：上游序列
AGCTATTCAAACCCACCATGT(SEQ ID NO：5)，下游序列GGCTCTTCTGGTGGGAAATAG(SEQ ID NO：
6)；内参基因GhACTIN14特异引物序列：上游序列CTTATGTTGCCCTGGACTATGA(SEQ ID NO：7)，下游序列CGGAATCTCTCAGCTCCAATAG(SEQ ID NO：8)。

[0015] 步骤⑦所述的荧光定量PCR检测，反应体系为 Premix Ex Taq TM 10ul，步骤⑥中合成的相应被检测基因的特异上游引物(10pm/ul)0.4ul，下游引物(10pm/ul)0.4ul，ROX Reference Dye 0.4ul，灭菌蒸馏水7.8ul，cDNA 2ul。RT-PCR反应程序：预变性
95℃，30s；95℃，5s，60℃，34s，40个循环。

[0016] 步骤⑧结果分析所依据的检测标准是，利用荧光定量PCR数据采用相对定量2-ΔΔCt法，在接种黄萎病菌后48h多向耐毒性基因相对表达量倍值大于2和lateral organ boundaries domain family protein转录子相对表达量倍值小于1的判定为抗病品种；在接种黄萎病菌后48h多向耐毒性基因相对表达量倍值小于1和lateral organ boundaries domain family protein转录子相对表达量倍值大于2的判定为感病品种。

[0017] 本发明的有益技术效果：

[0018] (1)早期诊断。在陆地棉幼苗6叶期，即棉花播种育苗20天内就可鉴定出其抗性。

[0019] (2)可靠、准确。本发明从基因表达水平揭示陆地棉品种的抗病性，可靠性高；同时针对2个基因进行检测，提高了鉴定准确度，鉴定结果准确度达到100％。

[0020] (3)简便易行。本发明所使用的关键基因荧光定量PCR特异引物由专业公司合成，所用仪器设备为一般的分子生物学实验室都具备，所用试剂亦为通用试剂，无需单独配制，按照本发明操作步骤，一般科研人员都能进行陆地棉品种的抗性鉴定。附图说明

[0021] 图1是育苗用的纸质营养钵和塑料周转箱示意图；图中，①为塑料箱；②为营养钵。

[0022] 图2是抗病品种冀79和感病种质TM-1受黄萎病菌侵染0h-96h时的多向耐毒性基因荧光定量相对表达量。

[0023] 图3是抗病品种冀79和感病种质TM-1受黄萎病菌侵染0h-96h时的lateral organ boundaries domain family protein转录子基因荧光定量相对表达量。

[0024] 图4是冀228棉花品种受黄萎病菌侵染0h、96h时多向耐毒蛋白基因及lateral organ boundaries domain family protein的荧光定量相对表达量。

[0025] 图5是冀122棉花品种受黄萎病菌侵染0h、96h时多向耐毒蛋白基因及lateral organ boundaries domain family protein的荧光定量相对表达量。

[0026] 图6是冀1096棉花品种受黄萎病菌侵染0h、96h时多向耐毒蛋白基因及lateral organ boundaries domain family protein的荧光定量相对表达量。

[0027] 图7是邯885棉花品种受黄萎病菌侵染0h、96h时多向耐毒蛋白基因及lateral organ boundaries domain family protein的荧光定量相对表达量。

[0028] 下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不以任何方式限制本发明的范围。

具体实施方式

[0029] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。陆地棉转录组样品高通量测序和所用特异荧光定量PCR特异引物均由生工生物工程上海有限公司合成。所用primer express3.0 软件为Applied Biosystems公司。抗黄萎病品种冀79(郭宝生等，棉花种间杂交渐渗系抗黄萎病性状遗传分析。华北农学报，2008，23(s)：240-243)由河北省农林科学院棉花研究所提供，感黄萎病棉花品系TM-1由中国农业科学院棉花研究所提供，冀1096(郭宝生等，棉花种间杂交渐渗系抗黄萎病性状遗传分析。华北农学报，2008，23(s)：240-243)、冀228、冀122陆地棉品种由河北省农林科学院棉花研究所提供，邯885由邯郸市农业科学院提供。

[0030] 实施例1、陆地棉抗黄萎病关键基因的获得

[0031] 1)育苗：分别取经硫酸脱绒健壮的待检陆地棉抗黄萎病品种冀79、感黄萎病品系TM-1的种子，采用塑料周转箱内纸质营养钵(见图1)培养室育苗。育苗基质蛭石高温灭菌(温度121℃，压强0.6Mpa，1小时)，用水湿润，使基质含水量达到自身重量的60％为宜，每钵播种3粒，幼苗出苗后每钵仅留1株壮苗。营养液采用1倍的Hoagland营养液(硝酸钙945mg/L，硝酸钾607mg/L，磷酸铵115mg/L，硫酸镁493mg/L，铁盐溶液2.5ml/L，微量元素5ml/L，pH＝6.0；铁盐溶液：七水硫酸亚铁2.78g，乙二胺四乙酸二钠(EDTA·Na)3.73g，蒸馏水500ml，pH＝5.5；微量元素液：碘化钾0.83mg/L，硼酸6.2mg/L，硫酸锰22.3mg/L，硫酸锌8.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L)浸润培养。第一片真叶展开后，将配制的Hoagland营养液，倒入装有纸质营养钵外的塑料周转箱内，使营养液由营养钵底部缓慢浸润基质，周转箱内底部营养液高度保持1cm左右。培养室培养条件：平均温度28℃左右(昼温30-32℃、夜温26-28℃)，每天保持光照14个小时。

[0032] 2)病菌培养：将4℃冷藏保存的黄萎病菌强致病力菌系Vd991(中国农业科学院植物保护研究所提供)转移至PDA平面培养基中，于25℃培养箱中培养7-10d，然后将菌落打成合适大小的菌块，接种于盛有Czapeak’s培养液(NaNO3 2g，K2HPO4 1g，KCl 0.5g，MgSO4 0.5g，FeSO4 0.01g，蔗糖30g，琼脂15g，水1000ml；121.3℃，灭菌20分钟)的三角瓶中，
110rpm/min 25℃条件下振荡培养7d后，4℃冷藏备用。

[0033] 3)病菌接种：当冀79和TM-1品种的幼苗长至6片真叶时，分别取步骤1)中育成的冀79品种幼苗20钵和TM-1品种20钵，并各分成实验组和对照组两组，每组10株。取上述步骤2)中培养的菌液用纱布过滤，在显微镜下统计滤液孢子数，在另一干净的塑料周转箱内用无菌水配制成孢子浓度约为1×107个/ml的孢子悬浮液，立即将两品种的实验组幼苗带营养钵转入孢子悬浮液中浸根接种，1小时后用纯净水清洗掉营养钵外部和植株表面的孢子悬浮液，并将其转入干净的周转箱中继续培养。对照组幼苗带营养钵在纯净水浸根1小时后，同样将其转入干净的周转箱中继续培养。

[0034] 4)总RNA提取：随机选取5株实验组被病菌接种侵染的待测棉花品种96小时的植株幼嫩叶片，利用改良的CTAB法(胡根海,喻树迅.利用改良的CTAB法提取棉花叶片总RNA.棉花学报,2007,19(1):69-70.)提取叶片总RNA，同时用同样的方法提取对照组棉花植株的幼嫩叶片的总RNA。将提取的实验组和对照组样品的总RNA浓度分别利用超微量核酸蛋白测定仪检测总RNA浓度，并用ddH2O稀释到100ug/ml，零下20℃条件储藏备用。

[0035] 5)陆地棉转录组样品高通量测序与抗黄萎病相关基因的获得：将步骤4)中侵染96小时的RNA提取液提供给上海生物工程有限公司，由上海生物工程有限公司利用Illumina公司Hiseq2000测序平台进行测序，并将得到的序列与公共数据库进行同源性搜索、比较、基因功能注释和分类。RNA-Seq测序及相关数据前期分析工作由上海生物工程公司完成。

[0036] 最终得到了有效RNA-seq数据共2.2亿条，数据量21G，平均长度95.12bp；单个样本测序数据量均在4G以上。通过拼接、冗余去除，得到了143973个Unigene。进行KOG(Eukaryotic Orthologous Groups of proteins，真核生物的同源蛋白质组)功能分类预测(见表1)，共有18544个Unigene被注释上25种KOG分类。对Unigene进行GO(gene ontology是基因本体联合会Gene Onotology Consortium所建立的数据库)功能分类预测(见表2)，有47702个Unigene被注释上GO分类。

[0037] 表1 KOGs功能分类

[0038]

[0039]

[0040] 表2 GO功能分类

[0041]

[0042]

[0043]

[0044] 使用IDE6software对差异基因进行检测选用General Chi squared假设检验方法，并对检验结果进行FDR(false discovery rate)矫正，控制FDR低于0.01，并且基因的最高表达量达到最低表达量的2倍时，认为该基因为差异基因。对筛选出的差异表达的基因做表达模式聚类分析，将具有相同或相似表达行为的基因进行聚类。利用Unigene序列与各类基因功能数据库比对分别做Unigene的GO功能富集注释，Kegg(京都基因与基因组百科全书)代谢通路富集注释，COG(Cluster of Orthologous Groups of proteins，蛋白相邻类的聚簇)功能富集分析等基因功能注释。实验组(被黄萎病菌侵染)与对照组(没有被黄萎病菌侵染)样品之间差异表达转录本分析表明，抗病品种冀79和TM-1共同上调的Unigene252个，冀79单独上调的527个，TM-1单独上调的5490个；其中共同下调的144个，冀79单独下调的485个，TM-1单独下调的701个。而GO注释到的抗感品种共同上调的Unigene 168个，冀79单独上调的255个，TM-1单独上调的2582个；抗感品种共同下调的Unigene 78个，冀79单独下调的196个，而TM-1单独下调的363个。抗病品种冀79黄萎病菌侵染后转录本差异极其显著的10个代谢途径主要涉及苯丙烷合成途径、半乳糖代谢、氨基苯甲酸代谢、黄酮类黄酮合成代谢途径、双萜类代谢途径等(如表3)。对这些差异极其显著代谢途径中关键基因筛选，发现多向耐毒性基因(见序列表SEQ ID NO.1)和lateral organ boundaries domain family protein转录子(见序列表SEQ ID NO.2)2个基因在陆地棉抗黄萎病中具有重要作用。多向耐毒性基因的表达产物PDR蛋白可能通过转运内源性抗真菌二萜类物质参与植物防御反应(Simon G.，the LR34 protein resembles ATP-binding cassette transporters of the pleiotropic drug resistance subfamily.Science，2009，DOI:10.1126/science.1166453；Stukkens Y,Bultreys A,Grec S,et al.NpPDR1,a pleiotropic drug resistance-type ATP-binding cassette transporter from Nicotiana plumbaginifolia,plays a major role in plant pathogen defense.Plant Physiol,2005,139(1):341-52)。而lateral organ boundaries domain family protein转录子在拟南芥防御反应的茉莉酸信号传导途径中可以被视作感病基因(Thatcher LF,Powell JJ,Aitken EA,Kazan K,Manners JM.The lateral organ boundaries domain transcription factor LBD20 functions in Fusarium wilt Susceptibility and jasmonate signaling in Arabidopsis.Plant Physiol，2012，160(1):407-18.)。

[0045] 表3 抗病品种冀79黄萎病菌侵染后转录本差异极其显著的代谢途径

[0046]

[0047] 实施例2：多向耐毒性基因、lateral organ boundaries domain family protein转录子和内参基因GhACTIN14荧光定量PCR特异引物的合成

[0048] 利用primer express3.0软件(Primer_Express_v3.0_中文操作手册，Applied Biosystems公司)根据实施例1步骤5)获得的多向耐毒性基因和lateral organ boundaries domain family protein转录子以及已知的内参基因GhACTIN14(GenBank Accession Number:AY305733)的核苷酸顺序设计特异的荧光定量PCR引物，引物GC含量50％，Tm在60℃-62℃，长度18-22个核苷酸，扩增片段80-150bp。委托上海生物工程公司完成(见表4)。

[0049] 表4 多向耐毒性基因、lateral organ boundaries domain family protein转录子和内参基因GhACTIN14荧光定量PCR特异引物序列

[0050]

[0051] 实施例3：与陆地棉抗性相关关键基因多向耐毒性基因和lateral organ boundaries domain family protein转录子检测标准的获得

[0052] 本实施例利用抗黄萎病品种冀79和感黄萎病棉花品系TM-1品种作为定标的检测样品。

[0053] 1)育苗：取经硫酸脱绒健壮的抗黄萎病品种冀79和感黄萎病棉花品系TM-1的种子，采用塑料周转箱内纸质营养钵培养室育苗。育苗基质蛭石高温灭菌(温度121℃，压强0.6Mpa，1小时)，用水湿润，使基质含水量达到自身重量的60％为宜，每钵播种3粒，幼苗出苗后每钵仅留1株壮苗。营养液采用1倍的Hoagland营养液(硝酸钙945mg/L，硝酸钾607mg/L，磷酸铵115mg/L，硫酸镁493mg/L，铁盐溶液2.5ml/L，微量元素5ml/L，pH＝6.0；铁盐溶液：
七水硫酸亚铁2.78g，乙二胺四乙酸二钠(EDTA·Na)3.73g，蒸馏水500ml，pH＝5.5；微量元素液：碘化钾0.83mg/L，硼酸6.2mg/L，硫酸锰22.3mg/L，硫酸锌8.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L)浸润培养。第一片真叶展开后，将配制的Hoagland营养液，倒入装有纸质营养钵外的塑料周转箱内，使营养液由营养钵底部缓慢浸润基质，周转箱内底部营养液高度保持1cm左右。培养室培养条件：平均温度28℃左右(昼温30-32℃、夜温26-28℃)，每天保持光照14个小时。

[0054] 2)病菌培养：同实施例1步骤2)。

[0055] 3)病菌浸根接种：当待测品种冀79和TM-1幼苗长至6片真叶时，取步骤2)中培养的菌液用纱布过滤，在显微镜下统计滤液孢子数，在另一干净的塑料周转箱内用无菌水配制成孢子浓度约为1×107个/ml的孢子悬浮液，立即取步骤1)中20钵幼苗带营养钵转入孢子悬浮液中浸根接种。1小时后用纯净水清洗掉营养钵外部和植株表面的孢子悬浮液，并将其转入干净的周转箱中继续培养。

[0056] 4)总RNA提取：分别随机选取5株被病菌接种侵染的待测冀79和TM-1棉花品种0小时、1小时、8小时、24小时、48小时、72小时、96小时的植株幼嫩叶片，利用改良的CTAB法(胡根海,喻树迅.利用改良的CTAB法提取棉花叶片总RNA.棉花学报,2007,19(1):69-70.)提取叶片总RNA。将提取的待测品种侵染样品总RNA浓度分别利用超微量核酸蛋白测定仪检测总RNA浓度，并用ddH2O稀释到100ug/ml，零下20℃条件储藏备用。

[0057] 5)cDNA合成：分别利用步骤4)中提取的被侵染的冀79和TM-1品种0小时、1小时、8小时、24小时、48小时、72小时、96小时总RNA，采用北京全式金生物技术公司的TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix反转录试剂盒生成第一链cDNA用作荧光定量PCR的模板，同时去除步骤4)中提取的总RNA中基因组DNA。反应体系为：总RNA 2ul，Anchored oligo(dT)18primer(0.5ug/ul)1ul，2×TS Reaction Mix 10ul，Transcript RT/R1 Enzyme Mix 1ul，gDNA Remover 1ul，Rnase-free water 5ul。轻轻混匀后，42℃孵育30min。85℃加热5min失活TransScript RT。

[0058] 6)荧光定量PCR检测：荧光定量PCR检测使用SYBR green PCR试剂盒(Applied Biosystems公司)标记反应产物。分析仪器为Applied biosystems 7500 real time PCR system，使用棉花GhACTIN14(GenBank:AY305733)为内标(郭宝生等，黄萎病菌侵染下陆地棉Dirigent-like蛋白基因表达差异分析，中国农业科学，2014，47(22):4349-4359.)。反应体系： Premix Ex Taq TM 10ul，实施例2合成的相应被测基因的特异上游引物(10pm/ul)、下游引物(10pm/ul)各0.4ul，ROX Reference Dye 0.4ul，灭菌蒸馏水7.8ul，步骤5中合成的cDNA 2ul。RT-PCR反应程序：预变性95℃，30s；95℃，5s，60℃，34s，40个循环。3次技术重复。

[0059] 7)结果分析：利用荧光定量PCR数据采用相对定量2-ΔΔCt法(Bustin S A，Benes V，Nolan T，Pfaffl M W.Quantitative real-time RT-PCR-A perspective.Journal of Molecular Endocrinology，2005,34:597-601.)，以接种侵染0小时待测样品基因相对表达量为基本倍值1，相对表达量倍值2以上即为高表达，相对表达量倍值1以下即为低表达，结果为(见表5、图2、图3)：抗病品种冀79和感病品种TM-1在接菌时间0小时即接种刚开始时多向耐毒性基因和lateral organ boundaries domain family protein转录子2个基因相对表达量是一致的为1，但是随着黄萎病菌侵染时间的推移，2个基因出现表达差异。多向耐毒性基因在抗病品种冀79中随着黄萎病菌侵染时间的推移，表达量呈降低—升高—再降低—再升高的趋势，在48h表达量达最高倍值3.1；而在感病品种TM-1中表达量也呈降低—升高—再降低—再升高的趋势，但一直没有达到倍值2的高表达水平。lateral organ boundaries domain family protein转录子基因在抗病品种冀79中随着黄萎病菌侵染时间的推移，表达量呈降低—升高—再降低—再升高的趋势，但是倍值一直小于1，处于低表达水平；感病品种TM-1中表达量也呈呈先降低—升高—再降低—再升高的趋势，同样在接种48h表达量倍值最高，达8.4的高表达水平。比较多向耐毒性基因和lateral organ boundaries domain family protein转录子基因的表达规律，发现接种48h时抗感品种间的表达倍值差最大(表5)，即多向耐毒性基因在抗病品种冀79与感病品种TM-1中的表达倍值差为2.21，lateral organ boundaries domain family protein转录子基因在抗病品种冀79与感病品种TM-1中的表达倍值差为7.61，所以选择接种48h两个基因的相对表达量倍值作为分析鉴定陆地棉品种抗黄萎病的指标。即抗病和感病的划分标准：利用荧光定量PCR-ΔΔCt数据采用相对定量2 法，在接种黄萎病菌后48h多向耐毒性基因相对表达量倍值大于2和lateral organ boundaries domain family protein转录子相对表达量倍值小于1的判定为抗病品种；在接种黄萎病菌后48h多向耐毒性基因相对表达量倍值小于1和lateral organ boundaries domain family protein转录子相对表达量倍值大于2的判定为感病品种。

[0060] 表5 抗病品种冀79和感病种质TM-1受到黄萎病菌侵染0h-96h时的多向耐毒性基因和lateral organ boundaries domain family protein转录子基因荧光定量表达差异[0061]

[0062] 实施例4、陆地棉品种冀228黄萎病抗性鉴定

[0063] 步骤1)、步骤2)、步骤3)、步骤5)、步骤7同时实施例3

[0064] 步骤4)总RNA提取：分别选取5株步骤3)中病菌接种侵染0小时、48小时植株幼嫩叶片，利用改良的CTAB法(胡根海,喻树迅.利用改良的CTAB法提取棉花叶片总RNA.棉花学报,2007,19(1):69-70.)提取叶片总RNA。将提取的总RNA浓度分别利用超微量核酸蛋白测定仪检测总RNA浓度，并用ddH2O稀释到100ug/ml，零下20℃条件储藏备用。

[0065] 步骤6)多向耐毒性基因和lateral organ boundaries domain family protein转录子以及内参基因GhACTIN14荧光定量PCR特异引物的合成同实施例2。

[0066] 步骤8)结果分析：利用荧光定量PCR数据采用相对定量2-ΔΔCt法分析(见表6、图4)，冀228棉花品种接种黄萎病菌后48h时多向耐毒性基因相对表达量为3.21，大于2，而接种黄萎病菌后48h时lateral organ boundaries domain family protein转录子相对表达量为0.81，小于1，按照实施例3的判断标准，冀228为抗黄萎病品种。

[0067] 表6 冀228品种受黄萎病菌侵染后48小时多向耐毒性基因和lateral organ boundaries domain family protein转录子相对表达量

[0068]

[0069] 实施例5：陆地棉品种冀122黄萎病抗性鉴定

[0070] 步骤8)结果分析：利用荧光定量PCR数据采用相对定量2-ΔΔCt法分析(见表7、图5)，冀122棉花品种接种黄萎病菌后48h时多向耐毒性基因相对表达量为2.98，大于2，而接种黄萎病菌后48h时lateral organ boundaries domain family protein转录子相对表达量为0.95，小于1，按照实施例3的判断标准，冀122为抗黄萎病品种。其余步骤同实施例4。

[0071] 表7 冀122品种受黄萎病菌侵染后48小时多向耐毒性基因和lateral organ boundaries domain family protein转录子相对表达量

[0072]

[0073] 实施例6：陆地棉品种冀1096黄萎病抗性鉴定

[0074] 步骤8)利用荧光定量PCR数据采用相对定量2-ΔΔCt法分析(见表8、图6)，冀1096棉花品种接种黄萎病菌后48h时多向耐毒性基因相对表达量为0.91，小于1，而接种黄萎病菌后48h时lateral organ boundaries domain family protein转录子相对表达量为9.13，大于1，按照实施例3的判断标准，冀1096为感黄萎病品种。其余步骤同实施例4。

[0075] 表8 冀1096品种受黄萎病菌侵染后48小时多向耐毒性基因和lateral organ boundaries domain family protein转录子相对表达量

[0076]

[0077] 实施例7：陆地棉品种邯885黄萎病抗性鉴定

[0078] 步骤8)利用荧光定量PCR数据采用相对定量2-ΔΔCt法分析(见表9、图7)，邯885棉花品种接种黄萎病菌后48h时多向耐毒性基因相对表达量为0.92，小于1，而接种黄萎病菌后48h时lateral organ boundaries domain family protein转录子相对表达量为7.95，大于1，按照实施例3的判断标准，邯885为感黄萎病品种。其余步骤同实施例4。

[0079] 表9 邯885品种受黄萎病菌侵染后48小时多向耐毒性基因和lateral organ boundaries domain family protein转录子相对表达量

[0080]

[0081] 实施例8：陆地棉品种冀1096、邯885、冀228、冀122黄萎病抗性田间鉴定试验[0082] 陆地棉品种冀1096、邯885、冀228、冀122田间黄萎病抗性鉴定试验于2012年-2014年在河北省农林科学院棉花研究所小安舍试验站田间黄萎病圃中进行。所有鉴定品种在4月25日按照4行区在黄萎病病圃中种植，8月20日左右调查棉花黄萎病发病情况。每个区随机选择1行，调查20株，按照4级分级标准进行鉴定评价，然后计算鉴定品种的黄萎病病情指数(病指)。计算公式为：黄萎病病指＝(∑fx)/(n×4)，f为该级别的株数，x为相应级别的值(范围从0到4)，n为调查总株数。根据黄萎病病情指数定性鉴定品种的黄萎病抗性(李社增,马平,Huang H C,等.相对病情指数划分棉花品种抗病性的统计学基础.棉花学报,2003,15(6):344-347.)，即黄萎病指≤20为抗病、20<黄萎病指≤35为耐病、黄萎病指>35为感病，结果见表10：冀228、冀122品种黄萎病指分别为18.33、18.33，均≤20，田间病圃鉴定结果均为抗病，而冀1096、邯885品种黄萎病指分别为55、61.25，均>35，田间病圃鉴定结果均为感病。本发明与田间黄萎病圃鉴定结果完全一致，表明本发明的鉴定结果准确度达到100％。

[0083] 表10 陆地棉品种冀1096、邯885、冀228、冀122田间黄萎病抗性鉴定[0084]

[0085]

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